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猪肺炎支原体fba蛋白原核克隆表达、免疫原性及活性分析

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猪肺炎支原体FBA蛋白原核克隆表达、免疫原性及活性分析

作者：王世杰山西农业大学

学位级别：硕士

果糖二磷酸醛缩酶(fba)是多种疫苗和药物靶点,猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)的强毒株和弱毒株的fba的表达不同,故研究猪肺炎支原体fba免疫特性对该病的防控有重要的意义。本试验用原核表达系统表达了Mhp蛋白果糖1,6-二磷... 详细信息

果糖二磷酸醛缩酶(fba)是多种疫苗和药物靶点,猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)的强毒株和弱毒株的fba的表达不同,故研究猪肺炎支原体fba免疫特性对该病的防控有重要的意义。本试验用原核表达系统表达了Mhp蛋白果糖1,6-二磷酸-D-醛缩酶(fba)蛋白,并应用该重组蛋白免疫小鼠,利用Mhp全菌蛋白和fba蛋白作为包被抗原对小鼠血清进行ELISA检测,检测了fba抗原性。根据GenBank公布的Mhp fba基因序列,利用软件Primer5.0设计引物并合成,通过PCR扩增目的基因,测序发现864bp含有2个稀有密码子,我们对前段90bp进行基因合成,剩余778bp通过SOE-PCR方法突变连接起来,插入到表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a(+)/fba。将重组质粒pET-28a(+)/fba导入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经1%IPTG诱导表达5h后,蛋白的表达量最高,并用Protino Ni-TED2000Packed Columns进行亲和纯化,得到较纯的目的蛋白。Western-blot结果分析证实原核表达的fba蛋白抗原性良好。本研究将纯化的fba蛋白免疫BALB/c小鼠,以纯化fba蛋白作为抗原,通过间接ELISA方法检测fba蛋白免疫小鼠抗体水平。结果显示,fba蛋白能诱导小鼠产生较高水平抗体,免疫原性较好。以不同毒株全菌蛋白作为抗原,通过间接ELISA方法检测fba蛋白免疫小鼠抗体水平。结果显示,血清中特异性抗体水平较高。以纯化好的蛋白做反应催化酶,进行酶促反应,结果显示,表达纯化蛋白具有醛缩酶活性。综上所述,本研究成功构建了Mhp fba重组菌,表达获得了Mhp重组蛋白fba,该蛋白具有抗原性及醛缩酶活性,从而为进一步研究Mhp致病机理以及建立Mhp血清学诊断方法奠定基础。

关键词：猪肺炎支原体(Mhp) fba蛋白免疫原性醛缩酶

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fba蛋白的原核表达及其免疫效果分析

Fba蛋白的原核表达及其免疫效果分析

河北省免疫学会第5次会员代表暨学术大会

作者：马翠卿魏林李彩虹顾海燕王秀荣河北医科大学免疫教研室

＜正＞【目的】基因工程手段诱导表达并纯化A族链球菌（GAS）表面新发现的fba蛋白,并将fba蛋白免疫小鼠,对其引发的体液免疫应答进行分析。【方法】将本室保存的pGEX4T-2/fba

关键词： A族链球菌(GAS) fba蛋白体液免疫重组疫苗

fba蛋白对化脓性链球菌结合FH和FHL-1的促进作用

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Fba蛋白对化脓性链球菌结合FH和FHL-1的促进作用

河北省免疫学会第5次会员代表暨学术大会

作者：胡洁马翠卿魏林尹晓琳姚智燕河北医科大学免疫教研室

＜正＞【目的】探讨fba蛋白与FH、FHL-1的相互作用关系,为进一步阐明GAS致病机理提供实验依据。【方法】将fba基因片段克隆至自杀载体pFW5,采用电穿孔法将重组质粒pFW5-Δfba转化GAS分离菌,构建fba插入性灭活变异株（fba-株）;ELISA法检... 详细信息

＜正＞【目的】探讨fba蛋白与FH、FHL-1的相互作用关系,为进一步阐明GAS致病机理提供实验依据。【方法】将fba基因片段克隆至自杀载体pFW5,采用电穿孔法将重组质粒pFW5-Δfba转化GAS分离菌,构建fba插入性灭活变异株（fba-株）;ELISA法检测GAS变异株及

