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fkS06结合蛋白12.6通过钙调蛋白依赖通路促成失血性休克大鼠早期血管高反应性形成

中华实验外科杂志 2016年第1期33卷 58-62页

作者：周荣丁小丽刘良明第三军医大学大坪医院野战外科研究所第二研究室创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042

目的观察失血性休克早期大鼠肠系膜上动脉平滑肌fkS06结合蛋白12.6（fkBP12.6）是否参与对失血性休克血管反应性的调节及可能的信号通路。方法采用SD大鼠（雌雄各半，体质量200—220g）建立失血性休克[40mmHg（1mmHg=0，133kPa）]早期... 详细信息

目的观察失血性休克早期大鼠肠系膜上动脉平滑肌fkS06结合蛋白12.6（fkBP12.6）是否参与对失血性休克血管反应性的调节及可能的信号通路。方法采用SD大鼠（雌雄各半，体质量200—220g）建立失血性休克[40mmHg（1mmHg=0，133kPa）]早期（30min）及晚期（2h）模型；采用离体器官张力测定技术检测失血性休克后不同时相大鼠肠系膜上动脉主干对缩血管物质去甲肾上腺素（NE）的收缩反应性；采用Western blot技术检测失血性休克不同时相大鼠肠系膜上动脉平滑肌钙调蛋白（CaM）的表达及其分布；采用免疫共沉淀联合Western blot技术检测CaM-雷诺定受体2（RyR2）复合子形成。结果在失血性休克早期CaM从肌浆网RyR2解离，肌球蛋白轻链20（MLC20）磷酸化明显升高且呈钙／钙调蛋白依赖激酶Ⅱ（CaMKⅡ）依赖性（P〈0．01），外周血管对NE的收缩反应性显著增强，NE累积量-效曲线明显左移，1×10^-5mol／LNE诱导最大收缩（Emax）由（0．79±0．08）g升至（1．05±0．12）g（P〈0．05）；外源性重组fkBP12.6可明显抑制CaM从RyR2解离，抑制休克早期MLC20磷酸化及外周阻力血管对NE的收缩反应性，表现为NE累积量-效曲线明显右移，1×10^-5mol／LNE诱导最大收缩（Emax）由（1．05±0．12）g降至（0．58±0．08）g（P〈0．05）。结论fkBP12.6通过耦联CaM通路参与失血性休克早期血管高反应性的形成。

关键词：失血性休克血管反应性 fk506结合蛋白12.6 钙调蛋白

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脂筏聚集及其与CaSR，fkBP12.6的共定位在哮喘细胞因子所致气道上皮细胞钙振荡中的作用

脂筏聚集及其与CaSR，FKBP12.6的共定位在哮喘细胞因子所致气道上...

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作者：何会华中科技大学

学位级别：硕士

钙振荡(calcium oscillation)是胞浆游离钙的一种较为普通的运动形式,有着很重要的生物学意义,参与体内许多生理病理反应。支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性气道炎症性疾病,与多种炎性细胞及炎症介质有关。气道上皮细胞是气道炎症的主要... 详细信息

