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＜正＞Objectives（1） To obtain pure and primary cultured oligodendtocyte/type-2 astrocyte（O2A） progenitors from cortices of neonatal rats.（2） To determine the expression and function of fpl on the primary cultured O2A progenitors.（3） To establish the feasible hypoxic-ischemic PVL model in vitro.（4） To ascertain the expression and effect on the PVL model in ***（1） The O2A progenitors were isolated and primarily cultured from the cortices of neonatal SD rats by twice shaking and using the conditioned *** morphologies of O2A were observed under inverted phase-contrast *** the immunofluorescence staining was used to identify and determine the purity of the cells.（2） Double-label immunofluorescence assay was used to investigate the expression of fpl on the O2 A progenitors and iron efflux test was used to explore the function of fp1.（3） O2A progenitors were treated with Oxygen-glucose deprivation（OGD） for 3,6,12,24 h to mimic hypoxic-ischemic PVL in vitro and their morphologies were observed under inverted phase-contrast *** survival rate of O2A progenitors was investigated by CCK-8 method and testing the lactate dehydrogenase（LDH） leakage.（4） The level of fp1 in the PVL model in vitro was tested by real time PCR and Western ***（1） O2A progenitors were round or oval with strong *** had monopolar,dipolar or tripolar processes,which were fine and straight with no branches. O2A progenitors were A2B5 positive cells and their purity is up to 95%.（2） Double-label immunofluorescence assay showed that O2A progenitors can express fp1,which was located in the cell membrane,body and processes.（3） Iron efflux test showed that the immunofluorescence intensity increased with time-dependence in the routine cultured and 0X42 antibody treated O2A progenitors（P＞0.05）.While the immunofluorescence intensity of fp1 antibody treated cells did not increase with time.（4） After OGD 3 h,6 h,12 h and 24 h,the morphologies of O2A progenitors h

关键词： fp1 PVL oxygen-glucose deprivation O2A progenitors

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大鼠ferroportin 1过表达慢病毒载体构建及其转染PC12细胞

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神经解剖学杂志 2012年第2期28卷 157-163页

作者：林清赵小贞林凌冯俊生王玮福建医科大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系福州350108 福建医科大学神经生物学研究中心福州350108

目的:构建含大鼠ferroportin 1(fp1,膜铁转运蛋白1)基因和EGfp(绿色荧光蛋白)基因的过表达慢病毒载体并转染PC12细胞。方法:化学合成含有目的基因fp1的质粒,将酶切获得的目的基因连接入线性化慢病毒载体,构建重组质粒PGC-FU-fp1并进行... 详细信息

目的:构建含大鼠ferroportin 1(fp1,膜铁转运蛋白1)基因和EGfp(绿色荧光蛋白)基因的过表达慢病毒载体并转染PC12细胞。方法:化学合成含有目的基因fp1的质粒,将酶切获得的目的基因连接入线性化慢病毒载体,构建重组质粒PGC-FU-fp1并进行测序鉴定;鉴定正确的阳性克隆采用Lipofectamine2000转染293T细胞,通过荧光显微镜和Western Blot检测fp1表达情况;在脂质体介导下将PGC-FU-fp1、pHelper1.0和pHelper2.0三质粒系统共转染入293T细胞,包装产生慢病毒,并通过实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。以重组慢病毒载体质粒PGC-FU-fp1转染PC12细胞,荧光显微镜下观察EGfp的表达,实时荧光定量PCR和Western Blot法分别检测fp1mRNA和蛋白表达情况。结果:fp1基因序列经测序后与GeneBank报道的序列完全一致;重组质粒PGC-FU-fp1中携带有正确的fp1基因并能在293T细胞中表达;病毒滴度为2×108TU/ml。荧光显微镜、实时荧光定量PCR和Western Blot法证实目的基因fp1能被重组慢病毒高效导入PC12细胞并得到过表达。结论:成功构建携带fp1基因的慢病毒载体,并获得fp1基因修饰的PC12基因工程细胞。为进一步研究fp1在帕金森病中的作用及基因治疗奠定基础。

关键词： fp1 慢病毒载体转染 PC12细胞大鼠

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大鼠脑出血后二价铁超载与相关转运蛋白的实验性研究

大鼠脑出血后二价铁超载与相关转运蛋白的实验性研究

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作者：金小杰山西医科大学

学位级别：硕士

目的：脑出血（ICH）是脑血管病中的危重类型,以高发病率、高致残率、高死亡率威胁着人类健康。脑出血后迟发性脑损害作为影响此类患者预后的重要因素,其机制复杂且尚未明确。在脑出血血肿形成后,导致迟发性脑损害及严重神经功能缺损的... 详细信息