关键词：化脓性链球菌(GAS) fba蛋白补体调节蛋白 FH/FHL-1

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fba蛋白的原核表达及其免疫效果分析

Fba蛋白的原核表达及其免疫效果分析

中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议

作者：马翠卿魏林李彩虹顾海燕王秀荣河北医科大学免疫教研室

目的:基因工程手段诱导表达并纯化A族链球菌(GAS)表面新发现的fba蛋白,并将fba蛋白免疫小鼠,对其引发的体液免疫应答进行分析。方法:将本室保存的pGEX4T-2／fba ***21阳性菌株经IPTG诱导表达fba重组蛋白,ELISA和 Western-blot鉴定表达... 详细信息

目的:基因工程手段诱导表达并纯化A族链球菌(GAS)表面新发现的fba蛋白,并将fba蛋白免疫小鼠,对其引发的体液免疫应答进行分析。方法:将本室保存的pGEX4T-2／fba ***21阳性菌株经IPTG诱导表达fba重组蛋白,ELISA和 Western-blot鉴定表达的重组蛋白;将纯化的fba蛋白及M蛋白(本室保存)分别皮下免疫CD1小鼠,同时

关键词： A族链球菌(GAS) fba蛋白体液免疫重组疫苗

fba蛋白对化脓性链球菌结合FH和FHL-1的促进作用

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Fba蛋白对化脓性链球菌结合FH和FHL-1的促进作用

中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议

作者：胡洁马翠卿魏林尹晓琳姚智燕河北医科大学免疫教研室

目的:探讨fba蛋白与FH、FHL-1的相互作用关系,为进一步阐明GAS致病机理提供实验依据。方法:将fba基因片段克隆至自杀载体pFW5,采用电穿孔法将重组质粒pFW5-Δfba转化GAS分离菌, 构建fba插入性灭活变异株(fba-株);ELISA法检测GAS变异株... 详细信息

目的:探讨fba蛋白与FH、FHL-1的相互作用关系,为进一步阐明GAS致病机理提供实验依据。方法:将fba基因片段克隆至自杀载体pFW5,采用电穿孔法将重组质粒pFW5-Δfba转化GAS分离菌, 构建fba插入性灭活变异株(fba-株);ELISA法检测GAS变异株及其亲代培养上清结合FH和FHL-1的情况;免疫印迹法检测GAS株与人血浆混合共同孵育后,结合FH和FHL-1的情况。

关键词：化脓性链球菌(GAS) fba蛋白补体调节蛋白 FH/FHL-1

A族链球菌表面蛋白fba单克隆抗体的制备及其对应表位的初步鉴定

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中国免疫学杂志 2008年第11期24卷 1046-1048,1053页

作者：马翠卿顾海燕郭奕阳胡光磊魏澎魏林河北医科大学免疫教研室石家庄050017

目的:制备抗A组溶血性链球菌(GAS)表面蛋白fba(fibronectin-binding proteins a)的单克隆抗体(mAb),并对单抗的生物学功能及其相应表位进行了初步鉴定。方法:以重组fba蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术及间接ELISA筛选出针对... 详细信息

目的:制备抗A组溶血性链球菌(GAS)表面蛋白fba(fibronectin-binding proteins a)的单克隆抗体(mAb),并对单抗的生物学功能及其相应表位进行了初步鉴定。方法:以重组fba蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术及间接ELISA筛选出针对fba的杂交瘤细胞株,以Western blot鉴定mAb的特异性,并将获得的mAb与fba+GAS和fba-GAS分别行全菌ELISA、与fba的分段表达蛋白行Western blot,初步鉴定mAb针对的表位所在区域。结果:获得了稳定分泌抗fba-mAb的杂交瘤细胞株,其中一株mAb能特异结合天然fba+链球菌,且该单抗针对的表位包含了fba蛋白的第104～108位氨基酸,该位点也是链球菌fba蛋白结合补体调节蛋白FH的位点。结论:成功地制备了抗GAS表面fba蛋白的mAb,其中一株mAb对应的表位为位于菌体表面的天然表位,并检测出了该mAb对应的表位所在区段,这为深入研究GAS的致病机制提供了有力工具。

