检索结果-南通市图书馆

作者：陈明慧华东师范大学

学位级别：硕士

SCF类型的E3泛素连接酶fbw7是近年来报导的在细胞增殖及分化过程中起重要作用的F-box蛋白,研究表明它是一个很重要的肿瘤抑制因子。SCFfbw7复合物由Skp1、Cullin、Rbxl及fbw7共同组成,其中fbw7能够直接识别底物上保守的降解信号序列(CPD... 详细信息

SCF类型的E3泛素连接酶fbw7是近年来报导的在细胞增殖及分化过程中起重要作用的F-box蛋白,研究表明它是一个很重要的肿瘤抑制因子。SCFfbw7复合物由Skp1、Cullin、Rbxl及fbw7共同组成,其中fbw7能够直接识别底物上保守的降解信号序列(CPD)进而促进底物蛋白发生泛素化依赖的降解。目前已经报导的fbw7的底物有c-Myc、c-Jun、CyclinE、Mcl-1、mTOR、c-Myb、 AuroraA、p100等。尽管如此,我们对fbw7这一肿瘤抑制因子功能的了解并不是很充分,因此,fbw7新底物的找寻对于肿瘤及一些人类重大疾病的研究与治疗有着非常重要的意义。在本课题的研究中,我们利用生物信息学及蛋白质质谱的方法,对fbw7的底物进行预测,并且对其中潜在的底物,转录因子FoxM1和甲基转移酶G9a进行了深入的研究。我们利用一系列外源及内源性降解相关的实验手段和研究方法确定了fbw7对FoxM1的稳定性调控主要发生在细胞周期的M期,揭示了一个新的fbw7调控细胞周期的信号通路,也为肿瘤的治疗提供了一些新的思路。此外,我们利用同样的方法确定了fbw7对甲基化酶G9a稳定性的调控,通过检测由G9a调控的H3K9me1和H3K9me2的甲基化水平进而研究了其在表观遗传方面的生理功能。综上所述,本研究通过生物信息学的方法对fbw7底物进行大范围的筛选分析,同时,我们利用蛋白质质谱的方法对能与fbw7相互作用的蛋白进行分析,通过这两种方式我们更科学合理地找到了一些fbw7的新底物,为fbw7更深入的研究提供更多新的思路,也更全面地揭示了fbw7通过调控底物蛋白的稳定性进而可能在肿瘤及其它一些人类重大疾病发生中发挥的重要功能。

关键词： fbw7 FoxM1 G9a 蛋白降解蛋白质谱

泛素连接酶fbw7介导LDHA/Lactate/miR-223正反馈回路调控糖酵解在弥漫大B细胞淋巴瘤进展中的机制

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泛素连接酶Fbw7介导LDHA/Lactate/miR-223正反馈回路调控糖酵解在...

作者：郭泰然汕头大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是成人最常见的非霍奇金淋巴瘤,在R-chop方案治疗后,60%的患者得到完全缓解或部分缓解,但仍有40%因肿瘤复发与耐药而最终死亡。同时弥漫大B细胞淋巴瘤有临床治... 详细信息

