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实时荧光定量PCR检测急性髓系白血病患者flt3基因的表达水平及意义

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中华检验医学杂志 2008年第10期31卷 1173-1175页

作者：徐兵唐家宏宋小燕周淑芸胡斌南方医科大学南方医院血液科广州510515 解放军第一五五医院血液科中山大学达安基因诊断中心

flt3（fms-like tyrosine kinase 3 ）基因是近年来发现的具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体基因，它与flt3配体结合能诱导受体自主磷酸化，并通过各种细胞浆相关蛋白的传导激活信号而对造血发育过程起重要的调节作用。目前研究发现，2... 详细信息

flt3（fms-like tyrosine kinase 3 ）基因是近年来发现的具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体基因，它与flt3配体结合能诱导受体自主磷酸化，并通过各种细胞浆相关蛋白的传导激活信号而对造血发育过程起重要的调节作用。目前研究发现，20％左右急性髓系白血病（AML）患者出现flt3基因近膜区框架内的串联重复（flt3／ITD）突变，具有flt3／ITD突变的AML患者预后差，

关键词：急性髓系白血病 flt3基因荧光定量PCR检测白血病患者 flt3/ITD flt3配体胞浆相关蛋白受体基因

flt3基因3′-非翻译区-荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定

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中国实验血液学杂志 2010年第3期18卷 694-697页

作者：高晓宁林季李永辉王莉莉于力解放军总医院血液科北京100853 解放军总医院基础医学所生化室北京100853

为分析FMS样酪氨酸激酶3(FMS-liketyrosine kinase3,flt3)基因3′-非翻译区(3′-untranslated region,3′-UTR)可能的微小RNA(miRNA)调控位点,构建flt3基因3′-UTR-荧光素酶报告载体,与miRNA共转染293T细胞,分析miRNA对其调控作用。采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增flt3基因3′-UTR区序列,插入经PstI和EcoRI双酶切的经过改造的荧光素酶报告载体pGL3-control(pGL3-control-m);通过Target Scan5.1软件预测可能与flt3基因3′-UTR作用的miRNA;采用FuGENEHD转染试剂包裹荧光素酶报告重组子和miRNA真核表达载体共转染293T细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。结果表明,成功构建了含有804bp的flt3基因3′-UTR序列的荧光素酶报告重组子,通过酶切和基因测序的方法鉴定正确;miRNA靶位点预测显示,flt3基因3′-UTR可能是miRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-16、miRNA-195、miRNA-424、miRNA-497的作用靶点;与对照组相比,miRNA-15a、15b、195可使荧光素酶报告重组子的荧光素酶活性降低20%左右。结论:成功构建了flt3基因3′-UTR-荧光素酶报告载体,而miRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-195可抑制其荧光素酶活性。

关键词： flt3基因 microRNA 3’-非翻译区荧光素酶报告载体基因调控基因转染

双重PCR检测急性髓系白血病flt3-ITD和NPM1基因突变

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中国实验血液学杂志 2011年第3期19卷 717-720页

作者：张泽川鹿全意赵江宁陈亚玫李志鹏福建医科大学教学医院(厦门中山医院) 福建厦门361004 福建医科大学厦门大学生命科学院福建厦门361000

本研究旨在建立一种同时筛查flt3-ITD突变和NPM1突变的检测方法。设计2对引物,分别扩增NPM1基因的外显子12和flt3基因的外显子14、内含子14、外显子15,以覆盖几乎所有已知突变位点。对双重PCR体系的反应程序和引物浓度比例进行优化,将双... 详细信息

本研究旨在建立一种同时筛查flt3-ITD突变和NPM1突变的检测方法。设计2对引物,分别扩增NPM1基因的外显子12和flt3基因的外显子14、内含子14、外显子15,以覆盖几乎所有已知突变位点。对双重PCR体系的反应程序和引物浓度比例进行优化,将双重PCR产物通过毛细管电泳分离,根据野生型产物和突变型产物的大小差异来判断突变存在与否并利用产物的峰面积对突变比例进行定量,并对突变阳性标本进行测序验证。结果表明,在93例标本中NPM1突变者17例(18.5%),flt3-ITD突变者15例(16.3%),NPM1突变和flt3-ITD突变双阳性6例。17例NPM1突变中7例M2、4例M4、5例M5、1例M6,其中10例男性、7例女性;有15例为A型,1例为B型,1例为Nm型;有1例CML急变为AML的标本中带有NPM1基因A型突变。15例flt3-ITD阳性中1例M1、8例M2、2例M3、1例M4、3例M5,其中5例男性、10例女性。扩增产物测序结果进一步证明了该检测体系的准确性和可靠性。结论 :建立了同时筛查flt3-ITD突变和NPM1突变的检测体系,该体系以基因组DNA为模板,具有方便、快捷、准确、可定量的优点。

