检索结果-南通市图书馆

作者：宋晓妮南方医科大学

学位级别：硕士

过敏性疾病是一种常见疾病,其临床表现有很多种,包括过敏性哮喘、过敏性休克、过敏性紫癜、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等。过敏性疾病是由Ⅰ型超敏反应引起的,其主要中间物质为IgE及其高亲和力受体(fcεrⅠ)。过敏原第一次侵入机体,可以诱... 详细信息

过敏性疾病是一种常见疾病,其临床表现有很多种,包括过敏性哮喘、过敏性休克、过敏性紫癜、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等。过敏性疾病是由Ⅰ型超敏反应引起的,其主要中间物质为IgE及其高亲和力受体(fcεrⅠ)。过敏原第一次侵入机体,可以诱导B淋巴细胞产生抗原特异性IgE,IgE与靶细胞表面的高亲和力受体结合以后,当相同抗原再次侵入机体时,就可以引发靶细胞内的一系列信号转导,使靶细胞释放组胺等生物活性物质,引起过敏性炎症反应。因此,IgE高亲和力受体是引起过敏性疾病的关键物质,也是本研究的重点对象。引起Ⅰ型超敏反应的物质称为过敏原,我们生活中的一些高蛋白食物、屋尘、花粉、真菌、人与动物皮毛、羽毛、昆虫、寄生虫、药物及其他化学物质等都可作为过敏原,通过吸入、食入、注射或接触使机体致敏。过敏原侵入机体后,鼻咽、扁桃体、支气管、胃肠粘膜等处固有层的浆细胞产生抗原特异性IgE,IgE通过与嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的IgE高亲和力受体(fcεrⅠ)结合,使靶细胞处于致敏状态。 fcεrⅠ是一种由多个亚单位组成的膜糖蛋白,其α亚基分为细胞外区、跨膜区、胞质区三个部分,通过细胞外区的结合位点与IgE结合,是引发过敏反应的首要步骤。α亚基的细胞外区由2个免疫球蛋白样结构(D1、D2)组成,而靠近膜的环状结构是与IgE的fc段结合的主要部位。α亚基与IgE直接结合的面由D1-D2接口的顶端(即“色氨酸脊”)以及D2域的近接口一侧所组成。fcεrⅠα链结合在IgE fc段的2个CH3的顶端,且靠近fc段的对称轴,锲入fc段的两条链之间。fcεrⅠα链与2个CH3均有CH2-CH3接头(linker)的残基在受体的顶端形成1个不对称的拱形结构。当特异性抗原与靶细胞上两个以上的IgE分子结合,通过桥联反应,使两个以上的IgE分子靠近并发生构型改变。然后,交联的fcεrⅠ可激活两种胞浆内蛋白激酶(Lyn和Syk),使之磷酸化而激活。最后,接头蛋白和GTP交换因子/GTP酶诱导胞内贮存的Ca释放。后者再促进细胞脱颗粒、释放血管活性物质及某些酶类,即可出现过敏反应。fcεrⅠ主要表达于嗜碱性粒细胞和肥大细胞,在嗜酸性粒细胞、单核细胞以及血小板表面也有分布,但量较前两种少的多。通过对fcεrⅰα亚基基因的研究发现,人体嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面fcεrⅰα亚基的表达受多个转录因子的调节且其C端的表达受体内IgE的影响。***从肥大细胞系KU812提取mrNA逆转录得到的cDNA进行了α亚基氨基酸序列的预测,证实,虽然α亚基含有7个N链的糖基化位点,影响受体的分泌和稳定性,但这些糖基化位点对α链的正确折叠是非必须的,且不影响其与IgE的结合。这些为我们重组表达fcεrⅰα亚基细胞外区段提供了有力的支持。单独的α链胞外区可溶性蛋白可与IgE高亲和力结合。Dvid D等发现,去除小鼠的α亚基后,小鼠因不能表达完整的fcεrⅠ而不会发生IgE介导的Ⅰ型超敏反应。国外对过敏性疾病的研究由来已久,利用抗IgE单克隆抗体,或可溶性受体阻断或抑制Ⅰ型超敏反应的发生已成为抗过敏治疗研究的热点,目前已有商品化的抗IgE抗体用于Ⅰ型超敏反应类疾病的治疗,但利用重组人可溶性fcεrⅰα亚基来阻断其与IgE结合的方法尚未在临床上得到运用。国外有研究用哺乳动物细胞和昆虫细胞表达的马fcεrⅰα亚基胞外区可以与马肺泡灌洗液中的IgE结合。孙仁山等也利用重组可溶性fcεrⅰα亚基成功阻断了小鼠被动皮肤过敏反应。鉴于过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞含量比正常人增多,且其表面分布的fcεrⅠ量也多,本研究运用rT-PCr方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞中成功扩增并克隆出fcεrⅰα亚基细胞外区的基因片段fcεrⅠα,将编码基因fcεrⅠα克隆至pET-28a(+)表达载体,并在大肠杆菌中进行了大量非可溶性表达,用亲和层析法纯化重组蛋白后,用透析复性的方法进行蛋白质复性,免疫小鼠制备单克隆抗体,用ELISA、细胞免疫荧光法鉴定单克隆抗体的特性。结果显示,利用rT-PCr技术成功克隆了编码过敏性疾病IgE高亲和力受体fcεrⅰα亚基胞外区的基因,经测序并与GenBank中序列进行比对,结果完全一致,大小为696bp。并且将编码基因克隆到pET-28a(+)原核表达质粒中,经PCr、限制性酶切分析等鉴定,成功构建了fcεrⅠα-pET28a(+)重组原核表达质粒。重组质粒fcεrⅠα-pET28a(+)在大肠杆菌中表达出重组蛋白,经过表达条件的优化,表达产物主要以非可溶性形式存在。重组蛋白分子量约为23.3kDa,与理论值基本符合,表达量约占菌体总蛋白的30%。利用亲和层析法纯化重组蛋白,纯度达1 5%。用Ni亲和层析柱对蛋白进行纯化,表明该蛋白确实是所要表达的His融合蛋白。进一

