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抗体fc融合蛋白研发策略及应用

中华微生物学和免疫学杂志 2019年第7期39卷 551-557页

作者：赵芳圆王健国药中生生物技术研究院有限公司第四研究室北京101111

单克隆抗体(简称单抗)作为治疗性生物制品中发展最为迅速的一类药物,已广泛应用于多种疾病治疗。虽然抗体在临床上显示了其巨大的应用价值,但人类疾病的广度和复杂性督促我们不断寻求新作用方式的新型药物,避免仅仅局限于单抗这一类蛋... 详细信息

单克隆抗体(简称单抗)作为治疗性生物制品中发展最为迅速的一类药物,已广泛应用于多种疾病治疗。虽然抗体在临床上显示了其巨大的应用价值,但人类疾病的广度和复杂性督促我们不断寻求新作用方式的新型药物,避免仅仅局限于单抗这一类蛋白质药物。这其中,抗体fc融合蛋白药物正成为新的研发热点,并且在众多人类疾病治疗方面都显示出巨大的临床应用前景。目前已上市的抗体fc融合蛋白通常以受体和配体间的相互作用为主要设计策略,进而开发出更加安全且有效的临床药物。本文将对抗体fc融合蛋白配受体间相互作用这一药物设计策略以及应用进行探讨。

关键词： fc融合蛋白蛋白质药物设计策略

人sTNFR II-IgG fc融合蛋白在毕赤酵母菌中的表达及其产物分析

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第6期23卷 515-519页

作者：张义浜施立楠唱韶红巩新熊凌霜吴军军事医学科学院生物工程研究所北京100071

目的：在毕赤酵母菌中表达sTNFR Ⅱ-IgG fc融合蛋白.检测融合蛋白是否形成二聚体,并对其N-糖链进行分析.方法：从人淋巴细胞中提取总RNA, 经RT-PCR扩增目的基因sTNFRⅡ与IgG fc, 然后利用重叠延伸PCR得到嵌合体基因sTNFRⅡ-IgG F... 详细信息

目的：在毕赤酵母菌中表达sTNFR Ⅱ-IgG fc融合蛋白.检测融合蛋白是否形成二聚体,并对其N-糖链进行分析.方法：从人淋巴细胞中提取总RNA, 经RT-PCR扩增目的基因sTNFRⅡ与IgG fc, 然后利用重叠延伸PCR得到嵌合体基因sTNFRⅡ-IgG fc, 并将其插入pPIC9载体中.以重组载体转化巴斯德毕赤酵母菌中进行克隆与表达.采用ELISA筛选高表达sTNFRⅡ-IgG fc融合蛋白的重组毕赤酵母菌株, 对融合蛋白通过还原和非还原SDS-PAGE分析其二聚体结构, 采用L929细胞检测融合蛋白抗TNF-α的生物学活性, 最后利用荧光辅助糖电泳（FACE）分析融合蛋白的N-糖链.结果：成功地建立了可分泌表达sTNFR Ⅱ-IgG fc融合蛋白的重组酵母菌株, 摇瓶培养后融合蛋白的表达量为2 mg/***-PAGE和Western blot表明, 该融合蛋白能自然形成二聚体结构; 可抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用, 其中和5×10^4 U/L TNF-α的EC50为170 μg/***分析融合蛋白N-糖链的大小为11 ～13个糖残基.结论：在毕赤酵母菌中成功地表达了sTNFR Ⅱ-IgG fc融合蛋白, 为在毕赤酵母菌中表达其他的fc融合蛋白和抗体提供了参考.

关键词：人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ fc融合蛋白巴斯德毕赤酵母菌荧光辅助糖电泳

rhLFA-3:fc融合蛋白连续静脉注射对食蟹猴长期毒性实验研究

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中国新药杂志 2013年第10期22卷 1157-1165页

作者：张晓芳佘佳红李先平陆国才张晓冬姜华陈黛影戴益民张淑英袁伯俊第二军医大学药物安全性评价中心上海200433 上海张江生物技术有限公司抗体药物与靶向治疗国家重点实验室上海200433

目的:评价食蟹猴静脉注射重复给予rhLFA-3:fc融合蛋白的安全性。方法:将食蟹猴随机分为溶媒对照组,rhLFA-3:fc融合蛋白低、中和高剂量组(1,5和20 ***-1),每组6只,静脉注射给药,每周2次,连续90 d,恢复期180 d,进行各项毒理学指标检测。结... 详细信息

