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作者：赵笑美华北理工大学

学位级别：硕士

目的探究木犀草素(Luteolin,Lut)对宫颈癌细胞增殖和转移影响。方法体外实验:培养宫颈癌细胞(HeLa),给与不同浓度木犀草素处理(10μM、20μM、40μM、60μM),通过细胞克隆形成、CCK-8细胞增殖验证木犀草素对宫颈癌细胞增殖能力的影响。... 详细信息

目的探究木犀草素(Luteolin,Lut)对宫颈癌细胞增殖和转移影响。方法体外实验:培养宫颈癌细胞(HeLa),给与不同浓度木犀草素处理(10μM、20μM、40μM、60μM),通过细胞克隆形成、CCK-8细胞增殖验证木犀草素对宫颈癌细胞增殖能力的影响。通过细胞凋亡实验,验证木犀草素对宫颈癌细胞凋亡的影响。培养宫颈癌细胞(HeLa),通过Western blot、RT-PCR、免疫荧光检测木犀草素对furin及其通路表达的影响。培养宫颈癌细胞(HeLa),通过细胞划痕实验和Transwell实验,观察木犀草素对宫颈癌细胞转移的影响。体内实验:建立宫颈癌Hela细胞异种移植瘤模型,测量瘤体体积及体重,观察木犀草素对宫颈癌细胞增殖的影响。通过Western blot、RT-PCR、免疫组化,观察木犀草素对furin及其通路表达的影响。使用SPSS 26.0软件分析数据,双侧检验,Pfurin的表达(F=24.22,Pfurin(F=46.70,Pfurin mRNA(F=15.45,Pfurin(F=318.24,Pfurin mRNA(F=809.30,Pfurin、MMP14、MMP9、MMP2的表达(Pfurin及下游蛋白的表达抑制宫颈癌细胞的增殖和转移。图 14 幅;表 26 个;参 143 篇。

关键词：木犀草素宫颈癌 furin 增殖转移

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基于蛋白核酸嵌合物的多功能细胞膜靶向FRET探针的构建及应用

基于蛋白核酸嵌合物的多功能细胞膜靶向FRET探针的构建及应用

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作者：吴先华湖南大学

学位级别：硕士

细胞膜是细胞的重要屏障和细胞间通讯场所,蛋白酶、受体、气体分子、离子、细胞因子等生物分子在细胞膜表面通过直接或间接相互作用启动细胞信号传导。开发可定位细胞膜、实时监测细胞分泌、代谢和细胞间通讯的传感检测工具,有助于我们... 详细信息