关键词： fcεrⅰα亚基表达单克隆抗体

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fcεrⅠ受体α亚基的重组表达、单克隆抗体的制备及特异性鉴定

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热带医学杂志 2008年第5期8卷 416-419,F0004页

作者：宋晓妮王穗海曲焕王萍魏伟王文敬董文其南方医科大学生物技术学院生物制药系广州510515

目的通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体fcεrⅰα亚基,并用重组蛋白制备单克隆抗体。方法用rT-PCr的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取fcεrⅠα蛋白基因,经T-A克隆、亚克隆至pET28a(+)原核表达载体,将重组质粒转化到大... 详细信息

目的通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体fcεrⅰα亚基,并用重组蛋白制备单克隆抗体。方法用rT-PCr的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取fcεrⅠα蛋白基因,经T-A克隆、亚克隆至pET28a(+)原核表达载体,将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAr(DE3),IPTG诱导表达fcεrⅰα亚基蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白;并用其免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗fcεrⅰα亚基单克隆抗体,用细胞免疫荧光法对单克隆抗体的特异性进行鉴定。结果成功调取了人IgE高亲和力受体fcεrⅰα亚基的基因,且测序正确;构建原核表达质粒fcεrⅠα-pET28a(+);成功建立4株稳定分泌抗fcεrⅰα亚基的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为G101、C22、G113、G42。通过细胞免疫荧光实验证实,4株单克隆抗体均能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的fcεrⅰα亚基。结论成功利用基因重组技术制备了fcεrⅰα亚基蛋白,制备了4株效价高、特异性好的抗fcεrⅰα亚基单克隆抗体,为fcεrⅰα亚基及其抗体在过敏性疾病中的生物学功能研究奠定了基础。

关键词： IgE fcεrⅰα亚基单克隆抗体

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