研究背景和目的:弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是成人最常见的非霍奇金淋巴瘤,在R-chop方案治疗后,60%的患者得到完全缓解或部分缓解,但仍有40%因肿瘤复发与耐药而最终死亡。同时弥漫大B细胞淋巴瘤有临床治疗的异质性,所以深入研究难治性DLBCL的分子机制极其重要。弥漫大B细胞淋巴瘤预后与LDH生化指标密切相关,而在弥漫大B细胞淋巴瘤中鲜有报道代谢方面的具体机制及应用。fbw7(F-box and WD repeat domain containing 7)基因属于F-box蛋白家族,定位于人4号染色体(4q31.3),该家族还包括含WD-40结构域的F-box,包含富亮氨酸重复序列的F-box和包含不同蛋白质-蛋白质相互作用模块或无可识别基序的F-box。新近的研究显示fbw7在多种癌症中起不同的作用,提示其可能在不同癌症的发生发展中承担重要作用。在DLBCL中,我们的前期研究已证实泛素连接酶fbw7调控细胞凋亡在弥漫大B细胞淋巴瘤中发挥重要作用,但是其在代谢方面是否也起到作用目前仍不清楚。本研究旨在通过分子病理学及分子生物学方法,结合体内外功能研究,阐明fbw7在弥漫大B细胞淋巴瘤中的代谢作用及其相关分子机制,为深入理解弥漫大B细胞淋巴瘤发病机理提供新的理论思路。研究方法:1.用蛋白印迹检测,瞬时转染fbw7的SU-DHL-2、OCI-LY-10肿瘤细胞后LDHA、HK2、LUT-1、PDK1等代谢分子蛋白的变化和磷酸化的p Y10-LDHA的变化,通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)验证fbw7与LDHA的相互作用,通过泛素化、蛋白降解实验评估fbw7对LDHA的调控作用,通过细胞外乳酸脱氢酶检测、ATP产量检测等方法,评估过表达fbw7对代谢功能的作用。2.调整SU-DHL-2、OCI-LY-10肿瘤细胞外乳酸浓度,用蛋白印迹实验检测后fbw7、LDHA和p Y10-LDHA的变化,用Micro RNA荧光定量PCR法检测miR-223含量变化。3.用蛋白印迹检测,瞬时转染miR-223的SU-DHL-2、OCI-LY-10肿瘤细胞干扰fbw7后,LDHA和磷酸化的p Y10-LDHA的变化,通过细胞外乳酸脱氢酶检测、ATP产量检测等方法,评估干扰fbw7对代谢功能的作用。4.用细胞外乳酸脱氢酶检测、ATP产量检测方法检测,干扰LDHA的U2932、SUDHL-2肿瘤细胞后,弥漫大B细胞淋巴瘤代谢功能。5.用NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠,注入一定量的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞,分别使用miR-223模拟物、miR-223抑制剂及LDHA干扰片段,评估肿瘤增长情况。6.提取R-CHOP治疗后复发及非复发的DLBCL肿瘤样品组织的RNA,通过Micro RNA荧光定量PCR法测定miR-223含量。研究结果:1.过表达fbw7可抑制弥漫大B细胞淋巴瘤代谢能力,机制研究发现,fbw7能够通过调控LDHA的泛素化降解,使LDHA、磷酸化的p Y10-LDHA明显下调。2.糖酵解最终产物乳酸抑制fbw7表达,促进LDHA、p Y10-LDHA的表达,并诱导miR-223的表达。3.瞬时转染miR-223可明显抑制fbw7表达,同时抑制弥漫大B细胞淋巴瘤代谢能力。4.干扰LDHA可明显抑制抑制弥漫大B细胞淋巴瘤代谢能力。5.体外实验miR-223激动剂能够促进弥漫大B细胞淋巴瘤皮下成瘤,而miR-223抑制剂及LDHA干扰片段抑制DLBCL细胞皮下成瘤。6.miR-223在治疗后复发DLBCL肿瘤样品中表达水平显著高于治疗缓解患者。研究结论:在弥漫淋巴大B细胞淋巴瘤中,fbw7可通过调控LDHA的泛素化从而抑制有氧糖酵解通路的激活,并受LDHA催化产物乳酸调控,而乳酸则具体通过miR-223调控fbw7,在肿瘤中代谢环境形成正反馈机制。

关键词： fbw7 乳酸弥漫大B细胞淋巴瘤 miR-223

探讨MCL-1和fbw7蛋白对多倍体肿瘤形成的影响及其作用

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探讨MCL-1和FBW7蛋白对多倍体肿瘤形成的影响及其作用

作者：张倩天津医科大学

学位级别：硕士

目的:目前,恶性肿瘤仍是威胁人类健康的最大杀手,临床工作中发现,肿瘤组织的耐药及复发与多倍体细胞的形成密切相关。纺锤丝毒性药物（如紫杉醇、长春新碱等）是肿瘤化疗的一线药物,杀灭肿瘤的重要机制是诱导细胞凋亡。前期研究发现:这... 详细信息

