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Fluorescence Resonance Energy Transfer Competitive binding assay for Secretin Receptor （Class B-GPCR）

Journal of Pharmacy and Pharmacology 2014年第5期2卷 295-303页

作者： Vijayalakshmi Senthil Jerome Leprince David Vaudry Billy Kwok Chong Chow Department of Zoology University of Hong Kong Hong Kong Department of Federative Institute for Multidisciplinary Research on Peptides (IFRMP23) University of RouenMont-Saint-Aignan 76821 France

Human secretin is responsible for carrying a number of physiological functions including energy and water homeostasis, thus making secretin receptor a promising target for drug development. For GPCRs （G protein-coupled receptors）, radioactive ligands are usually used in conventional binding assays to characterize the binding affinities of the ligands. An alternative non-hazardous fluorescence based binding assay is lucrative over the radio-ligand assays. Here, we have developed a fret （fluorescence resonance energy transfer） competitive binding assay for human secretin receptor. The receptor gene sequence is cloned in the SNAP （single nucleotide amplified polymorphisms） tag-plasmid and expressed in CHO （chinese hamster ovary）-K1 cells. Its expression and function is confirmed with immunofluorescence localization and receptor activation. The receptor and the ligand are labeled with fluorescent donor （Tb） and acceptor （Alexa488）. fret signals are produced when the labeled ligand is bound to the receptor and the same drop when it is displaced by the test compounds. The saturation concentration of the receptor labeling is 100 nM, and the ligand Kd value is 500 nM. At these concentrations, the IC50 of unlabeled secretin is 1.63 4- 3.55 nM. Additionally, few class-B ligands are screened and hold good correlation with traditional radio-ligand assay. Henceforth, this fret binding assay can be efficiently used as a primary screening tool for peptide analogs.

关键词： Class-B GPCR fret binding assay human secretin receptor peptide analogs secretin.

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