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第三军医大学学报 2019年第7期41卷 673-677页

作者：卢丽琴付晓红宋慧东广州市第十二人民医院消化内科广州510000 深圳市南山区人民医院肿瘤科广东深圳518000

目的探究lncRNA GClnc1是否通过SIRT3/foxo3/SOD2调控胃癌细胞增殖和迁移。方法通过转染慢病毒的方法,在人胃癌细胞SGC7901中分别过表达和沉默GClnc1,采用Western blot和qRT-PCR检测SIRT3/foxo3/SOD2 mRNA和蛋白水平的改变;在过表达GCl... 详细信息

目的探究lncRNA GClnc1是否通过SIRT3/foxo3/SOD2调控胃癌细胞增殖和迁移。方法通过转染慢病毒的方法,在人胃癌细胞SGC7901中分别过表达和沉默GClnc1,采用Western blot和qRT-PCR检测SIRT3/foxo3/SOD2 mRNA和蛋白水平的改变;在过表达GClnc1的同时分别沉默SIRT3/foxo3/SOD2,采用CCK-8检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力。结果过表达GClnc1可以上调SIRT3/foxo3/SOD2的mRNA和蛋白水平(P3±2.25,P3/foxo3/SOD2的mRNA和蛋白水平(P3,P3/foxo3/SOD2可以消除过表达GClnc1对细胞增殖和迁移能力的促进作用。结论 GClnc1通过激活SIRT3/foxo3/SOD2信号通路促进SGC7901细胞增殖和迁移。

关键词： GClnc1 胃癌 SITR3 foxo3 SOD2

foxo3在氯化锰致SH-SY5Y神经细胞线粒体自噬中的作用

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FOXO3在氯化锰致SH-SY5Y神经细胞线粒体自噬中的作用

作者：宋冬梅首都医科大学

学位级别：硕士

锰广泛应用于工业生产中如采矿业、金属冶炼、焊接等领域;同时由于含锰防爆剂甲基环戊二烯三羰基锰(Methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl,MMT)代替四乙基铅广泛使用,造成环境中过量锰暴露,对人体健康造成危害。锰化合物颗粒... 详细信息

锰广泛应用于工业生产中如采矿业、金属冶炼、焊接等领域;同时由于含锰防爆剂甲基环戊二烯三羰基锰(Methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl,MMT)代替四乙基铅广泛使用,造成环境中过量锰暴露,对人体健康造成危害。锰化合物颗粒主要通过呼吸道进入人体,极易分布在富含线粒体的组织。脑排出速率较其它器官慢,吸收过量的锰化合物主要引起中枢神经系统病变,表现为帕金森样症状。线粒体是为机体提供能量的主要场所,锰对线粒体有特殊亲和力,可通过阻断线粒体能量转换、增加自由基产量影响线粒体功能,阻碍细胞呼吸,导致线粒体膜电位降低,活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生增加,线粒体损伤。随着对帕金森疾病研究的不断深入,已有研究证明线粒体损伤是锰引起帕金森疾病的重要机制之一。线粒体自噬作为线粒体质量控制的首要过程,参与MnCl致SH-SY5Y神经细胞自噬。有文献报道,转录因子foxo3调控线粒体自噬相关蛋白表达,但其是否参与MnCl致SH-SY5Y神经细胞线粒体自噬过程及其可能的调控机制尚不清楚。本研究利用MnCl染毒具有多巴胺能神经元特性的细胞系神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),确定MnCl最适染毒剂量,在250μM MnCl染毒下观察不同时间的线粒体自噬发生情况;并通过检测线粒体功能指标如线粒体膜电位、线粒体内ROS产量;通过慢病毒si RNA沉默foxo3基因(si foxo3)实现foxo3低表达,探讨foxo3在线粒体自噬发生中的分子机制。***致SH-SY5Y细胞毒性的剂量效应关系将SH-SY5Y神经细胞分别暴露于250、500、1000μM MnCl染毒24 h,通过MTT法检测MnCl对细胞的毒性作用。结果表明,随着染毒浓度的增加,细胞存活率呈明显的下降趋势。于250μM MnCl处细胞存活率为84.3%±2.2%。各染毒组细胞存活率与对照组相比差别均具有统计学差异(P3%,12 h细胞存活率3发生明显的LC3-Ι向LC3-II转变。Beclin-1在4 h处表达量达到最大,6 h处有所降低。p62蛋白作为自噬降解底物随着时间的增加表达量逐渐减少。***致SH-SY5Y细胞线粒体损伤将SH-SY5Y神经细胞暴露于250μM MnCl分别染毒2、4、6 h,运用流式细胞术的方法,利用激光共聚焦、Image J软件观察、分析。结果显示,线粒体膜电位随着染毒时间的增加逐渐降低,线粒体受损。利用Mito SOX标记线粒体内活性氧产量,结果显示线粒体内活性氧聚集,并呈明显的时间依赖效应。表明过量MnCl可引起SH-SY5Y神经细胞线粒体的损伤。***3在MnCl致SH-SY5Y细胞线粒体自噬中的表达SH-SY5Y神经细胞暴露于250μM MnCl分别染毒2、4、6 h,利用蛋白印迹法对线粒体相关蛋白进行检测。结果显示,LC3-II/LC3-I、Beclin-1、PINK1蛋白在NC+Mn组暴露于250μM MnCl作用6 h后,表达明显上升(Pfoxo3+Mn组暴露于250μM MnCl作用6 h后其表达明显低于NC+Mn组,与共聚焦结果一致。说明foxo3低表达对线粒体自噬起抑制作用。***3在MnCl致SH-SY5Y细胞线粒体自噬中的核滞留将SH-SY5Y神经细胞暴露于250μM MnCl分别染毒2、4、6 h,蛋白印迹法分别对细胞核、细胞质中foxo3蛋白进行检测。核中foxo3与对照组相比表达在6 h处达到峰值。相反,细胞质表达量随时间增加逐渐降低。表明MnCl在诱导自噬的过程中促进foxo3核滞留。提示在MnCl致SH-SY5Y神经细胞线粒体自噬过程中细胞核foxo3参与并起重要作用。此外,线粒体自噬标志性蛋白PINK1、P