目的:目前,恶性肿瘤仍是威胁人类健康的最大杀手,临床工作中发现,肿瘤组织的耐药及复发与多倍体细胞的形成密切相关。纺锤丝毒性药物（如紫杉醇、长春新碱等）是肿瘤化疗的一线药物,杀灭肿瘤的重要机制是诱导细胞凋亡。前期研究发现:这类药物对有些肿瘤细胞可诱导其发生凋亡,从而达到治疗的目的。而对另一些肿瘤细胞却以诱导其产生多倍体为特征,这些多倍体肿瘤细胞对常用化疗药物更加耐药,且其形成与BCL-2的高表达相关。多倍体肿瘤的形成与多种分子机制调控异常有关,BCL-2高表达所致凋亡逃逸,P21降解所造成的有丝分裂调控点失控所致有丝分裂滑动、核内复制等可能是多倍体肿瘤形成的重要原因,但目前尚无定论。国外学者的研究也发现:大约90%的实体瘤是非整倍体,染色体扩增,耐药表型表达量增高,使多倍体肿瘤对常用的放、化疗极不敏感,具有多倍体亚克隆的肿瘤预后更差。Wertz IE等人在Nature杂志中研究表明:MCL-1（myeloid cell leukemia-1）作为BCL-2家族重要成员之一,是抗微管化疗药诱导肿瘤细胞凋亡的重要调节因子,起抗凋亡作用,在有丝分裂间期,fbw7/Cdc4（SKP1-cullin-1-F-box complex,SCFfbw7）该重要的泛素蛋白酶E3可以介导MCL-1蛋白大量泛素化降解,从而使MCL-1蛋白含量水平显著下降,致使细胞凋亡。但在卵巢癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤细胞中常发现,fbw7蛋白缺失或基因突变导致降解肿瘤蛋白功能的丧失,致使MCL-1蛋白降解受阻,MCL-1蛋白水平升高,可促进有丝分裂滑动、核内复制,可能是导致多倍体肿瘤形成和对抗微管化疗药耐药的重要原因,另有学者发现急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）、乳腺癌细胞和结肠癌细胞也存在fbw7缺失,MCL-1过表达这一普遍现象,fbw7蛋白缺失的T-ALL细胞对索拉非尼（Sorafenib,多激酶抑制剂）药物非常敏感,Sorafenib通过抑制MCL-1表达发挥抗癌作用,而对BCL-2拮抗剂ABT-737不敏感,如在基因水平重建fbw7或使MCL-1低表达,可使T-ALL细胞重新恢复对ABT-737药物的敏感性,进一步说明抑制MCL-1蛋白的表达可能是临床治疗fbw7蛋白缺失的T-ALL的重要途径。本实验通过应用纺锤丝毒性药物Nocodazole、紫杉醇（Taxol）为诱导物,以乳腺癌细胞mda-mb-231为研究对象,与药物共同孵育的不同时间点收获细胞,观察细胞形态及染色体倍体变化,探讨mcl-1和fbw7蛋白在乳腺癌细胞多倍体形成中的作用,且期望通过sorafenib抑制mcl-1蛋白的表达,达到减少多倍体细胞形成的目的,从而提出以减少多倍体肿瘤形成为基础的防治肿瘤耐药新策略。方法:1、以纺锤丝毒性药物100ng/mlnocodazole处理人乳腺癌mda-mb-231细胞,分别于0h、6h、12h、24h、48h、72h收获细胞,显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞周期和染色体倍体变化,westernblot检测细胞中fbw7和mcl-1蛋白的表达含量。2、用索拉非尼（sorafenib,多激酶抑制剂）分别与nocodazole、紫杉醇（taxol）共同处理细胞,分别以单用nocodazole或taxol或sorafenib处理细胞为对照。westernblot检测处理48h后各组细胞中mcl-1蛋白的表达,流式细胞术检测处理48h细胞周期和染色体倍体变化,mtt比色法检测处理48h和72h细胞生长增殖率。结果:1、nocodazole处理细胞后,随时间推移细胞出现体积增大,核大的多倍体形态学改变,八倍体细胞所占百分比显著增加,分别为0h（0.8±0.2）%、6h（8.5±2.3）%、12h（7.8±2.0）%、24h（9.9±0.9）%、48h（28.2±0.8）%、72h（35.1±4.9）%（f=91.417,p＜0.001）;随时间推移fbw7蛋白表达量逐渐减少,mcl-1蛋白表达量逐渐增加,且48h后差异显著。2、于48h收获细胞后,nocodazole+sorafenib组较nocodazole组mcl-1蛋白表达量显著减少,八倍体细胞所占百分比（8.6±0.1）%明显低于nocodazole组（28.2±0.8）%（t=12.557,p=0.006）,细胞生长增殖率明显降低（t=17.872,p＜0.001）;taxol+sorafenib组较taxol组mcl-1蛋白表达量也显著减少,八倍体细胞所占百分比（0.8±0.7）%也明显低于taxol组（10.5±1.3）%（t=10.92,p＜0.001）,细胞生长增殖率也明显降低（t=9.175,p＜0.001）。结论:1、fbw7蛋白低表达,mcl-1蛋白高表达与乳腺癌多倍体细胞的形成密切相关。2、索拉非尼（Sorafenib）可能抑制MCL-1蛋白表达,减少多倍体肿瘤