关键词： A族链球菌 fba蛋白单克隆抗体表位

GAS表面蛋白fba保护性区段的鉴定及其表位的筛选

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GAS表面蛋白Fba保护性区段的鉴定及其表位的筛选

作者：魏澎河北医科大学

学位级别：硕士

目的: A族乙型溶血性链球菌(group A streptococcus, GAS)是链球菌中致病性最强的一种,可长期寄居于人体鼻咽部和肠道中,引起各种化脓性炎症、猩红热、丹毒、新生儿败血症、脑膜炎、产褥热以及链球菌变态反应性疾病等。临床上存在着反... 详细信息

目的: A族乙型溶血性链球菌(group A streptococcus, GAS)是链球菌中致病性最强的一种,可长期寄居于人体鼻咽部和肠道中,引起各种化脓性炎症、猩红热、丹毒、新生儿败血症、脑膜炎、产褥热以及链球菌变态反应性疾病等。临床上存在着反复感染和难以治愈等问题。如果将菌体表面蛋白作为疫苗,将刺激机体产生相应抗体,干扰链球菌侵入细胞,从而易于机体清除链球菌。候选的菌体蛋白中对M蛋白的了解最清楚,但由于M蛋白血清型太多,且M蛋白可能引起严重的变态反应,使得M蛋白作为疫苗的应用受到限制。世界各地不同实验室的研究涉及到链球菌的F1蛋白、C5肽酶、链球菌糖、外毒素等,但免疫效果始终难以超越M蛋白。Terao Y.等利用化脓性链球菌SF370网上公布的基因组序列,发现一新型菌体蛋白fba,含有1068个核苷酸,编码355个氨基酸,分子量为37.8Kda[1]。整个肽链从N端分为信号肽区,双螺旋结构区,富含脯氨酸区及C端的锚定区。它存在于13、22、28、44、49、60、67、75、77、79、80、82、87和89等多个血清型中,各型之间的fba蛋白差异不大。实验结果显示表达fba蛋白的GAS(fba+GAS)侵入上皮细胞的能力较强。它还可以与补体调节因子FH、FHL-1结合,以促进链球菌黏附、入侵上皮细胞及抗吞噬作用[2],因此显示它对链球菌在体内的存活、毒力及致病性等诸多方面的重要作用[3]。本室前期研究发现fba蛋白可诱发与M蛋白相当的保护性免疫应答,因此fba蛋白具备作为GAS疫苗候选蛋白的极其有利的潜质。本研究在已知A族链球菌表面蛋白fba具有良好的免疫原性和免疫保护性的基础上,将分段克隆表达的fba蛋白免疫动物并攻毒,以确定其具有保护性功能的区段。制备fba蛋白的多抗,用纯化的抗fba蛋白的多抗筛选噬菌体随机七肽库(Ph·D-7),获得多个fba蛋白抗原的线性表位及构象表位。方法:1.1根据fba蛋白的结构特点将其划分为四个重叠区域:37～110aa、68～161aa、104～277aa、160～324aa。分别命名为fba1、fba2、fba3、fba4。大量表达fba分段蛋白,亲和柱层析纯化后免疫动物。1.2将雌性Balb/c小鼠分为五组,每组8只,分别为fbaA1蛋白组、fbaA2蛋白组、fbaA3蛋白组、fbaA4蛋白组及PBS对照组,各组均以相同剂量蛋白免疫小鼠并加强免疫两次,每次免疫均间隔两周,并在每次免疫前内眦取血,末次免疫后两周取血。1.3 ELISA检测各免疫组血清IgG水平。使用致死量的GAS(M+fba+)攻击免疫三次后的小鼠,计算各组的保护率。2.1将纯化的fba蛋白免疫新西兰兔,以相同剂量蛋白免疫四次,每次免疫均间隔两周,末次免疫后两周颈动脉取血处死。ELISA检测兔血清IgG水平。纯化抗体,ELISA检测纯化后抗体水平。2.2采用纯化的IgG筛选噬菌体随机七肽库,经3轮生物淘洗后,随机挑取分隔良好的克隆,通过夹心ELISA试验检测其与多抗的亲和力,挑选其中亲和力高的21个噬菌体克隆,提取单链DNA并测序。根据测序结果推导出其氨基酸序列,再与fba蛋白序列进行比较分析,推断fba蛋白的表位。结果:1.1经SDS-PAGE分析显示成功表达并纯化了fba分段蛋白。1.2将纯化的fba分段蛋白免疫动物,实验组血清IgG产生呈逐渐增高趋势,其中以fba2蛋白组效价升高最为明显,达1:102400,依次为fba3、fba4及fba1蛋白组。1.3攻毒后5天,PBS组小鼠全部死亡,各实验组连续观察两周后依然有多只小鼠存活,各组保护率为fba2蛋白组50%、fba1、fba3及fba4蛋白组均为25%,经SPSS统计分析各实验组与PBS组保护率有显著差异。2.1纯化的fba蛋白免疫新西兰兔后获得高IgG水平抗体。成功纯化多抗。2.2经过三轮筛选后,获得了高亲和力的噬菌体克隆。对21株噬菌体克隆测序,推导出线性表位15个,构象表位3个。结论:1 fbaA2段可诱导较强的保护性免疫应答。2获得了多个fba蛋白抗原表位。