关键词：锰线粒体自噬 SH-SY5Y神经细胞 foxo3 神经毒性

Geminin调控foxo3乙酰化修饰的机理研究

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Geminin调控FoxO3乙酰化修饰的机理研究

作者：蔡美贞厦门大学

学位级别：硕士

Geminin是一种定位于核内的多功能小分子蛋白,在胚胎发育、神经分化、维持基因组稳定性、细胞增殖及肿瘤发生等过程都发挥重要作用。Geminin通过与Cdtl相互作用抑制DNA的重复复制,保证在一个细胞周期内DNA仅被复制一次;在不同的发育阶... 详细信息

Geminin是一种定位于核内的多功能小分子蛋白,在胚胎发育、神经分化、维持基因组稳定性、细胞增殖及肿瘤发生等过程都发挥重要作用。Geminin通过与Cdtl相互作用抑制DNA的重复复制,保证在一个细胞周期内DNA仅被复制一次;在不同的发育阶段作为抑制因子或者诱导因子参与胚胎发育的调节;通过与同源异形盒蛋白Six3及Hox等相互作用分别对眼睛发育及胚胎发育起调节作用。HDAC3作为Rpd3/Hadl去乙酰化酶家族的一员,它调控组蛋白赖氨酸残基去乙酰化。同时,HDAC3的去乙酰化酶活性需要通过与其他蛋白相互作用形成多亚基复合物,从而调控靶蛋白上特定位点的基因转录沉默或激活。但是HDAC3如何通过不同辅因子特异性调控高度同源的转录因子家族成员至今研究尚不深入。我们的研究发现了一个与foxo3相互作用的新蛋白—Geminin。在细胞中单独敲低Geminin或HDAC3都会上调foxo3的乙酰化水平,但同时敲低Geminin和HDAC3,foxo3的乙酰化水平并不会进一步增加,说明HDAC3和Geminin是共同调控foxo3的乙酰化修饰。进一步研究发现,HDAC3能够与Geminin直接相互作用,但HDAC3并不能与foxo3直接相互作用,通过两轮免疫共沉淀发现Geminin、HDCA3和foxo3在同一个复合物中,共定位于细胞核。本论文揭示了 Geminin作为一个支架蛋白介导HDAC3对foxo3的乙酰化修饰。

