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RASAL3通过上调fxyd6表达促进肝内胆管细胞癌细胞增殖的作用机制研究

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中华普通外科杂志 2022年第11期37卷 839-844页

作者：张彬周大臣陈忠彪王玮琛侯辉熊奇如平国强安徽医科大学第二附属医院普外科五病区合肥230601 江苏省人民医院(南京医科大学第一附属医院)病理学部南京210000

目的探讨Ras蛋白激活类似物3(RASAL3)在肝内胆管癌(iCCA)中的表达并深入研究其促进iCCA进展的作用机制。方法收集185例iCCA患者肿瘤与癌旁组织标本,应用免疫组化、RT-qPCR和Western blot法检测RASAL3的表达,并同时检测人胆管癌细胞株和... 详细信息

目的探讨Ras蛋白激活类似物3(RASAL3)在肝内胆管癌(iCCA)中的表达并深入研究其促进iCCA进展的作用机制。方法收集185例iCCA患者肿瘤与癌旁组织标本,应用免疫组化、RT-qPCR和Western blot法检测RASAL3的表达,并同时检测人胆管癌细胞株和人胆管上皮细胞中RASAL3和fxyd6的mRNA和蛋白表达情况,CCK-8法检测细胞增殖及Na^(+)-K^(+)-ATP酶活性。结果 RASAL3在胆管癌组织和细胞株中高表达;生存分析结果显示RASAL3高表达与胆管癌的不良预后相关(Pfxyd6表达水平,抑制Na^(+)-K^(+)-ATP酶活性。结论 iCCA中RASAL3表达水平显著上调,RASAL3可通过激活fxyd6,上调Na^(+)-K^(+)-ATP酶活性促进iCCA的发展。

关键词：胆管,肝内胆管上皮癌 Ras蛋白激活类似物3 fxyd6 Na+-K+-ATP酶

离子通道相关蛋白fxyd6功能区的原核表达及纯化

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山东医药 2010年第51期50卷 4-6页

作者：陈雄飞周宁新辽宁医学院辽宁锦州121001 中国人民解放军第二炮兵总医院

目的构建fxyd6蛋白功能区(fxyd6-ex)的原核表达质粒,并诱导fxyd6-ex在原核细胞中表达与纯化,以进一步研究fxyd6功能。方法用全长fxyd6 cDNA扩增fxyd6-ex,扩增产物插入克隆质粒载体pMD18-T Simple并用限制性内切酶酶切,将目的片段插入以... 详细信息

目的构建fxyd6蛋白功能区(fxyd6-ex)的原核表达质粒,并诱导fxyd6-ex在原核细胞中表达与纯化,以进一步研究fxyd6功能。方法用全长fxyd6 cDNA扩增fxyd6-ex,扩增产物插入克隆质粒载体pMD18-T Simple并用限制性内切酶酶切,将目的片段插入以限制性内切酶切后的表达质粒载体pET28a(+)中,经PCR电泳和测序证实后转化宿主大肠杆菌Rossetta,异丙基-β-8-D硫代半乳糖(IPTG)诱导重组蛋白表达,镍柱纯化重组蛋白,十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶和Western blot检测鉴定蛋白表达及纯化情况。结果成功构建pET28a(+)-fxyd6-ex大肠杆菌表达载体,并实现该蛋白在大肠杆菌中的高表达,分离纯化的产物纯度达90%。结论本研究成功对fxyd6-ex进行原核表达及纯化;此为后续制备该蛋白抗体库及进一步研究其具体功能奠定了良好基础。

关键词： fxyd6 蛋白表达蛋白纯化

离子通道相关蛋白fxyd6的真核表达和功能区的原核表达及纯化

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离子通道相关蛋白FXYD6的真核表达和功能区的原核表达及纯化