目的:评价食蟹猴静脉注射重复给予rhLFA-3:fc融合蛋白的安全性。方法:将食蟹猴随机分为溶媒对照组,rhLFA-3:fc融合蛋白低、中和高剂量组(1,5和20 ***-1),每组6只,静脉注射给药,每周2次,连续90 d,恢复期180 d,进行各项毒理学指标检测。结果:rhLFA-3:fc融合蛋白使各剂量组食蟹猴外周血淋巴细胞比例下降,各剂量组动物给药后免疫学指标发生一定改变,表现为CD2+,CD3+,CD4+及CD8+淋巴细胞下降,发生迟发性变态反应的动物数及反应强度降低。给药组部分食蟹猴脾脏的绝对重量和相对重量偏大,而恢复期时未发现类似情况。组织病理学结果提示rhLFA-3:fc融合蛋白的靶器官为脾脏和淋巴结,表现为脾脏淋巴滤泡及淋巴结皮质区以次级淋巴滤泡结构为主,大多生发中心明显肥大,B淋巴细胞增生活跃,核分裂像相对数量较多。其余指标包括一般症状、体重、摄食量、呼吸、体温、瞳孔、尿液、心电图、生化指标、骨髓象等未见明显与供试品相关的异常。结论:rhLFA-3:fc融合蛋白iv 90 d(每周2次)毒性作用位点为免疫系统,靶器官为脾脏和淋巴结。rhLFA-3:fc融合蛋白iv对食蟹猴的安全剂量为20 ***-1。建议临床使用时应密切注意rhLFA-3:fc融合蛋白对免疫系统的影响。

关键词： rhLFA-3 fc融合蛋白食蟹猴临床前安全性毒性

p75NTR-fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达、鉴定和活性分析

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中国生物化学与分子生物学报 2004年第5期20卷 604-609页

作者：周素芳王欣陈虹黄秉仁广西医科大学生化教研室中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所国家医学分子生物学重点实验室北京100005

为在酵母细胞中表达出具有生物活性的p75NTR fc融合蛋白 ,采用PCR方法分别扩增α因子 (α factor)和p75NTR fc基因 ,经重叠PCR ,获得α factor p75NTR fc基因 .DNA序列分析该融合基因后 ,插入pAO815载体并构建串联多拷贝表达载体pAO815... 详细信息

为在酵母细胞中表达出具有生物活性的p75NTR fc融合蛋白 ,采用PCR方法分别扩增α因子 (α factor)和p75NTR fc基因 ,经重叠PCR ,获得α factor p75NTR fc基因 .DNA序列分析该融合基因后 ,插入pAO815载体并构建串联多拷贝表达载体pAO815 3α factor p75NTR fc .重组质粒电转化酵母GS115细胞后摇瓶培养 ,1%甲醇诱导表达的融合蛋白经ProteinA亲和层析和SephadexG 10 0纯化 ,Western印迹、N末端测序进行蛋白质鉴定 ,ELISA及细胞培养进行生物活性分析 .SDS PAGE分析显示 ,表达产物以可溶性分子形式存在于培养上清中 ,诱导第 4d的表达量最高 ,占上清总蛋白 6 0 %以上 ,ProteinA纯化后有 2条蛋白带 ,免疫印迹分析这 2条蛋白带均能和抗p75及抗IgG抗体结合 ,N末端序列测定证实 1条为完整p75NTR fc ,1条为其蛋白酶降解带 .ELISA等分析表明 ,p75NTR fc能与NGF结合 ,p75NTR fc能抑制NGF对PC12细胞的分化作用 .

关键词：神经生长因子低亲和力受体 fc融合蛋白基因表达毕赤酵母

半乳糖流加对CHO细胞生长代谢及其表达的fc融合蛋白糖基化的影响

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生物技术通报 2019年第8期35卷 138-145页

作者：肖政范里谭文松华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室

旨在深入认识补料分批培养过程中,以半乳糖替代葡萄糖作为碳源,对CHO细胞生长、代谢和产物表达的影响。通过将补料培养基中的葡萄糖用等摩尔的半乳糖进行替换,综合考察了不同比例替换条件下CHO细胞的生长代谢和fc融合蛋白的产物合成特... 详细信息