关键词： Geminin HDAC3 foxo3 去乙酰化

MiR-223-3p对结直肠癌中foxo3的调控研究

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MiR-223-3p对结直肠癌中FOXO3的调控研究

作者：舒密昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的](1)利用RT-PCR技术比较和分析结直肠癌粘膜组织与癌旁正常结直肠粘膜组织中miR-223-3p表达的差异性;用western blot技术比较和分析结直肠癌粘膜组织与癌旁正常结直肠粘膜组织中FOX03表达的差异性。(2)通过在线靶基因软件预测miR-2... 详细信息

[目的](1)利用RT-PCR技术比较和分析结直肠癌粘膜组织与癌旁正常结直肠粘膜组织中miR-223-3p表达的差异性;用western blot技术比较和分析结直肠癌粘膜组织与癌旁正常结直肠粘膜组织中FOX03表达的差异性。(2)通过在线靶基因软件预测miR-223-3p的靶基因为FOX03,然后通过克隆FOX03基因3’ UTR,并通过定点突变和双荧光素酶实验证明miR-223-3p靶向FOX03。(3)在Caco2细胞中,通过敲低miR-223-3p提高FOX03蛋白表达;过表达miR-223-3p抑制FOX03蛋白的表达,证明miR-223-3p是可通过调控FOX03在结直肠癌的发生发展中起重要作用,可作为结直肠癌诊治的重要的分子生物学标志和治疗新靶点,初步探讨miR-223-3p在转录后水平调控FOX03表达机制,为探寻结直肠癌的发生发展的研究提供科学基础。[方法](1)收集10组结直肠癌粘膜组织和相应的癌旁正常结直肠粘膜组织,利用RT-PCR技术比较和分析结直肠癌粘膜组织与癌旁正常结直肠粘膜组织中miR-223-3p表达的差异性;用western blot技术比较和分析结直肠癌粘膜组织与癌旁正常结直肠粘膜组织中FOX03表达的差异性,实验组别包括结直肠癌粘膜组织组、癌旁正常结直肠粘膜组织组。纳入研究的患者都己在知情同意书上签字,未有肿瘤史及手术史,未有放化疗及其他免疫生物治疗史。(2)采用在线预测靶基因软件预测miR-223-3p的靶基因,初步选择的靶基因为FOX03,然后通过克隆FOX03基因3’ UTR和通过定点突变和双荧光素酶实验证明miR-223-3p与FOX03的相关性。(3)在Caco2细胞中,通过敲低miR-223-3p和过表达miR-223-3p检测FOX03的表达水平,初步探讨miR-223-3p在转录后水平调控FOX03表达机制。[结果](1)RT-PCR技术实验结果显示:miR-223-3p的表达水平在结直肠癌粘膜组织中较相应的癌旁正常结直肠粘膜组织中显著增加,差异有统计学意义(P3的表达水平在结直肠癌的粘膜组织中较相应的癌旁正常结直肠粘膜组织中的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P3)采用在线靶基因软件预测miR-223-3p的靶基因可能为FOX03,然后通过克隆FOX03基因3’ UTR、定点突变和双荧光素酶结果显示.:miR-223-3p可以显著下调野生型FOX03报告基因质粒的荧光素酶活性,但是不能下调突变型FOX03报告基因质粒的荧光素酶活性,以上结果进一步说明,miR-223-3p靶向FOX03基因;(4)在Caco2细胞中过表达miR-223-3p后,能够显著增加miR-223-3p的水平,与转染miR-NC相比,miR-223-3p具有降低FOX03蛋白水平的趋势;敲低miR-223-3p,能够显著降低 miR-223-3p 的水平,与转染 antagomiR-NC 相比,antagomiR-223-3p 具有提高FOX03蛋白水平的趋势,但均未达到显著性。[结论](1)miR-223-3p在结直肠癌粘膜组织中表达显著上调,FOX03在结直肠癌粘膜组织中表达显著下调;(2)miR-223-3p可通过靶向FOX03基因参与调控结直肠癌的发生发展;(3)miR-223-3p作为结直肠癌诊断和治疗的分子生物学标志物和治疗新靶点具有较高价值,为探索结直肠癌的发生发展的研究提供科学基础。

关键词：结直肠癌 miR-223-3p foxo3 分子学标志物治疗靶点

鸡miR-223靶向foxo3调控鸡毒支原体感染的机制研究

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鸡miR-223靶向FOXO3调控鸡毒支原体感染的机制研究