关键词：多倍性肿瘤 MCL-1 fbw7 纺锤丝毒性药物

fbw7在肠道炎症性疾病发生发展中的功能和机制研究

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FBW7在肠道炎症性疾病发生发展中的功能和机制研究

作者：李惠晨中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

肠道炎症性疾病是一种常见的肠道组织疾病,严重困扰着人类的生活与健康,主要表现为肠道组织受损引起的消化功能障碍、腹痛、腹泻、便血等临床症状。很多外界刺激都能引起肠道炎症性损伤,比如化学性损伤和放射性刺激等。本文以化学性损... 详细信息

肠道炎症性疾病是一种常见的肠道组织疾病,严重困扰着人类的生活与健康,主要表现为肠道组织受损引起的消化功能障碍、腹痛、腹泻、便血等临床症状。很多外界刺激都能引起肠道炎症性损伤,比如化学性损伤和放射性刺激等。本文以化学性损伤和放射性刺激导致的肠道炎症性疾病为研究对象,探寻其发生发展的机制以及可能的治疗靶点。炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)主要包括克罗恩病和溃疡性结肠炎,是一组可导致肠道功能障碍的慢性疾病。虽然确切的病因尚未完全了解,但是已有研究发现,当因环境因素受到发生因素刺激从而导致宿主不适当的侵袭性炎症反应时,IBD就会发生。急性放射性肠损伤是由于受到高剂量辐射时,绒毛上皮细胞和隐窝干细胞受到生长抑制甚至死亡,导致上皮损伤、肠屏障丧失功能、炎症甚至肠源性败血症。严重的胃肠道损伤引起细菌性肠炎、吸收不良、腹泻和体液丧失,从而导致致死性胃肠综合征(Gastrointestinal Syndrome,GIS)的发生。fbw7(F-box and WD repeat domain-containing 7,fbw7)也被称为Fbxw7,hsel10、CDC4和Ago,是一种E3泛素连接酶复合物。fbw7是一个重要的抑癌基因,在多种肿瘤中,比如白血病、胃癌、直肠癌和卵巢癌中存在着基因突变或缺失,其在肿瘤发生、发展中的作用得到广泛的研究。研究发现,fbw7与重要的炎症信号通路NF-κB密切相关;同时,其在抑制细胞增殖,促进细胞凋亡等方面均发挥着重要作用。以上研究提示fbw7在结肠炎以及放射性肠炎发生、发展中可能扮演着重要角色。为了探索fbw7在炎症性肠病以及放射性肠炎中的作用机制,我们利用Cre/LoxP系统,建立了肠道上皮细胞特异性的fbw7条件性基因敲除小鼠(Vil-Cre;fbw7,fbw7)。然后利用3%DSS诱导建立结肠炎症模型,并通过对小鼠进行8Gy Go全身辐射处理建立放射性肠道损伤模型;进而利用构建好的动物模型观察fbw7的肠道特异性缺失对于两种疾病的影响,探索fbw7在疾病发生、发展中的生物学功能。【目的】1.阐明fbw7调控IBD病理反应过程的功能及其作用机制。2.探索fbw7是否参与了GIS的病理过程及其可能作用机制。【方法和结果】1.fbw7肠道特异性敲除加重DSS诱导的结肠炎症表现我们利用Cre/LoxP系统,建立了肠道上皮细胞特异性的fbw7条件性基因敲除小鼠(Vil-Cre;fbw7,fbw7),并通过饮水给予为期5天的3%DSS构建肠道炎症模型。本人首次发现了fbw7肠道特异性敲除能加重DSS诱导结肠炎的炎症。2.fbw7肠道特异性敲除可激活NF-κB炎性信号通路在DSS诱导的结肠炎症模型中,fbw7肠道特异性敲除,使得NF-κB炎性信号通路激活。NF-κB P65免疫荧光结果显示,P65表达上调,并且进入细胞核内的p65增多。进一步检测了结肠肠道上皮细胞中的NF-κB炎性信号通路的关键分子发现,IKK、p-IκB、P65、p-P65表达上调。结果证明,在DSS诱导的结肠炎症模型中,fbw7肠道特异性敲除使得NF-κB炎性信号通路得到激活,进而促进IL-1β、IL-6和TNF-α表达上调,因此肠道的炎性损伤加重。3.fbw7肠道特异性敲除能够减弱放射性刺激导致的肠道损伤与fbw7缺失加重结肠炎症反应相反,fbw7肠道特异性敲除对于放射性肠损伤起到了保护作用。我们通过对小鼠进行8 Gy Go全身辐射建立放射性肠道损伤模型。研究发现,在放射性肠炎模型中,fbw7的肠道缺失使得小鼠死亡率降低,平均存活时间增加,在1-6天体重减少较对照组轻微,便血情况也有缓解。fbw7小鼠空肠段较对照组水肿和出血情况较为轻微,对于肠道绒毛和隐窝的损伤也有减轻,空肠上皮细胞中MPO表达降低。IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子表达下调,与结肠炎症模型中表达相反。4.fbw7肠道缺失能够抑制放射性刺激引起的细胞凋亡,促进肠道损伤修复通过对放射性肠道损伤模型中的空肠上皮粘膜细胞的凋亡和增殖情况进行分析。结果显示,fbw7的肠道缺失一方面能够抑制放射引起的凋亡从而减弱肠道损伤增强放射损伤耐受;另一方面促进肠道隐窝细胞的增殖,从而增强肠道修复能力。【结论】在DSS诱导的炎症模型中,fbw7肠道特异缺失能够促进NF-κB炎性信号通路激活,使得IL-1β、IL-6和TNF-α表达上调,从而加重结肠炎症损伤。在放射性损伤模型中,fbw7肠道特异缺失能够通过抑制放射性刺激引起的凋亡并且促进肠道隐窝细胞的增殖从而起到保护肠道的作用。本研究首次阐明了fbw7在上述两种模型中的作用,为进一步研究结肠炎症和放射性肠损伤提供了新的研究思路,为探索新的治疗手段提供了理论基础。同时,也拓宽了fbw7的研究领域,对于fbw7的深入研究提供了新视角。