钙振荡(calcium oscillation)是胞浆游离钙的一种较为普通的运动形式,有着很重要的生物学意义,参与体内许多生理病理反应。支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性气道炎症性疾病,与多种炎性细胞及炎症介质有关。气道上皮细胞是气道炎症的主要效应细胞,参与介导气道内各种炎性细胞的生存、趋化和活化。Th2类细胞因子白介素-13(IL-13)、白介素-4(IL-4)在哮喘的发生、发展过程中发挥了重要作用。IL-13是体内上皮细胞增生和黏液过度分泌的主要调节者。IL-4在哮喘发生的各个环节均起着重要的作用。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是哮喘炎症过程中重要的启动因子,可诱导一系列细胞因子的产生。本研究用这三种细胞因子刺激气道上皮细胞,研究哮喘细胞因子所致的气道上皮细胞钙振荡的变化及其机制。脂筏由丰富的鞘脂、胆固醇和酰化的蛋白质动态聚集而成,形成相对稳定的具有一定功能的筏结构漂浮于二维流动的细胞脂膜中。在信号转导中发挥重要的作用,可能也参与钙信号传导过程。fk506结合蛋白12.6(fkBP12.6)是免疫抑制蛋白超家族的主要成员,具有对内质网钙释放通道RyR2的稳定作用。钙敏感受体(calcium sensing receptor,CaSR)属G蛋白偶联受体家族,通过感受细胞外钙的变化而调节机体Ca2稳态。推测脂筏形成及其与fkBP12.6和CaSR的相互作用可能参与哮喘细胞因子引起的气道上皮细胞钙振荡的调控。目的本研究通过检测哮喘细胞因子IL-4,IL-13,TNF-α所致人气道上皮细胞(human bronchial epithelial cell, HBE)的钙振荡变化,脂筏(lipid rafts)在细胞因子刺激后的聚集,及fkBP12.6、CaSR与脂筏的共定位,研究脂筏与fkBP12.6,CaSR在哮喘细胞因子引起的钙振荡中的作用。以探讨脂筏在哮喘发病机制中的作用,为临床预防和治疗哮喘提供新的思路和实验依据。方法 1.分别用10ng/mlIL-4、IL-13和TNF-α处理人气道上皮细胞15min,用钙荧光指示剂FLUO-4标记后在激光共聚焦显微镜下检测胞浆内荧光强度的动态变化反映胞浆内游离钙的动态变化。观察细胞因子处理后,10μM组胺刺激引起的胞浆内游离钙的动态变化。 2.细胞因子处理后固定细胞,用CaSR或fkBP12.6多克隆抗体进行免疫荧光染色,用Alexa Fluor488结合的霍乱毒素-B染色检测脂筏形成,在激光共聚焦显微镜下检测脂筏与fkBP12.6或CaSR的共定位。 3.用FilipinⅢ抑制脂筏形成,检测细胞因子处理后组胺刺激引起的胞浆内游离钙的动态变化。结果 1. 10ng/mlIL-4处理气道上皮细胞后,组胺诱发的钙振荡频率加快,振幅变小。检测到脂筏聚集明显,分别和fkBP12.6, CaSR有共定位。IL-4处理使CaSR核内分布明显减少,胞浆和胞膜的分布明显高于胞核,fkBP12.6蛋白主要表达于胞浆,而IL-4处理使fkBP12.6核内分布明显增多。 2. 10ng/ml IL-13处理即诱发细胞发生钙振荡,再加入组胺刺激未诱发钙振荡。脂筏聚集不明显,CaSR核内分布明显减少,胞浆和胞膜的分布明显高于胞核。fkBP12.6的细胞内分布未发生明显改变。 3. 10ng/ml TNF-α处理后,组胺刺激未诱发细胞钙振荡。检测到脂筏聚集明显,并与fkBP12.6和CaSR有共定位。CaSR的细胞内分布未发生明显改变,fkBP12.6核内分布明显增多。 ***处理抑制脂筏形成后,组胺刺激未诱发细胞钙振荡,IL-4和TNF-α处理后组胺刺激也未诱发钙振荡。结论哮喘细胞因子IL-4作用于气道上皮细胞后,使组胺诱发的钙振荡频率加快,可能是脂筏与CaSR的联合作用,加快了钙信号的传导。IL-13处理引起的细胞钙振荡可能与CaSR的细胞内分布改变有关,与脂筏无关。

关键词：脂筏钙振荡细胞因子气道上皮细胞 fk506结合蛋白12.6 钙敏感受体

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超声微泡介导转染fkBP12.6基因对心衰犬心功能及心肌病理的影响

超声微泡介导转染FKBP12.6基因对心衰犬心功能及心肌病理的影响

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作者：王逵第三军医大学

学位级别：硕士

背景和目的:研究发现,多种病理状态下的心肌细胞特征性地表现为兴奋-收缩耦联的诸多异常。2型雷尼丁受体(RyR2)是肌浆网(SR)上钙释放通道,心衰时RyR2通道缺陷造成心肌舒缩功能障碍及心律失常等问题,而fk506结合蛋白12.6(KBP12.6)的蛋白... 详细信息