关键词：白血病 NPM1基因 flt3基因内部串联重复毛细管电泳

PCR-SSCP检测急性髓系白血病患者flt3基因及flt3/ITD基因突变

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中国实验诊断学 2009年第8期13卷 1090-1092页

作者：黄晶刘力华张玲刘民谭岩吉林大学第一医院检验科吉林长春130021

目的研究急性髓系白血病(AML)患者DNA水平flt3基因及其内部串联重复(ITD)突变。方法采用多聚酶链反应(PCR)联合单链构象多态性(SSCP)方法检测43例不同免疫分型AML患者DNA水平flt3基因及flt3/ITD基因突变。结果43例AML患者经PCR扩增,琼... 详细信息

目的研究急性髓系白血病(AML)患者DNA水平flt3基因及其内部串联重复(ITD)突变。方法采用多聚酶链反应(PCR)联合单链构象多态性(SSCP)方法检测43例不同免疫分型AML患者DNA水平flt3基因及flt3/ITD基因突变。结果43例AML患者经PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳flt3基因检测全部阳性,未发现flt3/ITD基因突变;SSCP电泳flt3基因检测全部阳性,43例AML患者中有15例(35%)出现flt3/ITD基因突变。结论PCR-SSCP适用于检测急性髓系白血病flt3/ITD基因突变分析。

关键词：急性髓系白血病 flt3基因 flt3/ITD基因突变多聚酶链反应

PCR分析急性淋巴细胞白血病患者flt3基因及flt3/ITD基因突变

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中华微生物学和免疫学杂志 2003年第12期23卷 978-979页

作者：徐兵周淑芸李冰林榕第一军医大学南方医院血液科广州510515

目前研究发现约30%急性非淋巴细胞白血病（ANLL）患者flt3基因近膜区发生内部串联重复（ITD）突变，称为flt3/ITD基因突变，该突变与ANLL的预后存在密切关系。为进一步研究急性淋巴细胞白血病（ALL）患者flt3基因及flt3/ITD基因突变，采... 详细信息

目前研究发现约30%急性非淋巴细胞白血病（ANLL）患者flt3基因近膜区发生内部串联重复（ITD）突变，称为flt3/ITD基因突变，该突变与ANLL的预后存在密切关系。为进一步研究急性淋巴细胞白血病（ALL）患者flt3基因及flt3/ITD基因突变，采用PCR技术分析63例ALL患者DNA水平flt基因及flt3/ITD基因突变。

关键词： PCR分析急性淋巴细胞白血病 flt3基因 flt3/ITD 基因突变

急性白血病患者PRAME基因的表达及其与flt3基因比较的临床意义

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急性白血病患者PRAME基因的表达及其与FLT3基因比较的临床意义

作者：王丹蕾郑州大学

学位级别：硕士

目的：现代联合化疗方案使急性白血病的诱导缓解率显著提高,但达骨髓完全缓解后白血病复发仍是阻碍患者长期无病生存(DFS)的主要原因。研究发现,微小残留病与白血病复发密切相关。微小残留病是指临床缓解的白血病患者体内能检测到的微... 详细信息

