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牛免疫球蛋白G的体外人源唾液酸化及fc片段的制备

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食品科学 2022年第2期43卷 151-157页

作者：李天慧陈春旭陈贵杰孙怡曾晓雄南京农业大学食品科学技术学院江苏南京210095 安徽科技学院食品工程学院安徽凤阳233100

建立将牛免疫球蛋白G(bovine immunoglobulin G,bIgG)糖链末端N-羟乙酰神经氨酸酶切并连接人源N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)的方法,在实现bIgG转化为人源IgG(human IgG,hIgG)的基础上,研究hIgG可结晶(fc)片段的制备。结果表明:以170 U/mL神经氨酸酶酶切bIgG(4.0 mg/mL)后,通过β-1,4-半乳糖基转移酶和α-2,6-唾液酸转移酶分别转移半乳糖(galactose,Gal)和Neu5Ac残基,可制备增加8.4个Gal残基和42个Neu5Ac残基的hIgG分子。此外,在10.0 mg/mL hIgG、m(木瓜蛋白酶)∶m(hIgG)=0.05、10.0 mmol/L半胱氨酸激活剂、2.0 mmol/L EDTA溶液、pH 7.0条件下,酶解3 h可制得hIgG的较高纯度fc片段,最终hIgG得率为71.7%,fc片段得率为20.8%。本研究为bIgG的产品开发和营养价值评价提供科学依据。

关键词：牛免疫球蛋白G fc片段体外糖基化唾液酸

人免疫球蛋白G酶解制备Fab和fc片段及其分离纯化

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化工学报 2013年第5期64卷 1750-1756页

作者：唐思远林东强童红飞姚善泾化学工程联合国家重点实验室浙江大学化学工程与生物工程学系浙江杭州310027

为了制备抗体Fab和fc片段,采用木瓜蛋白酶酶解人免疫球蛋白G(IgG),通过优化酶解条件和色谱法分离过程,得到了纯度较高的Fab片段和fc片段。考察了酶解pH、酶加入量、添加半胱氨酸和酶解时间等对IgG酶解过程的影响,优化了酶解条件,提高酶... 详细信息

为了制备抗体Fab和fc片段,采用木瓜蛋白酶酶解人免疫球蛋白G(IgG),通过优化酶解条件和色谱法分离过程,得到了纯度较高的Fab片段和fc片段。考察了酶解pH、酶加入量、添加半胱氨酸和酶解时间等对IgG酶解过程的影响,优化了酶解条件,提高酶解效率,IgG转化率大于98%。酶解产物通过Protein A亲和色谱法和DEAE阴离子交换色谱法进行了纯化,分离得到fc片段和Fab片段,收率分别为72.6%和40.1%。经SEC-HPLC分析,fc片段纯度达95.7%,Fab片段纯度达96.6%。

关键词：人免疫球蛋白G fc片段 Fab片段木瓜蛋白酶亲和色谱法离子交换色谱法

靶标替换消减SELEX技术筛选小鼠IgG fc片段的DNA配基及其活性鉴定

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兰州大学学报（自然科学版） 2011年第1期47卷 66-72页

作者：陈桦葛廷王小琦廖世奇马瑾王黎庞鑫张宁张丽琼张洁瑜王晓清兰州大学生命科学学院兰州730000 兰州理工大学生命科学学院兰州730050 甘肃省医学科学研究院兰州730050

建立高特异性和亲和力的小鼠IgGfc片段DNA配基筛选方法.采用几种小鼠IgG亚类(鼠抗HBV-IgG、小鼠IgG的fc,IgG1,IgG2a)作为靶分子,利用靶标替换消减SELEX筛选方法进行16轮筛选.利用dot-blot,高压液相色谱以及凝胶阻滞(EMSA)方法对所得配... 详细信息

建立高特异性和亲和力的小鼠IgGfc片段DNA配基筛选方法.采用几种小鼠IgG亚类(鼠抗HBV-IgG、小鼠IgG的fc,IgG1,IgG2a)作为靶分子,利用靶标替换消减SELEX筛选方法进行16轮筛选.利用dot-blot,高压液相色谱以及凝胶阻滞(EMSA)方法对所得配基进行活性鉴定.经过16轮筛选,得到了与小鼠IgG不同亚类相同fc片段特异性结合的寡核苷酸配基(IgG的fc配基).特异性分析显示,此配基只与小鼠IgG特异性结合,与胰蛋白酶、小牛血清白蛋白、人血清均无明显结合.高压液相色谱和凝胶阻滞结果均说明了配基和靶蛋白具有特异结合.通过使用靶标替换消减SELEX技术可以有效得到小鼠IgG不同亚型相同部分fc片段的特异性结合配基,为不同分子相同部位的分子作用机制,以及应用于小鼠抗体亲和层析的研究奠定基础.