作者：尹勋华中农业大学

学位级别：硕士

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是引起鸡慢性呼吸道疾病的主要病原菌,给家禽产业造成巨大的经济损失。许多研究表明mi RNAs在疾病的发生发展中起关键作用。MG-HS是课题组从湖北分离得到的强毒株,感染鸡胚,通过高通量测序发现,... 详细信息

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是引起鸡慢性呼吸道疾病的主要病原菌,给家禽产业造成巨大的经济损失。许多研究表明mi RNAs在疾病的发生发展中起关键作用。MG-HS是课题组从湖北分离得到的强毒株,感染鸡胚,通过高通量测序发现,MG-HS能够显著抑制gga-mi R-223的表达。因此,本研究以gga-mi R-223为对象,探究其在MG-HS感染中的作用及分子机制。主要研究结果如下:***-q PCR检测MG-HS感染的鸡胚模型和DF-1细胞模型中gga-mi R-223的相对表达量,结果显示,鸡胚感染后第4d、6d、8d的肺组织及DF-1细胞中gga-mi R-223的表达量均显著低于正常组(pfoxo3为gga-mi R-223的靶基因。通过RNAhybrid软件发现gga-mi R-223与foxo3 3’UTR严格碱基互补配对,且靶序列在不同物种间高度保守。双荧光素酶报告系统分析显示,细胞中过表达gga-mi R-223能显著抑制野生型靶基因foxo33’UTR荧光素酶活性(p3能显著抑制DF-1细胞中foxo3 m RNA及蛋白的相对表达量(p3能显著提高细胞中foxo3 m RNA及蛋白的相对表达量(pfoxo3是gga-mi R-223的直接靶基因,且为负调控关系。3.动物和细胞试验表明,MG-HS感染后第4d、6d、8d的鸡胚肺组织中foxo3m RNA的相对表达量均显著高于正常组(pfoxo3m RNA及蛋白的相对表达量均显著高于正常组(p3的表达相反。进一步说明在MG-HS感染中,gga-mi R-223通过靶向foxo3起作用。4.在MG-HS感染的DF-1细胞中,过表达或抑制gga-mi R-223,通过CCK8、流式细胞仪检测细胞增殖、周期和凋亡。结果表明,MG-HS感染能显著抑制DF-1细胞增殖,阻滞细胞周期进程,促进细胞凋亡(p3能显著促进MG-HS感染细胞的增殖,促进细胞周期进程,使大量G1期细胞进入S和G2期,显著抑制细胞凋亡,而抑制gga-mi R-223显著抑制感染细胞的增殖,上调G1期细胞的比例,促进细胞凋亡(p3能显著促进周期标记基因CDK1、CDK6和CCND1的表达(p3抑制后结果与过表达恰好相反。当DF-1细胞中敲低靶基因foxo3时,上述周期基因及凋亡基因的表达与过表达gga-mi R-223的结果一致。揭示MG-HS诱导gga-mi R-223下调表达,通过靶向foxo3,抑制周期基因CDK1、CDK6和CCND1的表达,促进凋亡基因BIM、FASLG、TRAIL的表达,从而抑制感染细胞的增殖,促进细胞的凋亡。

关键词：鸡毒支原体鸡 gga-miR-223 foxo3

姜曲海猪foxo3 基因组织表达和多态性与肉质关联分析

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河南农业科学 2021年第10期50卷 124-131页

作者：朱淑斌倪黎纲陈章言张君胜周春宝赵秀玲江苏农牧科技职业学院江苏泰州225300 姜曲海猪保种场江苏泰州225300

为研究姜曲海猪foxo3基因组织表达和遗传多态性与肉质性状的关联性,采用PCR-SSP分子标记技术,分析了112头姜曲海猪foxo3基因第二外显子的遗传变异情况,利用实时荧光定量PCR检测姜曲海猪心脏、肝脏、脾脏、肾脏、腹脂、皮下脂肪、背最长... 详细信息