关键词： A族链球菌(GAS) fba蛋白免疫原性噬菌体肽库抗原表位

A族链球菌表面蛋白fba单克隆抗体对应表位的鉴定及研究

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A族链球菌表面蛋白Fba单克隆抗体对应表位的鉴定及研究

作者：郭奕阳河北医科大学

学位级别：硕士

目的:A族链球菌(Group A Streptococcus,GAS)是一种常见致病菌,可引起严重的侵袭性感染及感染后变态反应性疾病。青霉素一直是抗链球菌感染的首选药物,但随着抗菌药的大量应用、乃至滥用,耐药菌株逐渐增多,加之链球菌本身的免疫逃逸,链... 详细信息

目的:A族链球菌(Group A Streptococcus,GAS)是一种常见致病菌,可引起严重的侵袭性感染及感染后变态反应性疾病。青霉素一直是抗链球菌感染的首选药物,但随着抗菌药的大量应用、乃至滥用,耐药菌株逐渐增多,加之链球菌本身的免疫逃逸,链球菌感染在临床上仍然呈现反复性及难以治愈的问题。诱导产生高效价抗体仍然是预防、控制链球菌感染的有效措施,故疫苗的研制成为预防此菌感染的又一切入点。但由于GAS血清型众多及其表面某些免疫原性强的蛋白可诱导严重的自身免疫反应等弊端,目前还没有理想的疫苗问世[1]。fba蛋白(Fibronectin-binding protein a)是2001年由Terao Y.等人新发现的一种表达于GAS表面的蛋白[2],广泛分布于多种型别的链球菌表面,并且在不同型别的链球菌中具有很高的同源性。fba蛋白属于Fn(Fibronectin,Fn,纤连蛋白)结合蛋白,利用Fn作为桥梁,与上皮细胞、内皮细胞上的相关受体结合,从而介导细菌进入宿主细胞[3]。fba蛋白还可与补体调节因子FH、FHL-1结合,阻止补体C3在菌体表面沉积,借此逃避补体溶菌、抵抗巨噬细胞的调理吞噬[4,5]。以往对fba蛋白的研究表明其有良好的免疫原性并可诱发保护性免疫应答[6,7]。鉴于此,fba蛋白有望成为GAS疫苗的候选蛋白。本室致力于fba蛋白的特性及其在链球菌逃避免疫攻击的作用研究。本室前期已经制备了2株抗fba蛋白的单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb),其中McAb2能特异性的结合野生型GAS,并证明McAb2只与fba分段蛋白中fba68-161段结合,初步预测表位是以104～108位氨基酸为核心的肽段。本课题以McAb2结合fba蛋白的特异性区段为基础,利用生物信息学方法预测McAb2所对应的表位,借助基因工程手段获取了含有相应表位的融合蛋白及预期表位缺失蛋白,并利用噬菌体肽库筛选McAb2结合的关键位点,进而对该结合位点是否与FH和fba蛋白的结合位点相重叠进行了研究。为进一步探索fba蛋白在GAS致病机制中的作用,鉴定McAb2的功能及制备表位肽疫苗奠定了基础。