细胞膜是细胞的重要屏障和细胞间通讯场所,蛋白酶、受体、气体分子、离子、细胞因子等生物分子在细胞膜表面通过直接或间接相互作用启动细胞信号传导。开发可定位细胞膜、实时监测细胞分泌、代谢和细胞间通讯的传感检测工具,有助于我们加深对细胞生理、病理过程的理解,发展新的诊断、治疗方法。细胞膜所处的细胞微环境组分复杂,生物分子的变化具有微弱和快速的特点,因此实时定量测量细胞膜表面的信号分子仍具有挑战性。荧光共振能量转移(FRET)传感器作为高灵敏探测生物大分子结构的“分子标尺”,广泛应用于监测细胞内离子浓度、酶活性、蛋白质相互作用与构象变化等微观事件。基于荧光蛋白(Fluorescent protein,FP)的FRET传感器具有高灵敏度和生物相容性的优点,可实现在细胞内高时空分辨可视化检测。基于FP的FRET传感器主要由蛋白-蛋白联用的FRET对组成,通常可在融合蛋白之间设计传感模块。FRET对的形成对于供受体的光谱重叠程度和两者的空间距离要求十分严格,目前性能优越的基于FP的FRET对仍然有限。基于核酸适配体的FRET传感器易于合成设计,但修饰荧光团的价格昂贵,最新的替代策略为开发基于核酸适配体和小分子的荧光核酸复合物。综合蛋白质功能的多样性和核酸的可编程性,开发蛋白-核酸联用的蛋白核酸嵌合物FRET对,集成功能强大的蛋白模块与核酸模块,可为设计新型多功能FRET生物传感器提供更多研究思路。为开发用于细胞膜表面原位分析的蛋白核酸嵌合物FRET探针,我们选择大斯托克斯位移荧光蛋白m Ametrine和荧光核酸复合物G4(1a)分别作为FRET对的供受体,以高效特异性切割连接单链DNA(ss DNA)的DCV作为蛋白核酸嵌合物连接元件,将融合蛋白和荧光核酸复合物组装成FRET对。蛋白核酸嵌合物FRET对的优越性在于蛋白和核酸部分均可进行传感设计。受体G4(1a)含有与HSO的反应位点,反应后可致受体荧光淬灭从而解除FRET。此外,在FRET探针的融合蛋白之间设计蛋白酶底物位点,酶切后可使受体远离供体从而解除FRET。在蛋白核酸嵌合物FRET探针的蛋白模块融合插膜肽MIP可构建定位细胞膜的多功能FRET探针,为分析细胞膜表面生物分子信号提供了新的研究思路。本文为构建可定位细胞膜原位分析的蛋白核酸嵌合物FRET探针做了以下研究工作:(1)蛋白核酸嵌合物FRET对的构建以及性能优化。构建重组质粒p ET28a-mip-m Ametrine-dcv,并在原核体系中表达重组供体蛋白MIP-m Ametrine-DCV。验证其荧光性质和切割连接ss DNA的能力,并构建了蛋白核酸嵌合物FRET对MIP-m Ametrine-DCV-G4(1a)。通过对蛋白与核酸的共价连接反应条件和重组蛋白的结构进行优化,获得FRET对MIP-m Ametrine(s)-DCV-G4(1a),使FRET效率从47%提高至67%。(2)蛋白核酸嵌合物FRET探针用于检测细胞膜表面HSO。细胞内源性SO参与心血管系统的稳态控制,经代谢后转化成亚硫酸氢盐(HSO),监测细胞膜表面HSO信号变化有助于了解相关疾病的病理机制。荧光核酸复合物G4(1a)的小分子配体1a处于缺电子状态,可与亲核试剂HSO发生反应,使其自身荧光淬灭。基于此性质,我们将第二章构建的FRET对MIP-m Ametrine(s)-DCV-G4(1a)应用于检测HSO。构建的FRET探针可特异性响应HSO,检测限低至0.34μM。插膜肽MIP可将FRET探针定位于细胞膜,实现了对细胞膜表面HSO的检测,有望进一步实现对内源HSO的检测,为构建定位细胞膜的传感平台提供了一种有潜力的工具。(3)蛋白核酸嵌合物FRET探针用于检测细胞膜蛋白酶furin活性。弗林蛋白酶(furin)在多种癌症细胞中表达量上调,是一种癌症标志物。监测细胞膜furin活性对相关疾病的早期诊断和预后具有重要意义。基于蛋白核酸嵌合物的多功能性,我们在融合蛋白的m Ametrine(s)-DCV之间的linker上设计furin底物序列,构建了可特异性响应furin的FRET探针MIP-m Ametrine(s)-furin-DCV-G4(1a)。FRET探针被furin特异性识别切断后,供受体分离,以引起的荧光信号变化表征furin活性,检测限低至6.7×10 U/μL。同时,该FRET探针实现了在细胞裂解液复杂生理环境中分析furin活性,有望进一步将其应用于原位分析细胞膜表面furin活性,为构建原位分析的多功能细胞膜生物分子检测平台奠定了基础。

关键词：蛋白核酸嵌合物 FRET探针 DCV 细胞膜 HSO3- furin

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hBMP-7在毕赤酵母中高效表达及二聚体化研究

hBMP-7在毕赤酵母中高效表达及二聚体化研究

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作者：林政福建师范大学

学位级别：硕士

骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)属于TGF-β家族的一类蛋白质生长因子，其中hBMP-7(又称OP-1)，除了具有常位／异位诱导骨形成的作用以外，在发育过程中还能对多种组织器官的发生、发育起到重要的调节作用。因此，hB... 详细信息

骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)属于TGF-β家族的一类蛋白质生长因子，其中hBMP-7(又称OP-1)，除了具有常位／异位诱导骨形成的作用以外，在发育过程中还能对多种组织器官的发生、发育起到重要的调节作用。因此，hBMP7在阐明多种组织器官的发生、发育分子机制的研究及在临床上具有广泛的应用前景。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年发展起来并被广泛运用的一种优良的真核表达系统。本研究利用此表达系统表达hBMP-7，探讨在此表达系统中提高hBMP-7基因的拷贝数能否提高hBMP-7表达量，以及研究在此表达系统中表达高生物活性的hBMP-7二聚体蛋白的可行性。主要研究内容和结论如下：1、改造hBMP-7成熟肽的密码子，将酵母使用频率较低的密码子突变为使用频率较高的密码子，然后在hBMP-7成熟肽的N端带上a-factor的前-前导肽，接着构建表达载体pAO815-a-factor-BMP7m-1c(1拷贝)，在此基础上，构建多拷贝hBMP-7成熟肽的表达质粒。将表达质粒转化GS115菌株，并进行摇瓶表达目的蛋白的实验，取上清经DOT-BLOT快速半定量检测，初步的实验结果表明，随着hBMP-7成熟肽基因拷贝数的增加，hBMP-7成熟肽在酵母中的表达量也增多。2、把hBMP-7中furin识别的序列-RSIR-，应用SOEPCR的方法进行定点突变，改为酵母的Kex2p识别的序列-KR-，接着构建pPIC9K-BMP-7pmk表达载体。表达载体转化GS115菌株后，进行摇瓶培养表达目的蛋白的实验，表达产物经DOT-BLOT和WESTERN-BLOT分析，初步的实验结果表明，表达产物中无hBMP-7二聚体蛋白，说明用这种方法在酵母表达系统中无法获得hBMP-7二聚体蛋白。3、利用pfuDNA聚合酶将hBMP-7的前导肽与成熟肽的基因扩增出来，构建表达载体pPIC9K-BMP-7pm;构建表达载体pAO815-furin;接着将两种质粒共转化GS115菌株，筛选出同时含有这两种基因的菌株，为研究这两种蛋白同时在GS115菌株中表达打下基础。