为研究姜曲海猪foxo3基因组织表达和遗传多态性与肉质性状的关联性,采用PCR-SSP分子标记技术,分析了112头姜曲海猪foxo3基因第二外显子的遗传变异情况,利用实时荧光定量PCR检测姜曲海猪心脏、肝脏、脾脏、肾脏、腹脂、皮下脂肪、背最长肌、比目鱼肌、腓肠肌和半腱肌中foxo3基因的表达量。姜曲海猪foxo3基因第二外显子500 bp位点存在多态性,得到TT、CC及TC 3种基因型,T基因频率为0.424,表现为中度多态(PIC=0.369);试验猪群的基因频率和基因型频率都处于哈迪温伯格平衡状态(P>0.05);分析不同基因型对肉质性状的影响,foxo3基因第二外显子多态性与猪肌内脂肪含量、剪切力性状关联显著。foxo3基因在姜曲海猪10个组织中均有表达,foxo3基因与肌纤维直径和肌内脂肪含量呈负相关,与肌纤维密度和剪切力呈正相关,但相关性均不显著(P>0.05)。foxo3基因与腓肠肌肌原纤维直径相关系数分别为-0.937,与背最长肌肌节长度的相关系数为-0.874。综上,foxo3基因对姜曲海猪肉质性状发育有一定的影响,可作为肉质性状候选基因进行深入研究。

关键词：姜曲海猪 foxo3 基因 PCR-SSP 肉质性状基因表达

黄芩苷通过foxo3/CCL22信号通路调控结外NK/T细胞淋巴瘤细胞生长的机制研究

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中国实验血液学杂志 2023年第3期31卷 730-738页

作者：段晓晖李宏吕垚刘静王世雄吴振天王冰璇卢铭王健红梁蓉陕西中医药大学第二临床医学院陕西西安712046 空军军医大学第一附属医院血液内科陕西西安710032

目的:探讨黄芩苷对结外NK/T细胞淋巴瘤(ENKTCL)细胞生长的影响及相关机制。方法:培养正常NK细胞及人ENKTCL细胞株SNK-6和YTS,分别采用5、10、20μmol/L的黄芩苷处理SNK-6和YTS细胞并设置对照,EdU法检测细胞增殖,FCM法检测细胞凋亡,Weste... 详细信息

目的:探讨黄芩苷对结外NK/T细胞淋巴瘤(ENKTCL)细胞生长的影响及相关机制。方法:培养正常NK细胞及人ENKTCL细胞株SNK-6和YTS,分别采用5、10、20μmol/L的黄芩苷处理SNK-6和YTS细胞并设置对照,EdU法检测细胞增殖,FCM法检测细胞凋亡,Western blot检测BCL-2、Bax、foxo3和CCL22蛋白的表达;设计并合成干扰质粒,采用PEI转染试剂对foxo3 siRNA干扰质粒和CCL22 pcDNA过表达质粒进行转染,建立动物模型并进行验证。结果:对照组和5、10、20μmol/L黄芩苷处理组SNK-6细胞的增殖率分别为(56.17±2.96)%、(51.92±4.63)%、(36.42±1.58)%、(14.60±2.81)%,各组YTS细胞的增殖率分别为(58.85±2.98)%、(51.38±1.32)%、(34.75±1.09)%、(15.45±1.10)%,各组SNK-6细胞的凋亡率分别为(5.93±0.74)%、(11.78±0.34)%、(28.46±0.44)%、(32.40±0.37)%,各组YTS细胞的凋亡率分别为(7.93±0.69)%、(16.29±1.35)%、(33.91±1.56)%、(36.27±1.06)%。与对照组相比,SNK-6和YTS细胞中BCL-2蛋白表达水平均明显降低(Pfoxo3蛋白表达降低,CCL22蛋白表达升高(Pfoxo3蛋白表达增高(Pfoxo3蛋白的表达水平较对照组上升(Pfoxo3沉默会导致foxo3蛋白表达下降和CCL22蛋白表达增高(Pfoxo3介导下调CCL22表达;动物实验发现黄芩苷可抑制肿瘤生长;黄芩苷可通过foxo3/CCL22信号通路调控抑制ENKTCL细胞的生长并诱导其凋亡。

关键词：黄芩苷 foxo3 巨噬细胞来源的趋化因子结外NK/T细胞淋巴瘤

Nanog、foxo3和circ-foxo3分别在急性髓系白血病中的表达及临床意义

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Nanog、Foxo3和circ-Foxo3分别在急性髓系白血病中的表达及临床意...