目的：脑出血（ICH）是脑血管病中的危重类型,以高发病率、高致残率、高死亡率威胁着人类健康。脑出血后迟发性脑损害作为影响此类患者预后的重要因素,其机制复杂且尚未明确。在脑出血血肿形成后,导致迟发性脑损害及严重神经功能缺损的主要原因可能是红细胞溶解后释放到脑组织中的大量铁的蓄积,同时铁代谢相关蛋白的表达也存在异常。本实验通过观察采用ⅣV型胶原酶诱导大鼠脑出血后血肿周围不同时间段二价铁的沉积与二价金属离子转运体1（DMT1）、膜铁转运蛋白1（fpl）之间的关系及时间相关性,探讨Fe2+、DMT1和fp1在铁超载致迟发性脑损害的机制中可能的作用。方法：选用健康SD大鼠52只,雌雄各半,体重250-300g。随机分为ICH组、生理盐水手术对照组和健康对照组,且玉术后1d、3d、7d、14d四个时间点处死。采用Ⅳ型胶原酶诱导制作大鼠脑出血模型,ICH组于苍白球注入2.5μl（含0.5U胶原嗨Ⅳ）生理盐水,生理盐水手术对照组以同体积生理盐水取代。采用铁染色、免疫组化方法观察上述组别及时间段的出血后二价铁沉积、DMT1及fp1的表达。结果：1、肉眼可见出血侧脑组织较对侧明显肿胀,以3-7天最明显。2、铁染色ICH模型第3、7、14组铁沉积较同期手术对照组显著增多,以第14天最多。3、DMT1免疫阳性细胞主要表达达于神经元、胶质细胞和血管内皮细胞。ICH各组DMT1免疫阳性细胞数表达显著增多,以第7天为最告。4、fp1免疫阳性细胞以神经元和胶质细胞的胞膜为主。ICH各组fpl免疫阳性细胞数表达显著增多,且以第7-14天为高峰期。5、二价铁沉积与DMT1、 fpl免疫阳性细胞表达呈显著正相关;fp1的表达与DMT1呈显著正相关。结论：1、采用Ⅳ胶原酶制作大鼠脑出血模型后血肿形成稳定,术后大鼠神经功能缺损明显;2、二价铁超载可能是脑出血后迟发性脑损害的主要因素;3、脑出血后二价铁的超载可能诱导DMT1、fpN的表达：4、DMT1、fp1（?）可能均参与脑出血后二价铁的转运过程。

关键词：脑出血二价铁沉积 DMT1 fp1

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心理应激对大鼠小肠铁吸收的影响及机制研究

心理应激对大鼠小肠铁吸收的影响及机制研究

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作者：陈建波第二军医大学

学位级别：硕士

铁是几乎所有活体中的一种必需元素。在细胞呼吸链电子传递、能量代谢、血红素代谢、氧的运输、细胞信息传递、DNA合成、免疫功能等方面发挥重要作用。大量研究表明,铁缺乏或铁过量都会对机体产生不利影响,因此维持机体铁稳态尤为重要,... 详细信息