背景和目的:研究发现,多种病理状态下的心肌细胞特征性地表现为兴奋-收缩耦联的诸多异常。2型雷尼丁受体(RyR2)是肌浆网(SR)上钙释放通道,心衰时RyR2通道缺陷造成心肌舒缩功能障碍及心律失常等问题,而fk506结合蛋白12.6(KBP12.6)的蛋白水平及其与RyR2受体的亲和力下降是RyR2通道缺陷的一个重要原因。体外研究表明,fkBP12.6过表达可以纠正RyR2通道缺陷,减少Ca2+外漏,增加Ca2+瞬变,提高胞浆Ca2+浓度,增强心肌收缩,因此有可能作为治疗心肌功能异常的靶标。超声造影技术的不断发展和可携带基因的微泡声学造影剂的研制,使得超声已经从一种临床诊断工具,进入到治疗领域。超声波破坏含靶基因的微泡造影剂定位释放技术,是一种新型的基因定向转染技术,该技术使用的微泡直径小于8μm,含基因表达载体,微泡通过肺循环到达相应组织后,利用诊断超声增加特定组织的微血管通透性,使靶基因可通过微血管和内皮细胞间隙到达实质细胞内。国外的研究结果表明,超声波破坏微泡可使基因的转染效率和表达明显提高。本课题通过快速起搏造成犬心衰后,将携带pcDNA3.1- fkBP12.6的超声微泡造影剂经导管注入右室,应用诊断超声定向转染心肌,观察fkBP12.6基因转染对犬心脏形态结构、心功能及心肌病理变化等的影响,探讨fkBP12.6过表达改善心衰时心肌舒缩功能的可行性,进而为探索安全、高效的治疗心肌功能异常提供新的途径。方法:28只快速起搏心衰犬随机分为4组。转染组以白蛋白微泡为载体,在超声破坏下将人工合成的pcDNA3.1-fkBP12.6质粒转染入心肌中,转染后分别观察4天(transfectionⅠ)或14天(transfectionⅡ),以不含质粒的微泡作为对照组。分别在起搏器安置前、转染前、转染后,起搏器关闭状态下通过超声和有创血流动力学检查测定左室内径和心功能,同时检测血浆心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)。评价fkBP12.6基因对心衰的治疗效果。通过HE染色和透射电镜观察心肌病理变化。应用RT-PCR检测各组fkBP12.6基因的表达情况。结果:1.转染组EF、FS在第4天可见明显好转,并在14天时保持稳定,但一直低于正常水平。在第4天时转染组LVEDD与对照组无变化,而LVEDV下降(p=0.04),在14天时两指标与对照组比较均缩小(LVEDD和LVEDV的p值分别为0.012和0.005)。2.心衰时各组RAP、mRVP、mPAP、PAWP与基础值相比均增高,CO(cardiac output)则下降(P均fkBP12.6 mRNA表达明显升高,与β-actin比值(2.80±0.33)约为对照组的3.4倍,随着时间的延长,fkBP12.6 mRNA表达降低,在14d时与β-actin比值(1.30±0.20)不及4d时的1/2。而controlⅡ组较controlⅠ组fkBP12.6 mRNA表达略有下降,但无差异(0.75±0.17vs0.83±0.19)。5.心肌病理显示转染组病变轻于对照组,而且未转染组病变进一步恶化。转染4天时,心肌细胞及间质水肿明显减轻,红细胞渗出减少,超微结果显示线粒体水肿减轻;对照组心肌病理进一步恶化,14天时较4天时水肿更明显,并有细胞排列明显紊乱,线粒体出现空泡化。结论:通过超声触发微泡破裂转染fkBP12.6基因至心衰犬心肌中,我们得出以下结论:1.超声触发微泡破裂转染fkBP12.6基因可在心肌细胞高效表达;2.超声微泡介导fkBP12.6基因转染心肌细胞,可以明显改善心肌细胞的结构和功能,为今后探索安全、高效的心肌功能异常的治疗提供了新的思路。

关键词： fk506结合蛋白12.6 心力衰竭超声微泡造影剂 RT-PCR 基因治疗心功能病理学

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超声微泡介导转染fkBP12.6基因对小鼠H9c2（2-1）心肌细胞结构和功能的影响

超声微泡介导转染FKBP12.6基因对小鼠H9c2（2-1）心肌细胞结构和...