作者：周娇江苏大学

学位级别：硕士

目的:许多研究者认为Nanog基因是一种癌基因,促进肿瘤的发生、发展,因此我们将研究Nanog基因在诊断急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的价值,以及在患者标本中的表达水平及与患者的临床预后的关系。此外,除研究癌基因与AML关... 详细信息

目的:许多研究者认为Nanog基因是一种癌基因,促进肿瘤的发生、发展,因此我们将研究Nanog基因在诊断急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的价值,以及在患者标本中的表达水平及与患者的临床预后的关系。此外,除研究癌基因与AML关系外,是否存在一种抑癌基因,可以抑制肿瘤的进展而影响患者的总体预后,foxo3基因被大多数研究者认为是长寿基因、抑癌基因,因此我们研究了foxo3及其环状RNA(circ-foxo3)对AML的诊断价值,并通过检测它们在AML中的表达、分析两者的相关性,从而研究两者对AML患者生存预后的影响。方法:一、我们收集了大量AML患者的骨髓标本,使用Ficoll分离出AML患者和健康供体的单个核细胞,用Trizol试剂从单个核细胞中分离总RNA,使用随机引物将总RNA逆转录成c DNA。利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Q-PCR)检测了Nanog在146例初诊AML样本、31例健康对照样本;使用感受性曲线(ROC)来判断Nanog对AML的诊断价值,并以此区分急性髓细胞性白血病患者与健康对照者。通过Kaplan-Meier生存分析研究Nanog对AML病人的生存预后的影响。二、同样的方法检测了foxo3在122例初诊AML样本、30例健康对照样本以及五种细胞株中的表达;检测了circ-foxo3在117例初诊AML样本、24例健康对照样本及五种细胞株中的表达;利用上述同样的方法检测了foxo3及其circ-foxo3在初诊AML患者中的表达,此外利用Pearson相关分析研究foxo3和circ-foxo3表达之间的相关性。结果:因检测Nanog、foxo3和circ-foxo3具有时间先后性,且标本库内的标本数量处于动态波动中,因此检测每一种基因或环状RNA时的标本量均不相同。以下分别为两组研究结果:一、146例AML患者Nanog基因表达水平呈明显上调趋势,与31例健康人对照组相比,有明显的统计学差异(P=0.01);Nanog高、低表达组与初诊AML患者的性别、年龄、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、骨髓原始细胞比例、FAB分型上无显著性差异,与多种基因突变也无明显差异,高表达Nanog主要出现在非低危患者组(P=0.027)。通过ROC曲线分析可知,Nanog对AML患者具有诊断价值,其ROC曲线下面积为0.644(95%置信区间:0.556～0.731;P=0.012),敏感性和特异性分别为46.9%和87.1%,以截止值0.324将AML患者分为高表达组及低表达组。经COX多因素分析后,Nanog低表达及白细胞计数是影响AML患者预后的独立危险因素。实验组患者的总中位随访时间约为7个月,高表达组的生存时间趋势较低表达组长(P=0.484)。非M3患者中,低表达组患者的生存时间较高表达组患者趋势短(P=0.126);在非低危组患者中,Nanog高表达组患者生存时间明显比低表达组患者生存时间长(P=0.031)。二、(1)122例AML患者中foxo3表达水平呈明显上调趋势,与30例健康人对照组相比(Pfoxo3对AML患者具有诊断价值,其ROC曲线下面积为0.655(95%置信区间:0.556～0.753;P=0.009),敏感性和特异性分别为44.7%和87.7%,以截止值0.856将AML患者分为高表达组及低表达组。经COX多因素分析后,foxo3低表达是影响AML患者预后的独立危险因素,染色体危险度分型和年龄为影响AML患者预后的独立危险因素。实验组患者的总中位随访时间约为10个月,高表达组的生存时间趋势长于低表达组(P=0.192)。非M3组、非低危组及染色体正常组,高表达foxo3的患者生存时间长于低表达患者,P值分别为0.002、0.004、0.034,差异具有统计学意义。(2)117例AML患者中circ-foxo3表达与24例健康人相比呈低表达水平(P=0.04),高、低表达组在患者的性别、年龄、白细胞计数、血红蛋白量、血小板计数、原始细胞比例、染色体分型中的差异无统计学意义,在WHO分型及七种常见的基因突变中也无统计学差异。通过ROC曲线分析可知,Nanog对AML患者具有诊断价值,其ROC曲线下面积为0.633(95%置信区间:0.523～0.742;P=0.041),敏感性和特异性分别为62.1%和75%,以截止值0.233将AML患者分为高表达组及低表达组。COX多因素分析显示circ-foxo3、白细胞计数、血红蛋白量,原始细胞比例、染色体分型

关键词： Nanog foxo3 circ-foxo3 急性髓系白血病预后生物学标志

长期染烟BEAS-2B细胞的组蛋白乙酰化修饰及foxo3基因调控细胞增殖与凋亡机制研究

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长期染烟BEAS-2B细胞的组蛋白乙酰化修饰及FOXO3基因调控细胞增殖...

