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大肠杆菌0157：H7呼吸系统调控蛋白fnr对三型分泌系统调控的研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2012年第12期32卷 1043-1046页

作者：徐雪芳阎泽军熊衍文徐建国中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206 UniversityofEdinburgh DepartmentofMolecularPlantSciencesRoom1.06DanielRutherfordBuildingKingsBuildingsMayfieldRoadEdin-burgh.Postcode:EH93JH

目的了解大肠杆菌0157：H7fnr（fumarate nitrate reduction，富马酸硝酸盐还原）对三型分泌系统（type Ⅲ secretion system，T3SS）表达的影响。方法本研究采用kRed重组技术，利用PCR产物，通过Bet（a ssDNA annealing protein，ssDNA退火蛋白）和Exo（a5’-3’dsDNA exonuclease，5’-3’dsDNA外切酶）蛋白促进同位交换的方法，成功构建了．—矿突变株。结果虽然细胞黏附结果显示，与野生株相比，缺失株的黏附力并没有明显下降。但是T3SS的蛋白图谱显示．加突变株中蛋白分泌量有明显下降。结论推测可能是fnr基因敲除后导致高浓度的ClpXP（caseinolytic proteaseX＆P，酪蛋白水解酶X＆P）引起GrlA（global regulator of LEE activator）蛋白的降解，从而导致LEE（locus of enteroeyte effacement）表达的下降，造成T3SS蛋白分泌量的下降。

关键词：大肠杆菌O157 H7 fnr T3SS

全局调控因子fnr对产肠毒素大肠杆菌生物学特性影响的研究

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中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 977-983页

作者：杨延毛曌江丰伟李干武中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为研究全局调控因子富马酸盐和硝酸盐减少调控蛋白(fnr)对产肠毒素大肠杆菌(ETEC)生物学特性的影响,本研究通过Red同源重组方法构建了ETEC MD724-020菌株fnr基因的缺失株Δfnr及回补株Δfnr(pfnr),分别将ETEC野生株(WT)、Δfnr以及Δfnr... 详细信息

为研究全局调控因子富马酸盐和硝酸盐减少调控蛋白(fnr)对产肠毒素大肠杆菌(ETEC)生物学特性的影响,本研究通过Red同源重组方法构建了ETEC MD724-020菌株fnr基因的缺失株Δfnr及回补株Δfnr(pfnr),分别将ETEC野生株(WT)、Δfnr以及Δfnr(pfnr)同时接种于TSB液体培养基培养,测定fnr基因缺失前后ETEC的生长曲线,结果显示,与野生株相比,缺失fnr基因后其生长速率无明显变化。将3株菌分别接种于TSB固体培养基,通过测定游走直径比较分析野生株、缺失株和回补株的运动性,结果显示,与野生株相比,缺失株Δfnr的运动能力显著降低(Pfnr(pfnr)株,缺失株Δfnr BF形成能力极显著下降(Pfnr(pfnr)株,Δfnr株溶血圈较野生株显著缩小。将3株菌分别与猪小肠上皮细胞IPEC-J2互作2 h后,通过平板计数法分析各菌株对该细胞的黏附能力,结果显示,与野生株相比,缺失株Δfnr对IPEC-J2细胞的黏附能力显著减弱(Pfnr基因缺失后对致病性ETEC相关毒力基因转录水平的影响,结果显示,与野生株相比,Δfnr株中eaeH、eltA和hlyA基因的转录水平均极显著下降(Pfnr影响ETEC的运动性、溶血性、BF形成能力等生物学特性进行了研究,为进一步开展ETEC致病机理的研究提供了参考依据。

关键词：产肠毒素大肠杆菌 fnr 生物学特性

fnr转录因子定向进化提高大肠杆菌对乙醇和丁醇的耐受性

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FNR转录因子定向进化提高大肠杆菌对乙醇和丁醇的耐受性

作者：朱森康浙江工业大学

学位级别：硕士

大肠杆菌是目前基因工程的模式菌株和最为常用的外源蛋白原核表达系统。然而菌体常常需要在一些不利的环境中培养,各种代谢产物的积累会严重抑制重组菌的生长。对菌体进行有效改造,提高大肠杆菌对不利环境条件的忍耐性和适应性已成为微... 详细信息