关键词：靶标替换 SELEX DNA配基小鼠IgG fc片段特异性

静注人免疫球蛋白fc片段唾液酸化及其抗炎活性的初步研究

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静注人免疫球蛋白Fc片段唾液酸化及其抗炎活性的初步研究

作者：张贤达北京协和医学院

学位级别：硕士

背景：静注人免疫球蛋白（Intravenous immunoglobulin,IVIg）是从上千个健康献血者血浆中分离提取的免疫球蛋白混合物,包含约107种广谱抗体。IVIg最初主要用于治疗先天性免疫缺陷疾病,近三十年其在自身免疫性疾病和炎症疾病的治疗中的... 详细信息

背景：静注人免疫球蛋白（Intravenous immunoglobulin,IVIg）是从上千个健康献血者血浆中分离提取的免疫球蛋白混合物,包含约107种广谱抗体。IVIg最初主要用于治疗先天性免疫缺陷疾病,近三十年其在自身免疫性疾病和炎症疾病的治疗中的发挥着越来越重要的抗炎活性。近年来有一些研究认为其发挥抗炎活性的关键与其抗体可结晶段（Fragment crystallizable,fc）糖链的唾液酸化程度密切相关,高唾液酸化的IVIg及其fc片段在小鼠关节炎模型及免疫性血小板减少性紫癜等模型中表现出较高的抗炎活性：目前关于此方面的研究还存在争议,而国内尚无关于IVIg唾液酸化及其抗炎活性机制的研究报道。目的：明确国内主要血液制品厂家IVIg的唾液酸含量;制备高唾液酸化的fc片段及高唾液酸化的IVIg;验证IVIg及fc片段的抗炎活性是否与其唾液酸化程度有关。方法：1.分别建立分光光度法及高效液相-荧光检测法两种适合IVIg产品唾液酸含量测定的方法,比较国内厂家的IVIg唾液酸含量的差异。2.通过木瓜蛋白酶酶切IVIg,蛋白G柱、分子筛柱两步柱纯化,获取fc片段;利用西洋接骨木凝集素,富集唾液酸含量较高的IVIg和fc片段;通过蛋白电泳及免疫印迹分析制备产物的纯度和抗体结构。3.建立THP-1细胞炎症模型,验证上述制备的高唾液酸化的IVIg和高唾液酸化的fc组分的抑制炎症因子分泌的能力,比较其抗炎活性与唾液酸化程度的关系。成果：1.建立的两种唾液酸含量的测定方法均可以应用于与本试验对IVIg及fc片段的测定;两种方法各有不同优劣之处;国内厂家的IVIg制品唾液酸糖基含量范围在2.75-4.52μg/mg IgG,约合每分子IgG含有1.42-2.34个唾液酸糖基,部分厂家之间存在显著性差异。2.蛋白电泳及免疫印迹分析显示,通过多步骤纯化制备的高唾液酸化的fc片段具有良好的纯度和抗体活性。3.在诱导的THP-1细胞炎症模型中,1 mg/mL培养终浓度的IVIg具有良好的抑制两种炎症因子TNF-α、IL-6分泌的能力;高唾液酸化的IVIg及fc片段相比于同浓度未富集唾液酸的IVIg和fc片段显示高出2-5倍不等的抑制炎症因子分泌的能力;结论：国内主要厂家IVIg制品唾液酸含量在2.75-4.52μg/mg IgG之间,部分厂家的制品唾液酸含量存在显著性差异。IVIg在THP-1细胞诱导的炎症模型中具有较好的抗炎活性,高唾液酸化的IVIg和fc片段具有更强的抗炎活性,并且其抗炎活性与其fc片段的唾液酸化程度有关。

关键词：静注人免疫球蛋白唾液酸 fc片段抗炎活性

人免疫球蛋白G的Fab和fc片段制备及层析分离研究

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人免疫球蛋白G的Fab和Fc片段制备及层析分离研究

作者：唐思远浙江大学

学位级别：硕士

人免疫球蛋白G（hIgG）在木瓜蛋白酶的作用下降解为Fab片段和fc片段,相较于完整的抗体,抗体片段在生理和临床上有许多独特的意义。此外,探讨不同抗体片断与层析介质间的相互作用,也能为抗体分离纯化优化和新型配基设计提供实验依据。本... 详细信息