目的：现代联合化疗方案使急性白血病的诱导缓解率显著提高,但达骨髓完全缓解后白血病复发仍是阻碍患者长期无病生存(DFS)的主要原因。研究发现,微小残留病与白血病复发密切相关。微小残留病是指临床缓解的白血病患者体内能检测到的微量白血病细胞。由于传统形态学检测的敏感性较低,目前临床缓解标准(骨髓原始细胞基因在急性白血病患者中的表达,探讨该基因的临床意义及其作为MRD检测标靶的可行性。材料和方法： 1．研究对象为119例急性白血病患者,均为河南省人民医院2009年2月至2009年12月门诊或住院初诊患者,诊断标准参照FAB协作组制定的标准。其中男71例(59.7%),女48例(40.3%),中位年龄30岁(2—78岁);包括AML97例(M2 38例,M3 24例,M4 18例,M5 15例,M6 2例),ALL 22例。对照组28例(正常健康人11例,非恶性肿瘤患者17例)。实验过程中严格设立内参照(GAPDH)及空白对照(去离子水,即无模板)。应用基于TaqMan探针的实时荧光定量RT-PCR技术检测患者PRAME mRNA的表达,并与flt3 mRNA的表达相比较。采用相对定量法分别分析急性白血病患PRAME、flt3者基因与正常人相比的差异表达倍数,靶基因的差异表达倍数=2-△△Ct。其中△△Ct=△CtQ-△CtC。△CtQ为患病组靶基因的Ct值与管家基因的Ct值之差;△CtC为对照组靶基因的Ct值与管家基因的Ct值之差。参照文献,当样本与阴性样本的差异表达倍数大于10时为阳性表达。 2.采用SPSS10.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,2组间比较采用t检验,率的比较采用卡方检验,p36.4%(8/22例)。ALL与AML组表达阳性率相比,差异无统计学意义(χ2=12.72,p=0.097>0.05)。 2.flt3在急性白血病中的表达 flt3在各种类型白血病中均有表达,而在正常人骨髓中均未见阳性表达。flt3 mRNA在急性白血病的相对表达量为对照组的18.64倍(t=5.28,p=0.0003.35,p=0.39>0.05)。 3. PRAME在正常人及非恶性肿瘤患者中的表达 11例正常人及17例非恶性肿瘤患者中有5例测得有PRAME mRNA微量表达,其相对表达量为部分对照组(即从28例整体对照组中除去此5例有微量表达者的余下23例)的1.37倍(t=2.06,p=0.0000.05),故仍归入整体对照组,不认为是阳性表达。 4.患者治疗前后比较短期跟踪9例PRAME、flt3均阳性患者,以实时荧光定量RT-PCR检测所有患者经过化疗达完全缓解后,PRAME表达均有不同程度的下降且其中5例患者复发时PRAME基因又呈上升趋势。9例跟踪患者初诊时相对表达量为治疗后相对表达量的15.67倍(t=2.63,p=0.007基因在正常人及非恶性肿瘤患者中不表达,在急性白血病患者中阳性表达,且表达水平随病情变化而变化。 2. PRAME基因与flt3基因的检出结果有关联,作为MRD的检测,前者可作为后者的补充。

关键词：急性白血病基因 MRD PRAME基因 flt3基因实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

荧光定量PCR检测急性髓细胞白血病flt3基因表达及其临床意义

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荧光定量PCR检测急性髓细胞白血病FLT3基因表达及其临床意义

作者：唐家宏第一军医大学

学位级别：硕士

研究背景：急性白血病是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。骨髓中异常的白血病细胞大量增殖并侵润各种器官、组织，正常造血受抑制。急性髓细胞白血病(AML)具有高度异质性。在过去的几十年间，随着化疗方案以及支持治疗的... 详细信息

研究背景：急性白血病是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。骨髓中异常的白血病细胞大量增殖并侵润各种器官、组织，正常造血受抑制。急性髓细胞白血病(AML)具有高度异质性。在过去的几十年间，随着化疗方案以及支持治疗的改善，AML的治疗效果有了显著的提高，但这种疗效的提高总体上说仍有限，相当一部分病人最终死于此病。因此，需要对AML生物学特征更好的理解，分子特征更好的界定，病理发病机制更好的阐明，从而更好的区分AML的亚群，探索包括靶向治疗在内的新的治疗措施，才能使疗效得到进一步改善。 AML中的一些特定染色体异常，如t(15，17)，t(8，21)，inv(16)／t(16;16)，t(11q23)，del(15q)，-7，3q等的发生率及意义已经明确。目前AML亚群最有意义的分类就是根据白血病细胞的这些核型异常确定其危险度。由此所确立的三个细胞遗传学分组(高危组，中危组，低危组)被广泛接受并用于临床。但这种分型也有其局限性，它将无特定染色体异常患者全部归入中危组，而此组病人占所有AML 50％左右，包含不同临床特征和预后，只有进一步对这部分病人进行精细分群，才有可能制定分层治疗，以进一步提高疗效。因此，有必要深入研究正常核型AML预后相关的基因异常。 flt3基因主要表达于造血干细胞以及脑、胎盘和肝脏，在骨髓中限制性表达于CD34+细胞。在骨髓中，由基质细胞产生的flt3配体(FL)以膜结合型和可溶型的方式，和flt3相互作用，单独或联合其他细胞因子，刺激造血干细