大肠杆菌是目前基因工程的模式菌株和最为常用的外源蛋白原核表达系统。然而菌体常常需要在一些不利的环境中培养,各种代谢产物的积累会严重抑制重组菌的生长。对菌体进行有效改造,提高大肠杆菌对不利环境条件的忍耐性和适应性已成为微生物技术应用所需解决的一个重要问题。微生物性状的改变是体内多基因转录水平变化所导致的宏观反映,全局转录因子fnr直接或间接的调控着大肠杆菌细胞内大多数基因的表达。本研究以提高大肠杆菌对乙醇和丁醇的耐受性为目标,通过定向进化大肠杆菌全局转录因子fnr,从而直接或间接的调控菌体在全基因组规模上的转录水平,并采用有效的高通量筛选策略,得到性状改良的菌株。首先从大肠杆菌基因组中克隆fnr的编码基因,以pUC18质粒为载体,构建pUC18-fnr operon质粒。另外为模拟原始菌株中转录因子在基因组上转录表达的情况,以低拷贝数pSK质粒为载体,构建含fnr操纵子的pSK-fnr operon质粒。为提高低拷贝数pSK-fnr operon质粒转化大肠杆菌的转化效率,对高效大肠杆菌感受态细胞制备和电转化条件进行了优化,条件包括摇瓶装液量,菌体生长时期,转化电场强度以及转化后复苏时间,最终质粒转化效率达到10 cfu/μg DNA,连接产物电转化达到105以上个转化子的转化效率,满足了下一步实验的要求。以构建好的pUC18-fnr operon质粒为模板,摸索易错PCR反应条件,确定突变率后通过易错PCR方法对fnr基因进行突变。突变基因替换低拷贝数pSK-fnr operon质粒中未突变基因,通过电转化方法导入E. coli DH5α,并分别在一定浓度乙醇或丁醇条件下进行筛选,获得乙醇或丁醇耐受性分别有一定程度提高的突变菌株。

关键词：大肠杆菌转录因子 fnr 定向进化乙醇耐受性丁醇耐受性

鼠伤寒沙门菌减毒株△arcA△fnr△fliC的构建与疫苗潜力评价

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鼠伤寒沙门菌减毒株△arcA△fnr△fliC的构建与疫苗潜力评价

作者：侯宇龙四川农业大学

学位级别：硕士

沙门菌可以引发多种动物的胃肠道疾病,给养殖业和公共卫生造成重大威胁。随着抗生素耐药问题日益严重,研制高效的新型减毒疫苗是必要的。本研究通过自杀质粒介导的同源重组的方法,构建了一株鼠伤寒沙门菌AarcA△fnr△fliC减毒株,并在小... 详细信息

沙门菌可以引发多种动物的胃肠道疾病,给养殖业和公共卫生造成重大威胁。随着抗生素耐药问题日益严重,研制高效的新型减毒疫苗是必要的。本研究通过自杀质粒介导的同源重组的方法,构建了一株鼠伤寒沙门菌AarcA△fnr△fliC减毒株,并在小鼠模型上评估了它的免疫原性和保护效果。1鼠伤寒沙门菌突变株的构建和鉴定本研究以鼠伤寒沙门菌ATCC14028为基础菌株,以调控基因arcA、fnr及鞭毛蛋白基因fliC为靶基因,通过自杀质粒介导的同源重组的方法构建了单基因突变株△arcA、△fnr、△fliC、双基因突变株△arcA△fnr和三基因突变株△arcA△fnr△fliC。经PCR鉴定靶基因被成功缺失。利用甲苯胺蓝固体培养基、M9低盐固体培养基及半固体LB培养基对各突变株的生长状况、泳动能力进行鉴定,结果证实,arcA、fnr突变导致菌株在相应平板上的生长受限以及fliC突变导致菌株运动能力显著下降,这表明各突变株被成功构建。2鼠伤寒沙门菌突变株部分生物学特性及毒力测定本研究对所构建的五株突变株进行部分生物学特性及毒力测定。结果显示,各突变株的体外生长曲线与野生株相似。arcA、fnr、fliC基因缺失会使细菌丧失运动能力,各突变株相比于野生株,其运动能力均显著降低。同时,小鼠感染试验证实,相比野生株,△fnr、△arcA△fnr、△arcA △fnr△fliC体内定殖能力显著下降;同时仅△arcA△fnr△fliC的半数致死量(LD50)显著升高,为1.3×109 CFU,是野生株LD50的接近104倍,其余突变株的毒力变化微弱。3鼠伤寒沙门菌△arcA△fnr△fliC免疫原性及保护效果评价本研究将△arcA△fnr△fliC以108CFU、107CFU两种剂量口服免疫小鼠,免疫两次,间隔28天,评估这一突变株的免疫原性和免疫保护效力。同时设置Acrp突变株阳性对照组(109CFU)和BSG阴性对照组。结果表明,同BSG组相比,△arcA △fnr△fliC两剂量组、Acrp组均产生高水平的血清IgG和粪便IgA抗体应答,血清IgG2a水平高于IgG1。同时血清杀菌实验证实各菌株免疫组二免后血清均能有效杀伤鼠伤寒沙门菌ATCC14028。进一步地,鼠伤寒沙门菌强毒株致死剂量攻毒后△arcA△fnr△fliC 108CFU剂量组、107CFU剂量组、Acrp组在派伊尔结、肝脏、脾脏的细菌载量均显著低于BSG组,同时分别提供87.5%、75%及完全的免疫保护。综上,本研究成功构建五株鼠伤寒沙门菌ATCC14028突变株,其中△arcA△fnr△fliC毒力高度减弱,并具有一定的免疫原性和较高的保护力。