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作者：刘国通第三军医大学

学位级别：硕士

背景和目的: 研究发现,多种病理状态下的心肌细胞特征性地表现为兴奋-收缩耦联的诸多异常。其中,fk506结合蛋白12.6(fk506 Binding proteins 12.6,fkBP12.6)与细胞内Ca2+的释放和神经钙蛋白(Calcineurin,CaN)的活性密切相关,fkBP12.6的... 详细信息

背景和目的: 研究发现,多种病理状态下的心肌细胞特征性地表现为兴奋-收缩耦联的诸多异常。其中,fk506结合蛋白12.6(fk506 Binding proteins 12.6,fkBP12.6)与细胞内Ca2+的释放和神经钙蛋白(Calcineurin,CaN)的活性密切相关,fkBP12.6的减少及其与肌浆网钙释放通道——2型雷尼丁受体(Ryanodine Receptor,RyR2)之间不协调的相互作用,是心肌细胞兴奋-收缩耦联障碍的重要原因,有可能作为治疗心肌功能异常的靶标。超声造影技术的不断发展和可携带基因的微泡声学造影剂的研制,使得超声已经从一种临床诊断工具,进入到治疗领域。超声波破坏含靶基因的微泡造影剂定位释放技术,是一种新型的基因定向转染技术,该技术使用的微泡直径小于8μm,含基因表达载体,微泡通过肺循环到达相应组织后,利用诊断超声增加特定组织的微血管通透性,使靶基因可通过微血管和内皮细胞间隙到达实质细胞内。国内外的研究结果表明,超声波破坏微泡可使基因的转染效率和表达明显提高。本课题通过构建并扩增pcDNA3.1- fkBP12.6基因表达载体,以培养的小鼠心肌细胞为模型,从细胞到分子水平进行研究:应用诊断用超声微泡造影剂作为基因转移的载体,观察转染fkBP12.6基因后,对小鼠心肌细胞生长状况的影响,并观察fkBP12.6基因对小鼠心肌细胞结构和功能的干预效果。为在大体动物心力衰竭模型上进行基因治疗奠定基础,进而为探索安全、高效的治疗心肌功能异常提供新的途径。方法: (一)pcDNA3.1- fkBP12.6基因表达载体的构建与扩增:目的基因全基因合成,PCR加入酶切位点,连接入pGEM-T-easy载体,经酶切鉴定及测序后获得测序正确的目的基因。连接入真核表达载体pcDNA3.1(-),再经酶切鉴定及测序后进行pcDNA3.1- fkBP12.6的扩增。 (二)实验研究:将pcDNA3.1-fkBP12.6质粒与白蛋白包裹微泡造影剂混合,经超声转染小鼠H9c2(2-1)心肌细胞后,通过倒置显微镜和透射电镜观察心肌细胞生长状况和超微结构的变化;激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+浓度的变化;分别用RT-PCR、免疫组织化学、Western blotting方法检测mRNA、蛋白的表达。结果: (一)pcDNA3.1- fkBP12.6基因表达载体的构建与扩增:成功构建并扩增pcDNA3.1- fkBP12.6基因表达载体。 (二)实验研究: 1.超声触发微泡破裂转染fkBP12.6基因的心肌细胞,细胞呈梭形排列,贴壁良好,细胞透亮,生长良好;内质网明显扩张,提示蛋白合成能力增强。 2.超声触发微泡破裂转染fkBP12.6基因可在心肌细胞高效表达。 3.高表达fkBP12.6的心肌细胞中,总的钙离子浓度增加,提示可能增强心肌细胞的收缩力。结论: 通过超声触发微泡破裂转染fkBP12.6基因至小鼠H9c2(2-1)心肌细胞,我们得出以下结论: 1.超声触发微泡破裂转染fkBP12.6基因可在心肌细胞高效表达;2.超声微泡介导fkBP12.6基因转染心肌细胞,可以明显改善心肌细胞的结构和功能,为今后探索安全、高效的心肌功能异常的治疗提供了新的思路。

关键词： fk506结合蛋白 fk506结合蛋白12.6 神经钙蛋白兴奋-收缩耦联超声微泡造影剂基因转染

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CPU86017及其手性异构体CPU86017-RS对异丙肾上腺素引起心肌细胞中fkBP12.6和SERCA2a下调的改善作用