作者：陈雄飞辽宁医学院

学位级别：硕士

目的构建离子通道相关蛋白fxyd6的真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-) B- fxyd6,瞬时转染哺乳动物细胞293T细胞,并检测其目的蛋白表达和在细胞中的定位情况,为进一步的动物实验研究打下基础。构建功能区原核表达载体pET-28a(+)-fxyd6-ex... 详细信息

目的构建离子通道相关蛋白fxyd6的真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-) B- fxyd6,瞬时转染哺乳动物细胞293T细胞,并检测其目的蛋白表达和在细胞中的定位情况,为进一步的动物实验研究打下基础。构建功能区原核表达载体pET-28a(+)-fxyd6-ex,并诱导其在原核细胞中表达,对表达出的功能区重组蛋白进行纯化,以进一步制备该蛋白不同表位的抗体,为研究fxyd6蛋白的组织分布和的具体功能奠定基础。方法用全长fxyd6 cDNA序列分别扩增fxyd6全长序列和其功能区片段fxyd6-ex,扩增产物插入到克隆质粒载体pMD18-T Simple中,将连接产物载化到克隆宿主大肠杆菌Trans10中进行TA扩增,抽提质粒,将质粒和真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-) B空载体用限制性内切酶双酶切,DNA电泳,目的片段回收与纯化,全长序列目的片段插入到酶切后的空载体pcDNA3.1/myc-His(-) B中,功能区目的片段插入到以相同限制性内切酶双酶切后的表达质粒载体pET28a(+)中,两种重组质粒重新转化到大肠杆菌Trans10扩增质粒,抽提质粒,经PCR电泳和测序证实两种质粒正确。重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-) B-fxyd6瞬时转染哺乳动物细胞293T细胞,用western blot检测其目的蛋白表达,其所长并用细胞免疫荧光检测目的蛋白的细胞分布情况。重组质粒pET28a(+)-fxyd6-ex转化宿主大肠杆菌Rossetta,异丙基-β-8-D硫代半乳糖(IPTG)诱导功能区重组蛋白表达,镍柱纯化,用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶和western blot检测,鉴定功能区重组蛋白表达及纯化情况。结果本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-) B-fxyd6,并实现了其在293T细胞的表达, fxyd6主要分布在细胞质和细胞膜上。成功构建了原核表达载体pET28a(+)-fxyd6-ex,通过IPTG诱导实现了该蛋白功能区在大肠杆菌Rossetta中的高表达,用镍柱纯化后的重组蛋白纯度达90%。结论 1、本研究成功完成了离子通道相关蛋白fxyd6真核表达载体pcDNA3.1 /myc-His(-) B-fxyd6的构建并实现了它的真核表达, fxyd6蛋白主要分布在细胞质和细胞膜上。 2、本研究也实现了它的功能区的原核表达及纯化,纯化后的重组蛋白为后续制备该蛋白单克隆抗体库及进一步研究其具体功能奠定了良好基础。

关键词：离子通道相关蛋白 fxyd6 pET28a(+) 293T细胞蛋白表达蛋白纯化

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抗人fxyd6单克隆抗体的制备及鉴定

科学技术与工程 2009年第10期9卷 2579-2582页

作者：刘军桂周宁新张效东第二炮兵总医院肝胆胃肠病研究所北京100088

制备了抗人fxyd6单克隆抗体,并进行初步鉴定。以fxyd6合成多肽作为免疫原,利用单克隆抗体杂交瘤技术建立阳性克隆细胞株;腹水诱导法制备抗人fxyd6单克隆抗体;蛋白A亲合层析法纯化;ELISA测定fxyd6单克隆抗体的特异性和效价;以所得特异性... 详细信息

