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山羊ftl基因克隆、序列分析和组织表达研究

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黑龙江畜牧兽医 2022年第15期 58-63,136,137页

作者：龚静曾献春四川开放大学农林卫生学院成都610073 成都医学院检验医学院成都610500

为了探讨山羊体内铁蛋白轻链(ferritin light chain,ftl)的结构及生物学功能,试验利用RT-PCR技术克隆得到山羊ftl基因序列,通过在线软件分析其生物学特性,构建物种进化树揭示物种间亲缘关系;根据克隆获得的ftl基因序列,通过实时荧光定量... 详细信息

为了探讨山羊体内铁蛋白轻链(ferritin light chain,ftl)的结构及生物学功能,试验利用RT-PCR技术克隆得到山羊ftl基因序列,通过在线软件分析其生物学特性,构建物种进化树揭示物种间亲缘关系;根据克隆获得的ftl基因序列,通过实时荧光定量PCR技术检测山羊ftl基因在不同组织中表达水平;复苏前期保存的山羊肌内前体脂肪细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测ftl基因在诱导分化各时间点的相对表达量。结果表明:克隆获得的山羊ftl基因编码区(CDS)序列全长为745 bp,其中包括完整的大小为528 bp的ORF,共编码173个氨基酸;ftl蛋白有6个丝氨酸磷酸化位点,4个苏氨酸磷酸化位点,有23个带正电荷的赖氨酸和精氨酸残基,26个带负电荷的谷氨酸和天冬氨酸残基,无跨膜结构域;山羊ftl基因与牛进化亲缘关系最近;ftl基因在山羊体内各器官/组织中均有不同程度的表达,其中在肝脏中的相对表达量最高;ftl基因在24小时时相对表达量最高,24 h后的表达量呈不断下降的趋势。说明山羊ftl蛋白与脂肪代谢具有一定直接或间接关系。

关键词：山羊 ftl基因克隆组织表达时序表达

靶向ftl基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

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生物技术 2014年第5期24卷 8-12页

作者：蔡琳琳柳彩芝黄永茂王胜南段相林樊玉梅河北师范大学生命科学院河北石家庄050024 河北化工医药职业技术学院化学与环境工程系河北石家庄050026

目的:为了构建铁蛋白轻链(ferritin light chain,ftl)的短发夹小干扰RNA表达载体,并提供进一步研究ftl功能的平台。方法:针对小鼠ftl基因的特异性位点设计并合成特异性长度约65bp的短发夹状小干涉RNA(shRNA)寡核苷酸序列,退火形成双链... 详细信息

目的:为了构建铁蛋白轻链(ferritin light chain,ftl)的短发夹小干扰RNA表达载体,并提供进一步研究ftl功能的平台。方法:针对小鼠ftl基因的特异性位点设计并合成特异性长度约65bp的短发夹状小干涉RNA(shRNA)寡核苷酸序列,退火形成双链后将其插入真核表达载体pRNA-U6.1/neo的限制性内切酶HindⅢ和Bam HⅠ之间中,构建成ftl基因的干扰载体(ftl shRNA)。经测序鉴定正确后,用lipofectamineTM2000将ftl shRNA及其对照空载体pRNA-U6.1/neo分别转染到小鼠腹腔单核巨噬细胞(RAW264.7)中,提取蛋白后利用Western blot技术检测细胞中ftl蛋白的表达。结果:得到与预期目的片段大小相似的重组载体,测序结果显示所构建的小鼠ftl shRNA质粒序列正确。细胞内的ftl表达被ftl shRNA成功干扰,效率高达80%。结论:实验成功构建了小鼠ftl基因的短发夹小RNA干扰表达载体ftl shRNA。

关键词： ftl基因 RNA干扰 shRNA 真核表达载体

CLN1型神经元蜡样脂褐质沉积症伴遗传性高铁蛋白血症-白内障综合征1例患儿的分析

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中华医学遗传学杂志 2024年第1期41卷 75-80页