旨在深入认识补料分批培养过程中,以半乳糖替代葡萄糖作为碳源,对CHO细胞生长、代谢和产物表达的影响。通过将补料培养基中的葡萄糖用等摩尔的半乳糖进行替换,综合考察了不同比例替换条件下CHO细胞的生长代谢和fc融合蛋白的产物合成特性。结果显示:摇瓶的数据表明60%比例以上半乳糖的替代对细胞的生长造成了不利影响,培养后期的pH出现了大幅上升。同时随着半乳糖替代比例的增加,虽然代谢副产物乳酸的浓度有明显下降,但氨的生成却显著增多;此外,培养过程中谷氨酸和丙氨酸的浓度也随着替代比例的增加而增加。产物表达方面,在较低替代比例内(0%-40%),fc融合蛋白的表达量和总唾液酸含量都随着替代比例的增加而升高,而随着替代比例的进一步升高(60%-100%),两者都逐渐降低。最后,在反应器内通过对培养pH的稳定控制,40%半乳糖替代过程的产物表达量和总唾液酸含量分别提高了43%和37%。补料培养基中以半乳糖替代葡萄糖进行补料的方式,有效地提高了最终fc融合蛋白的表达量和总唾液酸含量,有助于建立高产高质的CHO细胞培养过程。

关键词：半乳糖细胞代谢糖基化 fc融合蛋白

炭疽毒素受体ATRcDNA的合成和克隆及ATR-fc融合蛋白的真核表达载体的构建

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中国生物工程杂志 2005年第12期25卷 1-8页

作者：胡显文高丽华陈薇徐俊杰赵剑陈惠鹏军事医学科学院生物工程研究所北京100071 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

可溶性炭疽毒素受体(sATR)可以特异性结合炭疽毒素保护抗原(PA),为获得用于中和炭疽毒素以防治炭疽感染的候选抗毒素药物,构建了表达ATRfc抗体样分子融合蛋白的真核表达载体。将全长为681bp的编码炭疽毒素受体N端1～227氨基酸的基因分... 详细信息

可溶性炭疽毒素受体(sATR)可以特异性结合炭疽毒素保护抗原(PA),为获得用于中和炭疽毒素以防治炭疽感染的候选抗毒素药物,构建了表达ATRfc抗体样分子融合蛋白的真核表达载体。将全长为681bp的编码炭疽毒素受体N端1～227氨基酸的基因分成长约50～60碱基的18个寡核苷酸片段,相邻片段重叠部分为20～22个碱基,利用重叠延伸PCR和引物PCR法,将合成的片段组装与扩增,得到了含有ATR1～227的全部编码区和HindIII、BamHI位点在内的DNA片段。回收的基因片段经BamHI/HindIII双酶切连接到pUC19质粒中,挑选阳性克隆进行酶切鉴定和双向序列测定,获得了全序列正确的克隆。将ATR基因与fc基因连接后插入pcDNA3.1载体多克隆位点HindIII和NotI之间,得到表达ATRfc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1/ATRfc,为利用CHO哺乳动物细胞表达ATRfc并研究其生物学性质奠定了基础。

关键词：炭疽毒素受体 fc融合蛋白基因合成抗毒素

实验设计法在优化表达fc融合蛋白的CHO细胞发酵培养工艺中的应用

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中国生物制品学杂志 2020年第1期33卷 66-70,75页

作者：马动程凡亮刘忠张贵民赵丽丽山东新时代药业哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室

目的通过实验设计(Design of Experiments,DOE)分析优化重组CHO细胞在生物反应器中的培养工艺。方法以2 L生物反应器控制参数温度(T)、pH及溶氧(dissolved oxygen,DO)作为变量,以蛋白表达量、蛋白纯度及蛋白唾液酸含量为响应变量,应用De... 详细信息