铁是几乎所有活体中的一种必需元素。在细胞呼吸链电子传递、能量代谢、血红素代谢、氧的运输、细胞信息传递、DNA合成、免疫功能等方面发挥重要作用。大量研究表明,铁缺乏或铁过量都会对机体产生不利影响,因此维持机体铁稳态尤为重要,机体缺乏有效的铁“排泄机制”,机体铁稳态的维持主要通过肠道铁吸收的精细调控实现。目前对铁吸收的研究机制发现,小肠中有两种主要铁转运体即二价金属离子转运体DMT1和ferroportin1(fpN1)在铁吸收调节方面发挥重要作用。DMT1是一种跨膜蛋白,转运二价铁离子跨越小肠上皮细胞的顶端进入肠细胞,fpN1是位于基底膜上的铁转出蛋白,将铁离子转运进入血液循环。为保证机体的铁平衡,机体需要在铁吸收、利用和储存之间进行协调,在最近几年的研究中发现,Hepcidin(由HAMP基因编码)是铁稳态的一个主要调节因子。Hepcidin是肝细胞分泌的一种循环肽,并通过结合细胞表面的ferroportin而导致ferroportin的内化和降解从而导致铁释放减少。心理应激(psychological stress)是机体通过认识、评价而察觉到应激源的威胁时引起的心理、生理技能改变的过程,是个体对面临的威胁或挑战作出适应和应付的过程。随着社会的发展及各方面竞争压力的增加,来源于社会的精神心理因素的应激对人类健康的影响越来越强烈,并成为重要的应激源。许多研究证实,在心血管疾病、内分泌疾病、神经精神疾病和自身免疫性疾病的发生中心理应激起了重要作用。军人作为一个特殊群体,经常要面对突发性事件,如战争爆发,反恐怖袭击执行特种任务等等,这些特殊情况和特种作业条件都容易诱发军人心理应激反应。前期研究发现,心理应激可引起机体铁代谢紊乱,造成血清铁明显下降、肝细胞铁明显增加。一方面,铁缺乏而引起的最大氧摄入和肌细胞的氧化代谢能力降低,而另一方面,铁过量又会导致大量自由基的产生,故心理应激引起机体铁稳态破坏可影响指战员的健康,进而影响部队作战能力。因此,阐明心理应激血清铁下降和肝脏铁蓄积的发生机制,以及预防和治疗措施,无疑将对防治军人应激损伤产生有积极的意义。因此,我们进行了如下研究: 目的了解心理应激对小肠铁吸收的影响及其机制探讨,为阐明心理应激与血清铁下降的关系以及深入探讨军事应激对机体因铁稳态改变而引起的作战能力的下降提供实验基础,并为防治心理应激导致的低铁血症提供新思路。方法一、心理应激模型的制作采用Communication Box System制作大鼠心理应激模型。Communication BoxSystem由透明丙烯酸板组成,一半小室(A室)底部铺板绝缘,另一半小室(B室)通电。在B室的实验大鼠接受30min/d,足底电击(电压90V,电流0.80mA):电击组大鼠跳跃,尖叫,在A室的实验大鼠通过视觉听觉产生恐惧的心理反应,即为心理应激大鼠模型。 ELISA法测定血清促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(CORT)含量,放免试剂盒测定下丘脑内去甲肾上腺素(NE)含量。二、心理应激对大鼠铁吸收的影响。 (一)实验动物分组雄性SD大鼠(购自上海西普尔-必凯公司),体重(120±10)g。按体重随机分为空白对照组(CG)、心理应激7天组(PSG)和足底电击组(FSG),每组10只。动物饲养实验室环境温度24℃±1℃,湿度50%～60%;使用不锈钢代谢笼具单笼饲养,自由饮食及去离子水,饲料配方为AIN-93G,铁含量为35mg/kg饲料。自然昼夜节律变化光照。 (二)大鼠心理应激模型的制作方法同前。心理应激组连续心理应激7天。 (三)大鼠鼠粮摄入量测定每天更换大鼠鼠粮,使用电子天平精确称量大鼠鼠粮日摄入量。 (四)大鼠粪便收集为使粪便收集齐全,在大鼠从代谢笼中移至心理应激模型中,大鼠单个塑料笼转运。为使粪便收集精确,通过卡红标记粪便(收集两次红色之间的粪便,不包括第二次红色粪便)。 (四)大鼠铁表观吸收率的计算大鼠铁表观吸收率通过经典的代谢平衡法计算,即计算一定时间内的铁摄入量及排泄物铁含量而得,由于尿中铁含量甚微,可忽略不计。因此铁表观吸收率=(摄入铁含量-粪便铁含量)×100%/摄入铁含量。 (五)大鼠小肠Perl’s铁染色各时间段心理应激完成后腹腔注射2%戊巴比妥进行麻醉,暴露胸腔,剪开右心耳,然后迅速经心脏冷PBS冲洗,取小肠组织4%多聚甲醛固定后石蜡切片制成5μm切片用于Perl’s铁染色。三、心理应激对大鼠小肠铁吸收机制的影响 (一)实验动物分组雄性SD大鼠(购自上海西普尔-必凯公司),体重(120±10)g。按体重随机分为空白对照组(CG,n=30)、心理应激1天组(PSG1,n=10)、心理应激3天组(PSG3,n=10)、心理应激7天组(PSG7,n=10)和足底电击组(FSG,n=10)

关键词：心理应激铁表观吸收率 IL-6 DMT1 fp1 Hepcidin

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Hepcidin及LPS对小鼠不同组织铁及铁代谢相关蛋白的影响

Hepcidin及LPS对小鼠不同组织铁及铁代谢相关蛋白的影响

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作者：李静河北师范大学

学位级别：硕士

铁是多种蛋白和酶的重要组成部分，广泛参与机体的代谢过程，如细胞呼吸作用、细胞增殖、细胞信号转导等。因此，铁缺乏将影响多种器官组织的功能，然而过多的铁将催化产生羟基等，引起周围组织的氧化，造成毒性损害。最近，人们发现一... 详细信息