作者：周凡王建东王瑶李海英苏宇魏永威王怀立郑州大学第一附属医院儿科、河南省儿童癫痫与免疫医学重点实验室、河南省儿童神经系统疾病临床诊治中心郑州450052

目的分析1例神经元蜡样脂褐质沉积症1型(CLN1)合并遗传性高铁蛋白血症-白内障综合征(HHCS)患儿的临床及遗传学特征。方法以2020年11月郑州大学第一附属医院收治的1例患儿作为研究对象。收集患儿的临床资料,对其进行基因检测,并结合文献... 详细信息

目的分析1例神经元蜡样脂褐质沉积症1型(CLN1)合并遗传性高铁蛋白血症-白内障综合征(HHCS)患儿的临床及遗传学特征。方法以2020年11月郑州大学第一附属医院收治的1例患儿作为研究对象。收集患儿的临床资料,对其进行基因检测,并结合文献回顾分析其临床和遗传变异的特点,为早期识别提供思路。结果患儿男,3岁,以视力损害、进行性认知和运动功能倒退、癫痫发作为主要表现。磁共振成像提示双侧大脑半球脑沟加深、髓鞘发育明显落后。棕榈酰蛋白硫酯酶活力偏低(8.4 nmol/g/min,正常参考值:132.2~301.4 nmol/g/min),血清铁蛋白升高(2417.70 ng/mL,正常参考值:30~400 ng/mL)。眼底成像示视网膜色素变性。全外显子测序发现患儿PPT1基因存在c.280A>C及c.124-124+3delG复杂杂合突变,分别遗传自父亲和母亲,二者既往均未见报道。此外,其ftl基因存在c.-160A>G杂合变异,遗传自父亲。结合患儿的临床表型和遗传变异,诊断其为CLN1和HHCS。结论PPT1基因的c.280A>C和c.124-124+3delG复合杂合变异及ftl基因的c.-160A>C变异可能是患儿的遗传学病因。临床对于视力损害进展较快的CLN1患儿,应进一步完善眼科检查并详细询问家族史,对高度怀疑合并HHCS的患儿应尽早通过基因检测确诊。

关键词：神经元蜡样脂褐质沉积症 PPT1基因高铁蛋白血症白内障综合征 ftl基因

ftl重组蛋白的纯化及其在常见消化道癌诊断中的价值

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FTL重组蛋白的纯化及其在常见消化道癌诊断中的价值

作者：张春霞郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的近年来,消化系统恶性肿瘤的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势,并且部分肿瘤如胃癌、肝癌、胰腺癌等的预后较差,已成为严重威胁人类生命和健康的重大疾病之一。目前临床上常用的血清标志物敏感性或特异性均不够理想,不能实... 详细信息