方法:1针对McAb2结合fba蛋白的特异区段,利用生物信息学方法预测其所对应的表位,确定涵盖此表位的三个重叠表位片段,采用搭桥PCR扩增该基因片段并克隆表达,Western blot检测融合蛋白与McAb2的结合。2构建相应表位缺失的基因片段并克隆表达,Western blot及ELISA检测突变蛋白与McAb2是否结合。3合成表位重叠肽片段,dot-ELISA检测各段与McAb2的结合。4利用噬菌体7肽库筛选McAb2对应的优势氨基酸。5通过竞争ELISA检测McAb2是否能竞争FH与fba蛋白的结合。6利用血浆吸附实验[5]检测McAb2能否阻止人血浆中的FH与fba蛋白结合。结果:1成功构建了pGEX-4T-2与预测的三条基因片段84～101aa、95～114aa、101～118aa的原核表达质粒,并分别得以表达。Western blot结果显示,fba95-114和fba101-118与McAb2有明显的杂交带。2成功构建表位缺失的基因片段68～161aa△96～118aa与pGEX-4T-2的重组原核表达质粒,并得以成功表达。Western blot显示McAb2不与fba68-161△96-118结合。间接ELISA结果与上述结果一致。3合成三段重叠肽分别是fba蛋白的第100～112、104～116和108～120位氨基酸多肽,dot-ELISA结果显示第100～112位的氨基酸多肽与McAb2的结合能力最强。4利用随机噬菌体7肽库筛选的结果显示McAb2针对的优势氨基酸是位于fba基因序列的第100～110位氨基酸中的ITPDL。5竞争ELISA数据经统计学处理,证实McAb2能部分封闭FH与野生型GAS的结合。6血浆吸附实验证实野生型GAS能结合人血浆中的FH,并且McAb2可以部分阻止FH与fba蛋白的结合。结论:1成功克隆、表达了fba蛋白McAb2所对应的表位肽段及预期表位缺失蛋白,初步确定了McAb2对应的表位区段。2利用噬菌体展示技术,确定了McAb2所针对的优势氨基酸。3 McAb2能够阻止或部分阻止FH与fba蛋白的结合,为进一步鉴定McAb2的功能,深入研究GAS的致病机制提供了有力的依据。

关键词： A族链球菌(GAS) fba蛋白单克隆抗体抗原表位噬菌体肽库 FH

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化脓性链球菌表面蛋白fba的免疫原性研究

化脓性链球菌表面蛋白Fba的免疫原性研究

作者：李彩虹河北医科大学

学位级别：硕士

目的:A族链球菌(GAS)是一类分布广泛的致病菌,能引起多种临床疾病,包括从喉或皮肤的浅表感染到高度侵袭及具有潜在致死的感染,甚至感染后严重的超敏反应肾小球肾炎、风湿性心脏病等。这些疾病都是由链球菌对呼吸道及皮肤的上皮细胞的黏... 详细信息