关键词：鼠伤寒沙门菌 arcA fnr fliC 毒力免疫原性保护效果

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基于fnr调控的莱茵衣藻光控产氢研究

基于FNR调控的莱茵衣藻光控产氢研究

作者：周泽娜深圳大学

学位级别：硕士

氢气作为一种理想的可替代能源,具有燃烧热值高、清洁、可再生等优势,其开发与利用受到广泛关注。在众多产氢有机体中,由于绿藻氢酶活性高、培养条件简单、生长速度快等,绿藻产氢被视为最具应用前景的生物制氢途径。本研究以单细胞真核... 详细信息

氢气作为一种理想的可替代能源,具有燃烧热值高、清洁、可再生等优势,其开发与利用受到广泛关注。在众多产氢有机体中,由于绿藻氢酶活性高、培养条件简单、生长速度快等,绿藻产氢被视为最具应用前景的生物制氢途径。本研究以单细胞真核绿藻——莱茵衣藻为材料,构建了fnr沉默藻株amiR-fnr,在此基础上建立其蓝光诱导调控fnr表达系统,获得工程藻株amiR-fnr-B并应用于衣藻持续制氢研究,具体研究结果如下:第一部分内容是利用ami RNA技术,构建fnr沉默载体pDp124-amiR-fnr,该载体使用PsaD基因的启动子启动amiRNA表达,带巴龙霉素抗性标签,通过珠磨法转化入莱茵衣藻CC-849,筛选并验证获得转化子amiR-fnr。qPCR结果显示,相比于野生型CC-849,amiR-fnr的fnr表达量下调了32%,至此,成功获得fnr缺陷藻株。气相色谱结果显示amiR-fnr 7天的总产氢量是野生型的5倍;利用Phyto-PAM检测藻细胞叶绿素荧光参数,结果显示amiR-fnr的最大光合效率(Fv/Fm)比野生型下调了12.8%,实际光合效率(Yield)下调了16.4%,相对电子传递速率(ETR)下调了16.4%,光化学淬灭参数(qP)下调了25.6%,表明敲降fnr影响了衣藻光合效率;气相色谱结果显示培养瓶中amiR-fnr顶空氧气占比量比野生型CC-849显著性偏低,最低仅为9.1%,比野生型低了41%;qPCR结果显示,相比于野生型,amiR-fnr的氢酶编码基因HydA1的相对表达量提高了84%,HydA2提高了75%;铁氧还原酶(Fd)的亚基Fdx5表达水平相较于野生型提高了16.76倍,表明amiR-fnr细胞内形成了厌氧环境,诱导了Fdx5高表达,Fd的电子接收中心PetF相对表达量提高了87%,说明敲降fnr有利于提高电子从Fd传向氢酶的活性,促进衣藻产氢;检测了细胞对数期前期的淀粉含量,结果显示,amiR-fnr较野生型的淀粉量多了42%,表明敲降fnr有利于衣藻前期淀粉的积累,利于衣藻通过分解淀粉产生电子的间接途径,为H合成提供底物。为了回补ami R-fnr的光合效率以调控衣藻产氢,第二部分内容是在fnr缺陷藻株的基础上构建蓝光诱导调控fnr表达系统。首先构建能表达fnr蛋白的A载体(pDh124-VP16-CRY2-USA-fnr),蓝光诱导表达系统所需的B载体(pDb124-GAL4 BD-CIB1)为本实验室构建并保存。将A载体和B载体经两次珠磨法转化入amiR-fnr中,筛选并验证获得光控转化子amiR-fnr-B。检测藻株在白光诱导前后fnr的表达情况,qPCR结果显示,相比于红光培养,amiR-fnr-B在白光诱导2小时后fnr上调了47.2%,说明白光条件实现了fnr在amiR-fnr-B藻中的诱导表达,再将藻重新转移回红光条件下培养3小时后,fnr相比于白光诱导的结果下调了63.7%,提示ami R-fnr-B在红光条件下fnr停止诱导表达,并在内源amiRNA的作用下,fnr开始下调表达,而野生型和amiR-fnr无显著性变化,说明amiR-fnr-B具有光调控fnr表达的功能。通过在白光和红光条件下交替培养amiR-fnr-B,结果显示,白光培养3天至对数生长期时,检测到amiR-fnr-B的初始产氢量要比ami R-fnr低,经过“红光8 h—白光12 h—红光8 h”交替培养后,amiR-fnr-B的总产氢量比amiR-fnr提高了19%,比野生型CC-849提高了3倍,差异显著,提示光调控fnr表达促进了衣藻持续高效产氢。综上,该蓝光调控莱茵衣藻fnr表达系统在细胞内反应可逆、无毒害,操作简单方便,通过不同光质的间断诱导,实现了衣藻在白光下诱导表达fnr以回补光合同化效率,在红光下沉默fnr以进行产氢的循环运作,解决了衣藻细胞持续放氢的理论和技术瓶颈问题,为绿藻生物制氢技术及产业发展提供了新的技术途径。