铁是多种蛋白和酶的重要组成部分，广泛参与机体的代谢过程，如细胞呼吸作用、细胞增殖、细胞信号转导等。因此，铁缺乏将影响多种器官组织的功能，然而过多的铁将催化产生羟基等，引起周围组织的氧化，造成毒性损害。最近，人们发现一种由肝产生的抗菌多肽Hepcidin，这种物质可能是人们长期寻找的调节铁稳态的重要激素。Hepcidin缺失的USF2敲除小鼠肝、胰、心脏出现铁超载。与此相反，Hepcidin转基因小鼠则出现严重的铁缺乏。鉴于目前国内外对Hepcidin在炎症和铁代谢调节机理研究的报道较少，我们对注射Hepcidin和引起机体产生炎症的脂多糖(LPS)后，小鼠多种组织铁的代谢情况进行了研究，以期为Hepcidin作为铁调素，以及炎症与铁代谢的密切关系提供实验依据。本实验选用6周龄雄性昆明种小鼠40只，随机分为Hepcidin注射剂量0.1μg组、1μg组、5μg组和生理盐水对照组，尾静脉连续注射5天后取材。采用血液自动分析仪、组织非血红素铁测定方法、免疫组织化学方法分别检测红细胞数量(RBC)、血红蛋白量(HGB)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)，肝、脾、肾非血红素铁含量以及十二指肠、肝、脾的铁转运相关蛋白二价金属离子转运蛋白(DMT1)、膜铁转运蛋白(fp1)的表达。此外，本实验还采用RT-PCR、Western Blot对注射0.1mg／kg体重LPS不同时间后，小鼠肝Hepcidin mRNA，肝细胞特异表达的铁转运蛋白—转铁蛋白受体2(TfR2)的表达变化进行了分析检验，并对上述结果通过北航图象采集分析系统及STAT统计软件进行了统计分析。结果如下： ***对小鼠血液、组织铁、DMT1和fp1表达的影响 1．1 注射Hepcidin后小鼠血常规的变化尾静脉连续注射不同剂量Hepcidin 5天后，小鼠血液中RBC、HGB、HCT、MCV与对照组相比没有显著变化(P＞0.05)，不同剂量组之间也没有显著变化(P＞0.05)。 1．2 注射Hepcidin后小鼠组织铁含量的变化中文摘要里对照组尾静脉注射生理盐水的小鼠肝非血红素铁含量为284.49士39.81，尾静脉连续注射Hepeidin(l“g/天)5天后，肝非血红素铁含量为369.03士36.49，与对照组相比明显增加，差异极显著(尸1);小鼠脾对照组和实验组非血红素铁含量分别为1028.06士60.80和1068.22士70.84，没有显著差异(外0.05);肾对照组和实验组非血红素铁含量分别为291.43士30.62和325.62士26.48，没有显著差异(外0.05)。1 .3免疫组织化学染色测定DMTI、Frl蛋白表达变化本实验结果显示，在小肠，DMTI主要表达在小肠上皮吸收细胞顶端，即纹状缘一侧，基底膜也有表达，但表达量少于纹状缘，而吸收细胞的细胞核则为明显的阴性;DMTI在肝主要表达在肝细胞的胞膜和胞质，细胞核呈阴性;在脾，巨噬细胞有DMTI的明显表达。 fpI在小肠上皮吸收细胞的纹状缘和基底膜均有表达，细胞核没有表达;在肝，胞膜和胞质有表达;在脾，巨噬细胞有fpI的明显表达。尾静脉连续注射HePcidins天后，对免疫组织化学染色统计分析显示，小鼠小肠、肝、脾DMTI、fpI蛋白阳性表达的平均光密度与对照组相比没有显著差异(外0.05)。***对小鼠肝Hepcidin、TfRZ表达的影响2.1注射LPs后不同时间小鼠肝Hepddin mRNA表达的变化。腹腔注射LpS(***/kg体重)后1.5小时，HepeidinmRNA表达最强(p1)，达到注射LPS前的5.3倍;之后有所恢复，注射后6、12小时比1 .5小时降低，但仍高于正常水平(P1);直至18小时恢复到腹腔注射LPS前水平。2.2注射LPS后不同时间小鼠肝TfRZ蛋白表达的变化。腹腔注射LPS(0 .lm叭g体重)后1 .5小时，T吓巴蛋白表达最强(尸1)，达到顶峰;2小时肝T琅2蛋白表达有所恢复(与2小时比较)，但仍高于正常水平

关键词：铁 Hepcidin LPS DMT1 fp1 TfR2

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