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药学进展 2009年第11期33卷 511-516页

作者：郑玉粉于锋戴德哉戴茵中国药科大学药理研究室江苏南京210009

目的:探讨对氯苄基四氢小檗碱类化合物CPU86017及其手性异构体CPU86017-RS对异丙肾上腺素(ISO)引起心肌细胞中fkBP12.6和SERCA2a异常表达的改善作用。方法:将原代培养72小时的SD乳鼠心肌细胞随机分为9组:正常组,ISO组,普萘洛尔(10-6mol... 详细信息

目的:探讨对氯苄基四氢小檗碱类化合物CPU86017及其手性异构体CPU86017-RS对异丙肾上腺素(ISO)引起心肌细胞中fkBP12.6和SERCA2a异常表达的改善作用。方法:将原代培养72小时的SD乳鼠心肌细胞随机分为9组:正常组,ISO组,普萘洛尔(10-6mol·L-1)组,CPU86017低、中、高剂量组(剂量分别为10-7、10-6、10-5mol·L-1)及CPU86017-RS低、中、高剂量组(剂量分别为10-7、10-6、10-5mol·L-1),除正常组外,在其余各组的培养基中均另加ISO,使其浓度为10-6mol·L-1。继续培养24小时后,用RT-PCR和Western Blot法分别测定各组fkBP12.6和SERCA2a的mRNA及蛋白表达水平。结果:与正常组相比,ISO组fkBP12.6和SERCA2a的mRNA和蛋白表达明显下调(PfkBP12.6和SERCA2a的下调,且CPU86017-RS的作用强于CPU86017(PfkBP12.6和SERCA2a异常表达具有改善作用。

关键词： CPU86017 手性异构体 fk506结合蛋白12.6 钙ATP酶异丙肾上腺素

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雌激素对预防心脏肥大起重要作用

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国外医学情报 2003年第6期24卷 41-42页

作者：江欣

美国的研究人员近日阐明了一种作用机制,该机制可能有助于解释妇女对心脏肥大的易感性小于男性的原因。研究人员认为类似的性别特异的保护作用应归功于雌激素的存在。美国Cornell大学的MichaelKotlikoff与Vanderbilt大学的Sid-ney Fleis... 详细信息

美国的研究人员近日阐明了一种作用机制,该机制可能有助于解释妇女对心脏肥大的易感性小于男性的原因。研究人员认为类似的性别特异的保护作用应归功于雌激素的存在。美国Cornell大学的MichaelKotlikoff与Vanderbilt大学的Sid-ney Fleischer及其同事开始对fk506结合蛋白12.6(fkBP12.6)在缺乏fkBP12.

关键词：心脏肥大预防雌激素 fk506结合蛋白12.6 钙释放过程动物实验

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脂筏聚集及其与CaSR,fkBP12.6的共定位在哮喘细胞因子所致气道上皮细胞钙振荡中的作用

脂筏聚集及其与CaSR,FKBP12.6的共定位在哮喘细胞因子所致气道上...

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湖北省暨武汉市病理生理学会第十四届学术年会

作者：何会叶红金肆马万里吕丽华刘声远王迪浔胡清华华中科技大学同济医学院病理生理系华中科技大学同济医学院附属协和医院呼吸内科卫生部呼吸系疾病重点实验室

背景:钙振荡(calcium oscillation)是胞浆游离钙的一种较为普通的运动形式。支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性气道炎症性疾病,与多种炎性细胞及炎症介质有关。气道上皮细胞是气道炎症的主要效应细胞。Th2类细胞因子白介素-13(IL-13)、白... 详细信息

背景:钙振荡(calcium oscillation)是胞浆游离钙的一种较为普通的运动形式。支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性气道炎症性疾病,与多种炎性细胞及炎症介质有关。气道上皮细胞是气道炎症的主要效应细胞。Th2类细胞因子白介素-13(IL-13)、白介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在哮喘的发生、发展过程中发挥了重要作用。本研究用这三种细胞因子刺激气道上皮细胞,研究

关键词：脂筏钙振荡细胞因子气道上皮细胞 fk506结合蛋白12.6 钙敏感受体

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