关键词： fbw7 IBD 结肠炎放射性肠道损伤 GIS

fbw7调控人非小细胞肺癌CCL2的表达抑制肿瘤侵袭和转移

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FBW7调控人非小细胞肺癌CCL2的表达抑制肿瘤侵袭和转移

作者：卢小妹广西医科大学

学位级别：硕士

目的:本课题主要研究fbw7对人非小细胞肺癌CCL2的表达的影响并通过小鼠Lewis肺癌细胞LLC和基因敲除小鼠模型观察肿瘤细胞来源的CCL2对肿瘤侵袭转移的可能作用。在人非小细胞肺癌细胞A549和H1299中敲低或过表达fbw7后检测其对CCL2 m RNA... 详细信息

目的:本课题主要研究fbw7对人非小细胞肺癌CCL2的表达的影响并通过小鼠Lewis肺癌细胞LLC和基因敲除小鼠模型观察肿瘤细胞来源的CCL2对肿瘤侵袭转移的可能作用。在人非小细胞肺癌细胞A549和H1299中敲低或过表达fbw7后检测其对CCL2 m RNA水平和蛋白表达的影响,探索fbw7是否通过负向调控Notch通路来调控肿瘤细胞来源的CCL2的水平而发挥肿瘤抑制作用,并利用CCL2基因敲除动物模型验证肿瘤细胞来源的CCL2在fbw7抑制NSCLC细胞侵袭转移的作用,为靶向fbw7/Notch/CCL2轴的癌症治疗策略提供理论基础和新的思路。方法:1.运用Real-time PCR和Western Blot蛋白免疫印迹技术检测fbw7在4株不同人非小细胞肺癌细胞系中的表达情况;Real-time PCR和酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测CCL2在4株不同NSCLC细胞中的表达情况。2.应用慢病毒转染技术构建fbw7稳定低表达的NSCLC细胞A549Sh fbw7和H1299Sh fbw7以及其空载对照细胞株A549Sh Ctrl和H1299Sh Ctrl;采用脂质体瞬时转染方法构建fbw7高表达的NSCLC细胞A549-fbw7和H1299-fbw7以及其空载对照细胞A549-EV和H1299-EV;运用Real-time PCR和Western Blot蛋白免疫印迹技术检测其干扰以及过表达的效率。运用Real-time PCR、酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测干扰或过表达fbw7对CCL2表达的影响。3.通过Western Blot蛋白免疫印迹技术检测干扰或过表达fbw7的细胞中fbw7和Notch信号通路相关蛋白如Notch1,Notch3,C-Myc,C-Myb,Cyling E1,MAML-1等的表达情况。4.利用细胞划痕实验和transwell迁移实验检测fbw7低表达的NSCLC细胞及其对照细胞在不同条件培养基培养后迁移能力的差异。5.Notch通路抑制剂LY3039478作用于fbw7低表达的A549、H1299细胞和对照组细胞,用Real-time PCR、ELISA检测CCL2的表达;用细胞划痕实验和transwell迁移实验检测Notch抑制剂能否抑制条件培养基诱导的低表达fbw7细胞的迁移能力。