背景和目的近年来,消化系统恶性肿瘤的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势,并且部分肿瘤如胃癌、肝癌、胰腺癌等的预后较差,已成为严重威胁人类生命和健康的重大疾病之一。目前临床上常用的血清标志物敏感性或特异性均不够理想,不能实现对某一种肿瘤的早期准确诊断。因此寻找提高消化道肿瘤早期诊断率的高效特异性生物标志物不仅具有重要的临床意义,而且势在必行。目前的研究显示,在慢性炎症性疾病如肝炎、肝硬化等发生恶性转化的过程中,机体可产生针对自身肿瘤相关抗原的抗体,并且一些自身抗体在发生恶性转化前就可在患者血清中检测到,这为恶性肿瘤的早期诊断提供了新的思路。铁蛋白轻链（ferritin light polypeptide, ftl）是铁蛋白的一种亚基,主要参与机体细胞内铁的储藏与转运。研究显示,铁蛋白在多种恶性肿瘤患者血清中的含量显著高于正常人血清中的含量,提示铁蛋白可能是一种血清肿瘤标志物。本课题组前期已成功构建好含有目的基因的测序正确的重组子pET30a-ftl。本研究将重组子转化到大肠杆菌BL21中,通过原核表达的方法获得ftl重组蛋白,并用其作为肿瘤相关抗原检测原发性肝癌患者、慢性肝病患者、食管癌患者、胃癌患者及正常人血清内抗ftl抗体的水平,评价其作为消化系统癌症诊断指标的价值,为进一步联合其他肿瘤相关抗原诊断某一消化系统恶性肿瘤的研究奠定基础。方法 1.将含有目的基因的重组表达质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21中。 2.确定最佳诱导条件：确定IPTG诱导目的蛋白最佳表达浓度和最佳表达时间。 3.大量诱导表达：诱导的菌体经超声破碎后进行可溶性分析确定ftl重组蛋白的表达形式,并尽可能优化诱导条件增加可溶性蛋白的表达量。 4.蛋白纯化：通过镍离子亲和层析法纯化带有组氨酸标签的重组蛋白,测定纯化蛋白的浓度,并用Western blot鉴定重组蛋白。 5.通过酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测正常人、慢性肝炎及常见消化道癌症（原发性肝癌、食管癌、胃癌）患者血清中的ftl抗体含量,比较其在正常人、慢性肝炎及常见消化道癌症（原发性肝癌、食管癌、胃癌）患者血清中的水平。 6.以正常人血清中ftl抗体含量的百分位数P95作为截断值,计算消化系统各种癌症组、慢性肝病组和正常组ftl抗体阳性率,并使用筛检试验的评价方法来评价ftl检测消化系统癌症的诊断价值。结果成功转化了重组表达质粒,寻找到目的蛋白大量表达的最佳诱导条件为0.05mmol/L IPTG诱导5h;目的蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在;通过镍离子亲和层析法获得到纯化蛋白,并通过Western blot确定了纯化的重组蛋白的免疫学活性。 ELISA结果显示,消化系统癌症患者血清中的ftl抗体水平高于慢性肝病患者和正常人血清中的ftl抗体水平;ftl检测原发性肝癌、食管癌、胃癌患者的灵敏度分别为17.6%、14.0%、12.0%,而在正常人及慢性肝病组中的灵敏度仅为5.1%、9.8%,这说明单独使用ftl抗体作为检测消化道癌症的标志物有（?）定的临床诊断价值,但诊断价值较低。结论 1.成功构建了ftl原核表达系统和蛋白纯化系统,并获得纯化的ftl重组蛋白;***抗体在消化系统癌症患者血清中含量增加,是消化系统癌症的一种血清标志物,单独检测时特异度高达94.9%,但灵敏度低。

关键词： ftl基因蛋白纯化生物标志物消化道肿瘤

一个高铁蛋白血症-白内障综合征家系的基因变异检测

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中国优生与遗传杂志 2023年第6期31卷 1266-1269页

作者：李彬唐根云莫小雪姜迎港王乐黄雪霜姜海鸥湖南医药学院湖南怀化418000

目的分析一个侗族遗传性高铁蛋白血症-白内障综合征(HHCS)家系的临床表型和致病变异。方法采用家系调查研究,收集于怀化市第一人民医院就诊的1个侗族HHCS家系,对部分家系成员进行眼科检查和血清铁蛋白含量测定,抽提DNA,对该家系先证者(... 详细信息

目的分析一个侗族遗传性高铁蛋白血症-白内障综合征(HHCS)家系的临床表型和致病变异。方法采用家系调查研究,收集于怀化市第一人民医院就诊的1个侗族HHCS家系,对部分家系成员进行眼科检查和血清铁蛋白含量测定,抽提DNA,对该家系先证者(Ⅲ3)和患者(Ⅳ1)进行全外显子组测序,寻找致病基因。并用Sanger测序对家系所有成员进行验证。结果该家系符合常染色体显性遗传。先证者,男,37岁,自初中时发现视力低下,右眼裸眼视力0.5,左眼裸眼视力0.6,双晶状体在位,呈核、后囊下型混浊,核颜色淡黄,血清铁蛋白含量检测为1869μg/L。其余家系成员患者与先证者临床表型相似。基因检测结果显示,该家系铁蛋白的L亚基(ftl)基因5′-UTR中存在1个杂合变异c.-167C>T。经对家系中其他患者和正常亲属Sanger测序验证,该致病变异与家系疾病表型共分离。结论ftl基因+33C>T(c.-167C>T,chr19-49468598)变异可能是该HHCS家系的致病变异,该变异位点在中国侗族家系中首次报道,为该家系的遗传咨询和产前诊断提供了可靠的依据。

关键词：遗传性高铁蛋白血症-白内障综合征全外显子组测序 ftl基因变异