人免疫球蛋白G（hIgG）在木瓜蛋白酶的作用下降解为Fab片段和fc片段,相较于完整的抗体,抗体片段在生理和临床上有许多独特的意义。此外,探讨不同抗体片断与层析介质间的相互作用,也能为抗体分离纯化优化和新型配基设计提供实验依据。本论文从抗体片段的制备入手,研究不同混合模式层析介质对抗体片段的吸附情况,探讨抗体片段分离纯化新方法。主要结果如下：首先优化了木瓜蛋白酶降解血清来源人免疫球蛋白G的酶解条件,并制备了Fab和fc片段。通过调节酶解反应pH、酶加入量、半胱氨酸加入量以及酶解反应时间等,优化酶解反应过程,得到Fab和fc片段含量较高的酶解液。酶解优化条件为：101ng/ml hIgG、0.5mg/ml木瓜蛋白酶、10mmM半胱氨酸、2rnM EDTA,pH7.6,酶解时间4h,hIgG的酶解转化率达到98%以上,并且杂片段含量较少。酶解液通过Protein A亲和层析和DEAE阴离子交换层析两步法纯化,得到Fab片段纯度96.6%,收率为40.1%,fc片段纯度95.7%,收率为72.6%。利用自制的抗体Fab片段和fc片段,考察了MEP HyperCel、 Capto adhere和Toyopearl MX-Trp-650M三种混合模式层析介质对抗体片段的吸附情况,发现阴子离交换型混合模式介质Capto adhere对两种片段有一定的选择性,在pH7-pH8附近对fc片段的吸附能力要显著强于Fab片段。MEP HyperCel介质和Toyopearl MX-Trp-650M介质对两种片段的吸附在不同pH下差异均不大。结合优化的酶解条件以及混合模式层析对Fab片段和fc片段的吸附差异,选用Capto adhere介质,在pH7.5下对酶解液进行层析分离,并通过Protein A亲和层析检测组分含量。发现fc片段几乎完全被Capto adhere介质捕获,穿透峰仅含Fab片段,实现了抗体片段的有效分离。本文优化了木瓜蛋白酶酶解人免疫球蛋白G的酶解条件,采用Protein A亲和层析和DEAE阴离子交换层析两步法制备了较高纯度的Fab片段和fc片段,考察了混合模式层析介质对两种片段的吸附差异,并实现了混合模式层析分离抗体片段。研究结果有助于开发抗体片段制备的新工艺,以及探讨混合模式层析分离抗体的机制研究和配基优化设计。

关键词：人免疫球蛋白G Fab片段 fc片段亲和层析离子交换层析混合模式层析

体外糖基化牛免疫球蛋白G及fc片段的制备、调节肠道菌群作用与抗炎活性的研究

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体外糖基化牛免疫球蛋白G及Fc片段的制备、调节肠道菌群作用与抗...

作者：李天慧南京农业大学

学位级别：硕士

免疫球蛋白G(ImmunoglobulinG,IgG)作为一种具有免疫功能的抗体,在牛初乳中广泛存在,同时也是血液中主要的抗体之一。其主要功能是负责识别,中和以及消除病原体和有毒有害的抗原。然而唾液酸化IgG被证实有抗炎症活性,在类风湿性关节炎... 详细信息