关键词： hBMP-7 Pichia pastoris 多拷贝基因高效表达分子内分子伴侣 furin

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GOLPH3对脑胶质瘤细胞迁移的作用及机制研究

GOLPH3对脑胶质瘤细胞迁移的作用及机制研究

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2011中华医学会神经外科学学术会议

作者：战文建杨冬旭周秀萍于如同徐州医学院附属医院神经外科

目的检测GOLPH3对胶质瘤细胞迁移能力的影响;探讨GOLPH3调节胶质瘤细胞迁移作用的机制。方法采用脂质体转染法在U251胶质瘤细胞中用siRNA下调GOLPH3的表达后,检测以下指标:1,划痕实验观察细胞的迁移情况;2,明胶酶谱法检测细胞基质金属... 详细信息

目的检测GOLPH3对胶质瘤细胞迁移能力的影响;探讨GOLPH3调节胶质瘤细胞迁移作用的机制。方法采用脂质体转染法在U251胶质瘤细胞中用siRNA下调GOLPH3的表达后,检测以下指标:1,划痕实验观察细胞的迁移情况;2,明胶酶谱法检测细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的活性改变情况,应用RT-PCR技术检测MMP-2 mRNA水平变化;3,RT-PCR技术检测弗林蛋白酶(furin)mRNA水平变化。结果U251胶质瘤细胞中用siRNA下调GOLPH3的表达后,1,细胞的迁移能力明显降低(P<0.01);2,细胞培养基中MMP-2的活性明显降低(P<0.05),而GO

关键词：胶质瘤迁移 GOLPH3 MMP-2 furin

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miR⁃93⁃5p对心脏成纤维细胞纤维化的影响

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分子诊断与治疗杂志 2020年第5期12卷 656-660页

作者：张伟峰雷素扬赵俊涛郑州市第七人民医院心外科河南郑州450000

目的miR⁃93⁃5p是心肌梗死中新发现的差异微小RNA(miRNA),探索其在心脏成纤维细胞中的功能机制。方法用差速贴壁法分离心肌梗死小鼠心脏成纤维细胞和心肌细胞;脂质体法将miR⁃NC组(转染miR⁃NC)、miR⁃93⁃5p mimic组(转染miR⁃93⁃5p mimic)、... 详细信息

目的miR⁃93⁃5p是心肌梗死中新发现的差异微小RNA(miRNA),探索其在心脏成纤维细胞中的功能机制。方法用差速贴壁法分离心肌梗死小鼠心脏成纤维细胞和心肌细胞;脂质体法将miR⁃NC组(转染miR⁃NC)、miR⁃93⁃5p mimic组(转染miR⁃93⁃5p mimic)、inhibitor⁃NC组(转染inhibitor⁃NC)、miR⁃93⁃5p inhibitor组(转染miR⁃93⁃5p inhibitor)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA⁃弗林蛋白酶(furin)组(转染pcDNA⁃furin)、si⁃NC组(转染si⁃NC)、si⁃furin组(转染si⁃furin)、miR⁃93⁃5p mimic+pcD⁃NA组载体(共转染miR⁃93⁃5p mimic和pcDNA)、miR⁃93⁃5p mimic+pcDNA⁃furin组(共转染miR⁃93⁃5p mimic和pcDNA⁃furin)转染至分离的成纤维细胞。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT⁃PCR)、免疫印迹(Western blot)检测细胞中miR⁃93⁃5p、furin、胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)、胶原蛋白Ⅲ(CollagenⅢ)、成纤维细胞基质金属蛋白酶抑制物⁃2蛋白(TIMP2)、纤维连接蛋白(Fibronectin)的表达;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果心肌梗死小鼠心脏成纤维细胞与心肌细胞相比,miR⁃93⁃5p、furin的表达均显著升高(Pfurin能明显抑制成纤维细胞中CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin的表达,而抑制miR⁃93⁃5p、过表达furin则具有相反的作用。miR⁃93⁃5p直接抑制野生型furin细胞的荧光素酶活性,并且过表达furin还可部分逆转miR⁃93⁃5p对心脏成纤维细胞的纤维化调控。结论miR⁃93⁃5p可抑制心肌梗死心脏成纤维细胞的纤维化,其机制与靶向furin有关。

关键词： miR⁃93⁃5p furin 心肌梗死成纤维细胞纤维化

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