目的:A族链球菌(GAS)是一类分布广泛的致病菌,能引起多种临床疾病,包括从喉或皮肤的浅表感染到高度侵袭及具有潜在致死的感染,甚至感染后严重的超敏反应肾小球肾炎、风湿性心脏病等。这些疾病都是由链球菌对呼吸道及皮肤的上皮细胞的黏附引起的。GAS可以通过其菌体表面蛋白与人血浆纤连蛋白(Fibronectin)结合,并以此为分子桥梁再与上皮细胞上的相关受体结合,介导细菌进入细胞,从而逃避宿主细胞对它的吞噬和杀伤[1]。fba蛋白是一种新发现的表达于GAS表面的蛋白,它至少存在于18个血清型中,并具有结合FHL-1、FH和纤连蛋白的能力。研究表明,fba蛋白有助于GAS的抗吞噬,与FHL-1结合后能促进GAS进入人体上皮细胞,是一种重要的毒力因子[2,3]。鉴于此,本课题选取了fba蛋白编码基因为研究对象,构建了fba原核表达质粒和真核表达质粒,之后诱导原核质粒表达,通过Western blot和ELISA检测重组蛋白。并将真核表达质粒和纯化的重组fba蛋白免疫小鼠,对它们所诱导的体液免疫和细胞免疫进行评估,以进一步对其免疫原性及fba在抗GAS感染免疫中的作用进行分析,为进一步研制以其为基础的诊断试剂和疫苗提供依据。方法:1 PCR方法扩增fba基因,克隆至pMD18-T载体上进行测序,测序正确后,经BamHI、EcoR I和BamHI、XhoI双酶切后,将其分别克隆至原核表达质粒pGEX4T-2和真核表达质粒pcDNA3.1。2原核表达质粒通过IPTG诱导,获得了高效表达的蛋白包涵体,采用从SDS凝胶上电洗脱回收的方法进行纯化回收,Western-blot和ELISA鉴定表达的目的蛋白。3以该蛋白作为抗原包被酶联板检测GAS全菌免疫鼠血清,未免疫鼠血清,抗链“O”阳性病人血清及健康志愿者血清中可能存在的fba抗体,同时以GAS的M蛋白包板检测以上各类血清中的M抗体作为阳性对照。4雌性BALB/c小鼠随机分成6组,分别为fba蛋白免疫组、M蛋白免疫组、pcDNA3.1/fba+fba蛋白免疫组、pcDNA3.1/fba免疫组、pcDNA3.1空质粒对照组及PBS对照组。ELISA检测各免疫组血清IgG的动态变化水平;脾细胞增殖试验及流式细胞术检测小鼠体内CD4+、CD8+淋巴细胞的变化。给予链球菌攻击评价fba蛋白及质粒对免疫小鼠的保护功效。结果:1 PCR方法获得了fba基因,测序正确后,成功构建了原核表达质粒pGEX4T-2/fba和真核表达质粒pcDNA3.1/fba。2在大肠杆菌中成功表达了fba重组蛋白,表达蛋白主要以包涵体形式存在。ELISA和Western-blot证实表达的fba重组蛋白可与已知兔抗fba阳性血清产生特异性反应。3 fba蛋白可与GAS全菌免疫鼠血清、抗链“O”阳性病人血清发生特异性结合,尽管fba蛋白做为诊断抗原的检测结果比M蛋白的检测结果的OD值小,但二者的检测结果一致,均为阳性。4质粒或蛋白免疫后小鼠IgG产生水平以fba蛋白免疫组增高最为明显,依次为fba质粒蛋白混合免疫组及fba质粒组。特异性抗原诱导后体外脾细胞增殖试验显示:pcDNA3.1/fba免疫组增值水平明显高于其它组,流式细胞检测结果与此一致,并显示CD4+、CD8+T细胞水平较对照组有显著性增高。5链球菌攻击后,PBS组小鼠在4天内全部死亡,而fba蛋白组、pcDNA3.1/fba+fba蛋白组及M蛋白组在14天的观察期内均有60%的存活率,pcDNA3.1/fba组为40%。结论:1成功构建了原核表达质粒pGEX4T-2/fba和真核表达质粒pcDNA3.1/fba。2在大肠杆菌中高效表达了fba重组蛋白。3 GAS感染可以诱导人体及动物体产生fba抗体,即fba蛋白与M蛋白一样,也具有良好的免疫原性和抗原特异性。因M蛋白及M抗体是人体感染GAS后诱发超敏反应的主要原因,加之其血清型的多样性,使M蛋白作为GAS的候选疫苗受到限制,故可以考虑fba蛋白作为GAS的候选疫苗及诊断抗原。4 fba蛋白能有效地诱导机体产生抗体,fba真核质粒能有效诱导抗体及Th细胞增殖,且fba蛋白或基因获得了较强的抗GAS感染的能力,以上结果均提示fba蛋白很有希望成为GAS的候选疫苗。

关键词： A族链球菌(GAS) fba蛋白 DNA疫苗免疫原性重组疫苗