目的通过实验设计(Design of Experiments,DOE)分析优化重组CHO细胞在生物反应器中的培养工艺。方法以2 L生物反应器控制参数温度(T)、pH及溶氧(dissolved oxygen,DO)作为变量,以蛋白表达量、蛋白纯度及蛋白唾液酸含量为响应变量,应用Design Expert 10软件进行3因素2水平DOE拟合分析,筛选最适表达fc融合蛋白的CHO细胞发酵培养工艺参数,并采用5 L生物反应器进行验证。结果蛋白表达量仅与T有关,且呈成正相关,pH和DO对其无显著影响,T与pH对其有交互作用;蛋白纯度受T和pH影响显著,T呈负相关,pH呈正相关,DO对其无显著影响,T与pH对其有交互作用;唾液酸含量受T和pH影响显著,T呈正相关,pH呈负相关,DO对其无显著影响。最适工艺参数确定T为(34±0.5)℃,pH为(7.05±0.02),DO为(45±5)%。采用最适工艺参数的反应器与优化前工艺比较,活细胞密度(viable cell density,VCD)增加;蛋白表达量、蛋白纯度、唾液酸含量分别提高了29.7%、8%和87.9%。结论通过DOE方法快速优化了生物反应器培养表达fc融合蛋白的CHO细胞的工艺参数,在不降低蛋白产量及纯度的前提下,极大提高了融合蛋白唾液酸含量。

关键词：实验设计唾液酸 fc融合蛋白 CHO细胞蛋白纯度

GLP-1-fc融合蛋白在DG44细胞中的表达及其质量分析

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南京工业大学学报（自然科学版） 2017年第6期39卷 74-81页

作者：骆海燕谭婉珑张亚楠洪厚胜南京工业大学生物与制药工程学院江苏南京211800 上海凯茂生物医药有限公司上海201500 南京汇科生物工程设备有限公司江苏南京210009

构建GLP-1-fc蛋白真核表达载体,并在DG44细胞株中实现表达。利用基因工程等方法构建表达GLP-1-fc融合蛋白的重组DG44细胞株,通过甲氨喋呤的加压筛选及有限稀释法挑选出表达量较高的单克隆细胞株,经无血清驯化培养获得悬浮生长的细胞株... 详细信息

构建GLP-1-fc蛋白真核表达载体,并在DG44细胞株中实现表达。利用基因工程等方法构建表达GLP-1-fc融合蛋白的重组DG44细胞株,通过甲氨喋呤的加压筛选及有限稀释法挑选出表达量较高的单克隆细胞株,经无血清驯化培养获得悬浮生长的细胞株。收集发酵培养上清,通过离心、过滤及亲和层析等方法对目的蛋白GLP-1-fc进行分离纯化,并利用Dot blot、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱法、Edman降解等方法进行目的蛋白的质量分析,以建立GLP-1-fc融合蛋白发酵、纯化工艺,探索该融合蛋白的质量检测方法。本实验成功构建了表达GLP-1-fc融合蛋白的重组DG44悬浮型细胞株,通过该工艺流程,GLP-1-fc融合蛋白表达量达到400 mg/L,纯度达95%,分子量约为3.0×10~4。该生产工艺能够获得与理论目标蛋白相一致的、且结构稳定GLP-1-fc融合蛋白,其质量检测方法稳定可靠。

关键词：胰高血糖素样肽-1 fc融合蛋白 DG44细胞株基因表达

重组人生长激素fc融合蛋白工程细胞染色体核型分析

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中国生物制品学杂志 2019年第3期32卷 286-288页

作者：张宇俞露郑全莉刘涵刘云南刘玉林郭胜苍许佳慧王宇长春生物制品研究所有限责任公司细胞因子室吉林长春130012

目的分析重组人生长激素fc融合蛋白工程细胞(rhGH-CHO细胞)染色体核型。方法采用0. 1μg/m L秋水仙碱处理分裂中期的细胞,经固定、染色,制片观察,选取染色体形态及分散度较好的视野拍照。应用Image-ProPlus 6. 0(IPP)软件打开图片,利用... 详细信息

目的分析重组人生长激素fc融合蛋白工程细胞(rhGH-CHO细胞)染色体核型。方法采用0. 1μg/m L秋水仙碱处理分裂中期的细胞,经固定、染色,制片观察,选取染色体形态及分散度较好的视野拍照。应用Image-ProPlus 6. 0(IPP)软件打开图片,利用手动测量工具(manual measurements)随机测量50个2n=22的CHO-k1和rhGH-CHO细胞中染色体长臂和短臂长度,计算各染色体的相对长度(各染色体与最长染色体长度的比值)及短臂/长臂的比值,并绘制染色体核型的B-Spline特征曲线。结果 rhGH-CHO和CHO-k1细胞的染色体数目均为22条,且染色体核型特征曲线一致。结论 rhGH-CHO细胞来源于CHO-k1细胞,且未受其他细胞污染。

关键词：重组人生长激素 fc融合蛋白 CHO-k1细胞染色体核型分析