关键词：莱茵衣藻 fnr 生物制氢光控系统 amiRNA

克雷伯杆菌中fnr蛋白三级结构模建及二聚作用研究

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克雷伯杆菌中FNR蛋白三级结构模建及二聚作用研究

作者：李霞青岛科技大学

学位级别：硕士

克雷伯杆菌作为一种兼性菌，通过自身氧气调控系统的控制，在厌氧和有氧条件下均可以进行1,3-丙二醇、2,3-丁二醇等化学品的生产，对其氧气调控机理的研究也逐渐引起了人们的关注。fnr是克雷伯杆菌中一种重要的氧气调控蛋白，它通过感... 详细信息

克雷伯杆菌作为一种兼性菌，通过自身氧气调控系统的控制，在厌氧和有氧条件下均可以进行1,3-丙二醇、2,3-丁二醇等化学品的生产，对其氧气调控机理的研究也逐渐引起了人们的关注。fnr是克雷伯杆菌中一种重要的氧气调控蛋白，它通过感应O2的变化来改变自身的活性。在厌氧条件下，fnr蛋白以活性二聚体状态存在，并与DNA结合，抑制或促进目的基因的表达，从而改变其胞内代谢途径。在有氧条件下，fnr蛋白的活性消失，二聚体状态变成单体状态。目前，fnr蛋白的氧气调控机理还不十分清楚，因此，fnr分子结构的建立及其二聚作用的分析将对氧气调控机理的研究具有积极的推动作用。首先，利用同源模建的方法，以CRP蛋白和核酸内切酶为模板，构建了克雷伯杆菌中fnr蛋白单体的三级结构。对所建出的三级结构模型经过分子力学和分子动力学模拟达到了平衡，采用PROCHECK、ERRAT、Verify-3D和PROSA程序进行结构合理性评估，证实所构建的fnr蛋白单体的模型是合理的。其次，通过PPI-Pred服务器结合界面分析预测了fnr单体蛋白界面残基，采用分子对接方法得到fnr二聚体模型，进一步对其进行结构优化和动力学模拟，得到其最佳构象。最后，对最佳构象进行静电相互作用、疏水相互作用、氢键作用及相互作用能分析，发现疏水相互作用和氢键是驱动fnr蛋白二聚体稳定存在的主要因素。通过Robetta服务器进行丙氨酸突变扫描分析发现，在厌氧条件下，Arg140、Met144、Arg145、Met147、Glu150、Ile151、Ile158为热点残基，可以促进fnr蛋白的二聚作用。Gln141、Ile152、Gln155、Met157、Leu159、Leu161、Ser162位氨基酸残基对二聚作用稳定性的影响比较小;Ser148和Asp154位氨基酸会抑制fnr蛋白的二聚作用。