作者：张佳玉苏州大学

学位级别：硕士

目的:以香烟烟雾对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)进行长期染毒,检测其整体组蛋白乙酰化状态改变,在染烟细胞组蛋白H3K9乙酰化状态差异改变的基因中筛选并验证其中的foxo3基因,进一步分析foxo3基因在香烟烟雾引起的细胞增殖及凋亡改变中的... 详细信息

目的:以香烟烟雾对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)进行长期染毒,检测其整体组蛋白乙酰化状态改变,在染烟细胞组蛋白H3K9乙酰化状态差异改变的基因中筛选并验证其中的foxo3基因,进一步分析foxo3基因在香烟烟雾引起的细胞增殖及凋亡改变中的作用机制。目的是深入探讨吸烟致肺癌的发病机制,为肺癌的临床诊断、治疗及预后提供新的理论基础。方法:利用实验室前期建立的长期香烟烟雾暴露细胞模型,用Western Blot检测各染毒组细胞组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)及组蛋白H3K9乙酰化蛋白(A-H3K9)的表达;生物信息学分析染烟后组蛋白异常乙酰化基因;荧光实时定量PCR和Western Blot检验染烟及组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对foxo3表达的影响;CCK8方法检测细胞增殖率;流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡;检测caspase3/7活性及Bax/Bcl-2比率分析细胞凋亡通路活化状态;细胞慢病毒转染进行foxo3过表达,CCK8及caspase3/7活性方法检测转染foxo3慢病毒后细胞的增殖及凋亡状态;Western Blot检测染烟及JNK通路抑制剂(JNKi)处理对foxo3及其磷酸化蛋白表达的影响;荧光实时定量PCR和Western Blot检测染烟及转染foxo3慢病毒对foxo3下游预测靶基因的mRNA和蛋白表达影响。结果:(1)Western Blot结果显示染烟细胞中HDAC1表达上调,A-H3K9表达下调,基因组表现组蛋白H3K9低乙酰化,并主要富集到PTEN dependent cell cycle arrest and apoptosis和PI3K-Akt signaling pathway两条功能通路中,其中foxo3基因启动子区组蛋白低乙酰化,并且mRNA和蛋白水平随着染烟程度增加下降;TSA处理后,染烟各代细胞中的foxo3表达出现不同程度的回复,提示染烟细胞中foxo3基因的低表达可能是由组蛋白H3K9低乙酰化导致的。(2)细胞周期及细胞增殖实验结果显示,染毒各代细胞周期的G1期比例减少,S期比例增加,细胞周期缩短,增殖速度加快;细胞凋亡、caspase3/7活性及Bax/Bcl-2表达比例提示染烟可导致细胞凋亡通路抑制、凋亡减少。在对照组及染烟组转染foxo3慢病毒后,细胞增殖减缓,凋亡通路活化。结果提示,长期染烟细胞中可能是由foxo3基因介导了细胞的恶性增殖及凋亡抑制。(3)在染烟细胞中,foxo3及JNK磷酸化蛋白表达降低;细胞进行JNK抑制剂处理后,未染烟组细胞foxo3及JNK磷酸化蛋白表达降低,染烟组细胞则表现进一步降低。同时,染烟细胞中细胞增殖与凋亡相关的Fas L、Bim、TRAIL、P21基因的mRNA及蛋白表达呈现不同程度的下降;在对照组及染烟组转染慢病毒过表达foxo3后,Fas L、Bim、P21基因的表达呈现不同程度的回复及上升。结果提示,在染烟细胞中,JNK/foxo3/FasL、Bim、P21通路的抑制,可能是香烟烟雾致细胞增殖及凋亡改变的重要原因。结论:长期暴露香烟烟雾上调支气管上皮细胞HDAC1表达,导致组蛋白H3K9低乙酰化,从而下调foxo3表达;同时香烟烟雾抑制细胞内JNK通路,限制foxo3蛋白转录功能,进而抑制下游靶基因FasL、Bim、P21的转录与表达,促进支气管上皮细胞的增殖,抑制细胞凋亡,有助于肺癌的发生、发展。

关键词：肺癌组蛋白乙酰化细胞增殖细胞凋亡 foxo3