免疫球蛋白G(ImmunoglobulinG,IgG)作为一种具有免疫功能的抗体,在牛初乳中广泛存在,同时也是血液中主要的抗体之一。其主要功能是负责识别,中和以及消除病原体和有毒有害的抗原。然而唾液酸化IgG被证实有抗炎症活性,在类风湿性关节炎和血小板减少性紫癜(ITP)模型中都起到了良好的缓解症状的作用。此外,唾液酸化IgG还具有一定的调节肠道菌群的功能。在我们之前的研究中,已经实现了通过层层自组装的方式制成蛋白-多酚IgG微胶囊,使得IgG能够通过口服的方式完整地进入结肠,这为之后研讨bIgGs(NG、SG、GG、Gfc)对肠道微生物影响的工作奠定了基础。为了避免牛免疫球蛋白G(bIgG)中N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)潜在的导致慢性炎症和癌症的危害,本文探究了在bIgG糖链末端N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)酶切并连接人源N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的方法,在实现bIgG的人源唾液酸化的基础上探讨可结晶片段(fc)的制备方法,并利用LPS刺激RAW264.7细胞系的炎症模型研究上述IgG及其fc片段的抗炎症活性;采用健康志愿者肠道菌群的厌氧发酵模型,研究上述体外糖基化IgG及其fc片段对肠道菌群结构的影响。本论文的主要研究内容如下:1.牛免疫球蛋白G的体外糖基化及fc片段的制备本研究采用体外糖基化的手段制备了人源唾液酸化bIgG,首先使用优化的神经氨酸酶水解条件将bIgG的Neu5Gc残基酶解,避免了这种非人源唾液酸形式的潜在危害,然后利用B4GALT1和ST6GAL1两种糖基转移酶将半乳糖和Neu5Ac转移至bIgG,并经过对木瓜蛋白酶酶解体外糖基化bIgG(GG)条件的优化与选择,制备了 GG的fc片段,经条件优化确定采用10 mg/mL GG、0.05 mg木瓜蛋白酶/mg GG、10 mM半胱氨酸激活剂、2 mM EDTA溶液、pH 7.0的条件下bIgG酶解3 h可制备GG的Gfc片段,最终所得体外糖基化bIgG得率为71.7%,fc片段得率为20.8%。通过UHPLC-MS分析,结果表明与数据库中最匹配的被末端唾液酸修饰的N-聚糖的唾液酸形式为Neu5Ac。本研究有助于为动物源食品人源化模拟产品的开发利用和动物源产品的营养价值评价。2.体外糖基化IgG及其fc片段在体外厌氧发酵中对肠道菌群的影响在本节的研究中,我们首先制备了 NG、SG样品,其次我们采用体外厌氧发酵的模型,研究了 bIgGs对肠道菌群的影响。结果表明,bIgGs能够在一定程度上维持肠道微生物的多样性,调节肠道菌群结构;相比于BLK组,GG、SG、Gfc和NG组都能够显著提高Megamonas和Lachnospiraceaenclassified的相对丰度,且显著降低Bacteroides、Parasutterella 和 Dialister 的相对丰度,GG、Gfc 能够显著降低 Bilophila和Escherichia-Shigella,而SG的Parabacteroides属的相对丰度在bIgGs样品组中最低;且SG样品能够显著性增加乙酸、丙酸和正丁酸的含量。3.体外糖基化IgG及其fc片段的抗炎症活性本节实验通过建立LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞的炎症模型,研究了唾液酸化IgG的抗炎症活性。结果表明,SG、GG和Gfc样品对NO的释放有一定的抑制作用,但SG对炎症因子和炎症有关基因的mRNA表达水平抑制作用有限。GG与Gfc能够以一定的浓度依赖性方式降低IL-6和TNF-α的产生,这与IL-6和TNF-α基因的转录抑制作用有关,GG还能显著抑制IL-1β mRNA水平的表达。此外,GG与Gfc能在一定程度上抑制COX-2和iNOS在mRNA水平上的表达,综合来看,GG的抗炎活性最明显。

关键词：牛免疫球蛋白G(bIgG) fc片段体外糖基化唾液酸抗炎症肠道微生物

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抗体fc片段纤维素膜的制备及其应用

抗体Fc片段纤维素膜的制备及其应用

作者：张郑华大连理工大学

学位级别：硕士

蛋白A(Protien A)是某些金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白,根据其可以和人及一些哺乳动物血清中免疫球蛋白的fc片段特异性结合的特点,已经被应用于抗体的纯化和自身免疫性疾病的治疗。获得大量高纯度、高生物活性的Protein A或类Protein A功能... 详细信息