关键词：急性髓细胞白血病实时荧光定量PCR flt3基因 flt3/ITD基因突变

骨髓增生异常综合征患者flt3基因及flt3/ITD基因突变的检测及价值

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广东医学 2003年第11期24卷 1186-1188页

作者：徐兵徐晓兰周淑芸孟凡义第一军医大学南方医院血液科广州510515

目的　研究骨髓增生异常综合征 (MDS)患者DNA水平flt3基因及flt3 /ITD基因突变情况。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)联合单链构象多态性 (SSCP)分析 3 6例MDS患者flt3基因及flt3 /ITD基因突变。结果　 3 6例MDS患者中 9例 ( 2 5 %)flt3... 详细信息

目的　研究骨髓增生异常综合征 (MDS)患者DNA水平flt3基因及flt3 /ITD基因突变情况。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)联合单链构象多态性 (SSCP)分析 3 6例MDS患者flt3基因及flt3 /ITD基因突变。结果　 3 6例MDS患者中 9例 ( 2 5 %)flt3基因检测阳性 ,难治性贫血伴原始细胞增多 (RAEB)、慢性粒单细胞白血病和转变中的RAEB(RAEBT)组flt3基因检测阳性率显著高于难治性贫血 (RA)和环形铁粒幼细胞性难治性贫血 (RAS)组 (P flt3基因检测阳性MDS转化为急性髓性白血病 (AML)时间显著短于flt3检测阴性患者 (P 3 6例MDS患者中有 2例 ( 5 6%)出现flt3 /ITD基因突变 ,RAEB及RAEBT各 1例。结论　部分MDS患者可检测出flt3基因表达和flt3基因突变 ,flt3基因及flt3

关键词：骨髓增生异常综合征 flt3基因 flt3/ITD基因基因突变检测

应用变性高效液相色谱方法研究急性白血病flt3、DCK基因突变

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应用变性高效液相色谱方法研究急性白血病FLT3、DCK基因突变

作者：彭娟红福建医科大学

学位级别：硕士

目的对急性白血病患者的脱氧胞苷激酶(deoxycytine kinase, DCK)和flt3(Fms-like tyrosine kinase3)基因进行基因突变检测,以明确急性白血病患者的DCK和flt3基因突变情况,并观察基因突变的临床意义。方法1、采用RT-PCR方法分析116例急... 详细信息

目的对急性白血病患者的脱氧胞苷激酶(deoxycytine kinase, DCK)和flt3(Fms-like tyrosine kinase3)基因进行基因突变检测,以明确急性白血病患者的DCK和flt3基因突变情况,并观察基因突变的临床意义。方法1、采用RT-PCR方法分析116例急性髓系白血病(AML)患者flt3基因外显子14和15中内部串联重复(internal tandem duplications,ITD)突变情况。2、应用变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC)-异源双链分析(heteroduplex analysis)对160例急性白血病患者(其中初治病例82例,复发病例78例)DCK基因的编码序列及116例AML患者的flt3基因第11号外显子到第24号外显子之间的序列进行基因突变筛查,对疑有突变的PCR扩增片段进行DNA测序,以明确突变位点及类型。结果 1、DCK基因检测:有5例患者(初治2例,复发3例)DHPLC峰型异常,测序证实其编码序列的(第3号外显子)第523位核苷酸C/T杂合突变,导致第122位的脯氨酸(P)被丝氨酸(S)取代。这个位点突变目前为止未见文献报道。复发3例中2例均已化疗两个疗程仍未缓解,1例死亡。初治2例中1例化疗一个疗程后未完全缓解出院,1例为门诊病人没有追踪到。因资料不完整,这些数据还不足以表明其与临床的关联性。 2、flt3基因检测:(1)ITD检测:116例患者中有108例(93.10 %) flt3基因表达检测阳性,25例(21.56%)flt3-ITD阳性,其中10例M1中2例、29例M2中4例、22例M3中3例、54例M5中16例阳性。flt3-ITD阳性组患者外周血白细胞数高于阴性组(P<0.05)。(2)点突变检测:14例(12.07%)患者13号外显子的DHPLC图谱异常,都为同一峰型,选取其中7例测序证实为第1740位核苷酸A/G杂合突变,

关键词： DCK基因 flt3基因急性白血病变性高效液相色谱突变