关键词： fnr 同源模建分子动力学分子对接二聚作用

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fnr—Ⅰ核磁共振波谱仪

波谱学杂志 1983年第0期 27-34页

作者：张一德潘太光岳兴铭孙秋萍葛世慧毕庶桂黄怡康李发伸兰州大学

基于自旋回波的原理研制成功了一台专用于分析磁性材料的核磁共振波谱仪。其工作频率为25—80MHz;输出功率10W,可用它在77—300°k范围测量铁磁材料的共振谱线,增强因数和自旋—自旋弛豫时间T2;它也可用于测量非磁性固体的宽核磁共振谱线。

关键词：自旋回波发射机电子设备电磁脉冲射频脉冲 fnr 传感器波谱仪回波信号相敏检波器接收机灵敏度

fnr影响高产乙醇肺炎克雷伯菌产乙醇能力及转录组分析

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遵义医科大学学报 2024年第5期47卷 447-453页

作者：范政李周霏刘洪伯陈雨晨付彤彤袁静首都儿科研究所细菌学研究室北京100020 北京协和医学院研究生院北京100730

目的探究fnr基因缺失对高产乙醇肺炎克雷伯菌产乙醇能力的影响,并对野生型菌株与Δfnr缺失菌株进行转录组测序分析。方法以高产乙醇肺炎克雷伯菌株TH1为背景,利用温敏型质粒介导的同源重组技术构建fnr基因的缺失菌株。PCR扩增并克隆fnr... 详细信息

目的探究fnr基因缺失对高产乙醇肺炎克雷伯菌产乙醇能力的影响,并对野生型菌株与Δfnr缺失菌株进行转录组测序分析。方法以高产乙醇肺炎克雷伯菌株TH1为背景,利用温敏型质粒介导的同源重组技术构建fnr基因的缺失菌株。PCR扩增并克隆fnr基因于pGEM-Teasy表达载体获得回补质粒,导入Δfnr缺失菌株得到回补株,并将pGEM-Teasy空质粒导入野生株及缺失株作为空载对照。通过顶空法检测基因fnr缺失对高产乙醇肺炎克雷伯菌株乙醇产量的影响。并对野生型菌株和Δfnr缺失菌株进行转录组测序,筛选差异表达基因并进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。结果通过PCR技术明确fnr基因缺失与回补菌株构建成功。乙醇含量测定结果显示基因fnr缺失后,高产乙醇肺炎克雷伯菌株的乙醇产量显著降低,且回补菌株的乙醇产量显著升高。转录组测序结果表明基因fnr缺失后561个基因表达上调,610个基因表达下调。KEGG富集分析结果表明,上调基因主要富集在包括氨基酸代谢、嘧啶代谢、三羧酸循环等通路,下调基因中富集到了包括氧化磷酸化、丙酮酸代谢、双组份系统、磷酸转移酶系统(PTS)、生物被膜形成、糖酵解/糖异生等通路。结论fnr基因的缺失显著降低了高产乙醇肺炎克雷伯菌株的乙醇产量,且全局性调控因子fnr能够正向促进糖酵解通路,抑制三羧酸循环通路。

关键词：肺炎克雷伯菌 fnr 基因敲除乙醇

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星际迷航雪佛兰fnr概念车

轿车情报 2015年第7期 36-37页

作者：陈杰

年轻的雪佛兰拥有天马行空的想法，他们最擅长于开发概念车，而且雪佛兰玩的概念总是相当超前，如果是第一眼见到它，你都不敢相信呈现在你眼前的是一辆车。

关键词：雪佛兰概念车 fnr 迷航星际