制备了抗人fxyd6单克隆抗体,并进行初步鉴定。以fxyd6合成多肽作为免疫原,利用单克隆抗体杂交瘤技术建立阳性克隆细胞株;腹水诱导法制备抗人fxyd6单克隆抗体;蛋白A亲合层析法纯化;ELISA测定fxyd6单克隆抗体的特异性和效价;以所得特异性抗体为一抗,利用免疫组化法检测胰腺癌组织中fxyd6的表达。结果成功获得1株稳定分泌特异性抗人fxyd6单克隆抗体的杂交瘤细胞株;腹水诱导法生产抗人fxyd6单克隆抗体2.86mg;fxyd6单克隆抗体可以与fxyd6合成多肽特异性结合,抗体效价1:5400;免疫组织化学显示胰腺癌组织中胞膜呈阳性染色。成功获得fxyd6单克隆抗体可以为进一步研究fxyd6的组织分布、生物学作用创造条件。

关键词：离子通道转运调节因子 fxyd6 单克隆抗体酶联免疫吸附测定免疫组织化学

fxyd基因蛋白家族及fxyd6蛋白的研究现状

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滨州医学院学报 2009年第2期32卷 134-136页

作者：任师颜周宁新解放军总医院全军肝胆外科研究所北京市100853 解放军第二炮兵总医院肝胆胃肠研究所

fxyd基因家族蛋白是一类小分子的单跨膜蛋白, 有离子通道或离子通道调节的作用,和Na+-K+-ATP酶的结构功能密切相关.为适应不同组织的生理功能,Na+-K+-ATP酶动力学和FDXY基因蛋白的表达因组织部位的不同而异.fxyd基因及其蛋白的生物学特... 详细信息

fxyd基因家族蛋白是一类小分子的单跨膜蛋白, 有离子通道或离子通道调节的作用,和Na+-K+-ATP酶的结构功能密切相关.为适应不同组织的生理功能,Na+-K+-ATP酶动力学和FDXY基因蛋白的表达因组织部位的不同而异.fxyd基因及其蛋白的生物学特性、生理功能和调节的研究,有助于进一步了解fxyd及其亚群的作用和功能.本文就fxyd基因家族蛋白特别是fxyd6的新近研究进行综述.

关键词： fxyd基因蛋白 fxyd6 Na+-K+-ATP酶

hfxyd6反义核酸对胆管癌细胞体外增殖和侵袭能力的影响

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世界华人消化杂志 2007年第9期15卷 929-935页

作者：窦春青岳鑫周宁新中国人民解放军总医院全军肝胆外科研究所北京市100853 北京大学神经科学研究所北京市100083

目的:研究hfxyd6基因反义核酸对人胆管癌QBC939细胞体外增殖和侵袭能力的影响.方法:构建hfxyd6基因反义核酸真核表达载体pcDNA3.1(-)/hfxyd6(-)并转染人胆管癌QBC939细胞,同时设pcDNA3.1(-)空载体对照组和空白对照组.SYBR GreenⅠ荧光定... 详细信息

目的:研究hfxyd6基因反义核酸对人胆管癌QBC939细胞体外增殖和侵袭能力的影响.方法:构建hfxyd6基因反义核酸真核表达载体pcDNA3.1(-)/hfxyd6(-)并转染人胆管癌QBC939细胞,同时设pcDNA3.1(-)空载体对照组和空白对照组.SYBR GreenⅠ荧光定量RT- PCR和免疫组化分别检测hfxyd6 mRNA及蛋白表达;MTT、平板克隆形成实验检测细胞体外增殖活性:流式细胞仪检测细胞周期;Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭能力.结果:与空白组和空载组比较,反义组细胞hfxyd6 mRNA及蛋白表达量降低;细胞群体倍增时间增加(46.8 h vs 34.5 h,35.3 h),细胞克隆形成率降低(24.3%±5.3% vs 61.0%±8.5%,58.0%±5.6%,P66.4%±2.9% vs 33.5%±2.3%,39.4%±3.7%,P6%±1.6% vs 36.2%±2.1%,34.1%±1.6%,Pfxyd6反义核酸抑制人胆管癌QBC939细胞体外增殖能力,但对其侵袭能力无明显作用.

关键词： fxyd6 反义核酸胆管癌增殖侵袭荧光定量RT—PCR 免疫组化流式细胞术