蛋白A(Protien A)是某些金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白,根据其可以和人及一些哺乳动物血清中免疫球蛋白的fc片段特异性结合的特点,已经被应用于抗体的纯化和自身免疫性疾病的治疗。获得大量高纯度、高生物活性的Protein A或类Protein A功能的小分子是其中的关键问题之一,为了达到这一目的,本论文制备了偶联有fc片段的纤维素膜,并研究了利用该亲和膜进行重组Protein A纯化和筛选分子簇结构仿生小分子亲和配基的可行性。主要结果如下：1.优化了通过木瓜酶酶解IgG获得fc片段的条件,最优条件为37℃,pH 7.5,酶解2 h,酶与底物比为480 U/mg。并利用Protein A亲和层析柱从酶解混合物分离纯化得到fc片段。2.研究了偶联fc片段的纤维素膜的制备过程。确定较优的NaIO4氧化条件为pH 5的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液,NaIO4浓度为0.2 mol/L,氧化时间控制15 min。依次偶联间隔臂己二胺和戊二醛,最后将fc片段固定到活化后的纤维素膜上,该亲和膜fc片段的固定量为11.75 mg/g。3.偶联fc片段的纤维素膜对Protein A的静态饱和吸附量为8.22 mg/g,动态吸附容量为6.84 mg/g;该膜对大肠杆菌细胞破碎液中重组Protein A具有良好的选择性,吸附容量为5.38 mg/g,亲和膜重复使用8次,其动态吸附量基本没有变化;可以将其用于重组Protein A的分离纯化。4.以固定化抗体fc片段纤维素膜为筛选平台,利用壳聚糖作为分子簇的结构基础,以酪胺为模式分子评价了分子簇结构在小分子亲和配基的筛选中所能起到的作用。结果表明,壳聚糖-酪胺同单独的壳聚糖、酪胺相比,与抗体fc片段纤维素膜的吸附作用更强,每个固定的fc分子平均可以吸附31.1个功能基团,是fc能结合溶液游离态酪胺分子的11.6倍,验证了这种筛选模式用于固定化蛋白筛选小分子亲和配基的可行性。总之,以上结果说明抗体fc片段纤维素膜可以应用于rProtein A的分离纯化及仿生的分子簇结构的小分子亲和配基的筛选。

关键词： fc片段亲和膜 rProteinA 纯化功能基

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抗体fc片段的离子交换法制备和印渍法鉴定

皖南医学院学报 1993年第4期12卷 255-258页

作者：陈文魁皖南医学院寄生虫学教研室

免疫球蛋白经羧甲基纤维素(CM22)柱交换,并用增加盐浓度分段洗脱,可分得4个蛋白峰。其中,用0.1M醋酸钠缓冲液洗脱出的3个蛋白峰具fc性质,而用0.225M醋酸钠缓冲液洗脱的蛋白质不与葡萄球菌A蛋白(SPA)相结合。将具fc性质的组分合并,由木... 详细信息

免疫球蛋白经羧甲基纤维素(CM22)柱交换,并用增加盐浓度分段洗脱,可分得4个蛋白峰。其中,用0.1M醋酸钠缓冲液洗脱出的3个蛋白峰具fc性质,而用0.225M醋酸钠缓冲液洗脱的蛋白质不与葡萄球菌A蛋白(SPA)相结合。将具fc性质的组分合并,由木瓜蛋白酶消化后,各蛋白质片段再经CM22柱分段洗脱,得到5个蛋白峰。分离出的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至滤膜上。膜上各蛋白质用SPA-HRP探针作酶分析,从而鉴定IgG的fc片段。实验提示,0.225M醋酸钠缓冲液洗脱出的蛋白蜂是抗体fc片段。

关键词：印渍法离子交换抗体 fc片段

IgA_α重链fc片段单克隆抗体的制备及临床应用

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上海医科大学学报 1988年第5期 326-330页

作者：严佩华何球藻吴惠芳孙瑞霞郑秀娟赵蒂勋上海医科大学中山医院上海医科大学中山医院上海医科大学中山医院基础医学部免疫学教研室

我们自一例α重链病患者血清纯化蛋白,取得IgAα重链fc片段（IgAfcα）抗原,按常规免疫趾BALb/C小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经有限稀释,克隆后获得D2、E4、F5、G（10） 4株阳性细胞。接种BALb/C小鼠后获得4株抗IgA fcα... 详细信息

我们自一例α重链病患者血清纯化蛋白,取得IgAα重链fc片段（IgAfcα）抗原,按常规免疫趾BALb/C小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经有限稀释,克隆后获得D2、E4、F5、G（10） 4株阳性细胞。接种BALb/C小鼠后获得4株抗IgA fcα单克隆IgA fcα而与IgG、IgM、IgDA、K或λ均无反应。将该抗体对95名正常人和63例各种疾病患者的血清标本,以血凝抑制试验（HAI）进行Ig基因标记测定,并对3例阳性者作家谱调查,结果表明此McAb-IgA fcα可用以检测IgA同种异型Ig遗传标记。

关键词：免疫球蛋白A α链 fc片段单克隆抗体同种异型