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高羊茅高温响应转录因子fanac74的功能鉴定及耐高温种质筛选应用

高羊茅高温响应转录因子FaNAC74的功能鉴定及耐高温种质筛选应用

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作者：纪康中国科学院大学(中国科学院武汉植物园)

学位级别：硕士

高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)具有抗逆性强、绿期长以及耐践踏等特点,是应用最广泛的草坪草之一。作为典型的冷季型草坪草,高羊茅的最佳生长温度为18-25℃,对高温敏感。在我国亚热带及热带地区,夏季的极端高温天气会造成高羊茅... 详细信息

高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)具有抗逆性强、绿期长以及耐践踏等特点,是应用最广泛的草坪草之一。作为典型的冷季型草坪草,高羊茅的最佳生长温度为18-25℃,对高温敏感。在我国亚热带及热带地区,夏季的极端高温天气会造成高羊茅生长迟缓或停滞,草坪质量下降甚至植株死亡。因此,高温被认定是发展和利用高羊茅的主要限制因素之一。NAC类蛋白是一类植物特有的转录因子家族,其成员广泛分布于陆生植物中,参与植物生长发育、生物和非生物胁迫响应、衰老调节等诸多生物学过程。从高羊茅中发掘鉴定响应高温胁迫的NAC类转录因子,并进行功能解析,可为改良高羊茅的耐高温能力提供科学依据,具有重要的理论意义和应用价值。本研究开展了高羊茅种质资源收集、耐热性评价、耐热基因挖掘及功能解析等研究工作,取得的主要结果如下:1.高羊茅种质的耐高温筛选以收集的188份来自不同国家地区的高羊茅种质为材料,选取其中的64份利用武汉地区的夏季高温进行了室外越夏实验,对高羊茅种质耐热性进行了综合评价,并筛选到高羊茅耐热种质和高温敏感种质各10份,为培育耐高温高羊茅新品系提供了亲本材料。2.高羊茅fanac74基因的挖掘及特征鉴定基于实验室前期的高羊茅转录组数据库,发掘到一个耐热相关的转录因子,命名为fanac74。我们分析了fanac74基因在高羊茅耐高温以及高温敏感种质中的表达模式,发现fanac74基因的表达受高温胁迫显著诱导,且在耐高温种质中表达量更高,表明fanac74基因可能与高羊茅耐热性相关。以耐高温种质高温处理后的cDNA为模版,克隆了fanac74基因,并进行了氨基酸多重序列比对和系统进化树构建,结果表明fanac74蛋白与二穗短柄草的BdNAC74蛋白有较高的氨基酸序列同源性。通过对氨基酸序列跨膜结构域的预测,发现fanac74的C端存在一个跨膜结构域。我们进一步构建了fanac74的亚细胞融合表达载体35S:fanac74-eGFP,并在农杆菌介导下转化烟草表皮细胞,观察fanac74亚细胞定位,结果显示fanac74蛋白定位在细胞膜上。3.高羊茅fanac74转录因子的功能解析为了研究fanac74转录因子的功能,我们构建了超表达载体并转化模式植物拟南芥,获得了转基因植株。我们对过表达fanac74的转基因拟南芥株系进行42℃高温处理2小时,恢复3天后对存活率进行统计分析,结果显示转基因株系的存活率较对照植株显著提高,表明fanac74基因正调控植株的耐热性。***74转录因子下游基因的发掘为了揭示fanac74介导的高温胁迫应答调节机制,我们利用RNA-seq技术对高温前后的35S:fanac74和对照植株转录组分析。结果发现,在高温处理下,转基因株系与对照相比差异表达的基因数目为2043个,包括1261个表达上调基因,782个表达下调基因。GO分析结果表明,在生物过程和在分子功能方面,差异基因主要富集在应对高温胁迫(Response to Heat)与细胞内未折叠蛋白结合(Unfolded Rrotein Binding)上。进一步地,我们发现多个抗逆相关基因,如HSP70-16、HSP18.1、ANAC13和DREB2C等在fanac74过表达植株中的表达量显著高于对照。以上结果表明fanac74可能通过调节下游逆境应答基因的表达来响应高温胁迫。综上所述,我们对高羊茅种质耐高温能力进行了综合评价,并从耐高温种质中发掘鉴定到一个受高温显著诱导的转录因子fanac74,开展了该转录因子的特征鉴定、功能解析等研究工作,为培育耐高温高羊茅新种质提供了科学依据。

关键词：高羊茅耐热性评价 fanac74 转录组

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