6.用慢病毒转染技术构建荧光素酶标记的稳定干扰fbw7的小鼠Lewis肺癌细胞LLC-luc-Sh fbw7和其对照细胞LLC-luc-Sh Ctrl,运用Real-time PCR和Western Blot技术检测其干扰效率后,通过小鼠尾静脉注射到野生型和CCL2基因敲除小鼠体内,利用小动物活体成像技术动态监测小鼠肿瘤生长和转移情况。结果:1.Real-time PCR和Western blot结果显示fbw7在H1299细胞中表达最高,在H441细胞中表达最低;Real-time PCR和ELISA结果显示CCL2在H441细胞中表达最高,在H1299细胞中表达最低。2.本研究应用慢病毒转染技术成功构建了fbw7稳定低表达的NSCLC细胞A549Sh fbw7和H1299Sh fbw7以及其空载对照细胞株A549Sh Ctrl和H1299Sh Ctrl;采用脂质体瞬时转染方法构建了fbw7高表达的NSCLC细胞A549-fbw7和H1299-fbw7以及其空载对照细胞A549-EV和H1299-EV。3.Real-time PCR和ELISA结果显示敲低或过表达A549、H1299细胞中的fbw7,肿瘤细胞中的CCL2表达水平分别呈现上升或下降的趋势(Pfbw7,Notch信号通路相关蛋白Notch1,Notch3,C-Myc,C-Myb,Cyling E1,MAML-1等的表达上升,RBPSu H表达下降;在A549、H1299细胞中过表达fbw7,Notch信号通路相关蛋白Notch1,Notch3,C-Myc,C-Myb,Cyling E1等的表达下降,HES1表达上升。5.细胞划痕实验和transwell迁移实验结果显示在不同培养基培养条件fbw7低表达的A549、H1299细胞,与其对照组细胞相比细胞迁移能力显著增强(Pfbw7低表达的A549、H1299细胞在常规培养基培养和在条件培养基培养(fbw7低表达细胞分泌的培养基上清液)相比,在条件培养基培养其迁移能力增强(Pfbw7调控的肿瘤细胞来源的CCL2诱导的NSCLC细胞的迁移能力(P<0.05)。6.Real-time PCR和ELISA结果显示不同浓度Notch通路抑制剂LY30

关键词：非小细胞肺癌肿瘤转移 fbw7 CCL2

泛素连接酶fbw7增强胆管癌细胞株QBC939对化疗药物敏感性的研究

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泛素连接酶Fbw7增强胆管癌细胞株QBC939对化疗药物敏感性的研究

作者：段朋福建医科大学

学位级别：硕士

目的：研究泛素连接酶fbw7在胆管癌细胞株QBC939化疗敏感性中的作用，并探讨其机制。方法：在体外培养人胆管癌细胞株QBC939，MTT法检测5-氟尿嘧啶、表柔比星、丝裂霉素、奥沙利铂、顺铂五种临床常用化疗药物对细胞的抑制作用;fbw7... 详细信息

目的：研究泛素连接酶fbw7在胆管癌细胞株QBC939化疗敏感性中的作用，并探讨其机制。方法：在体外培养人胆管癌细胞株QBC939，MTT法检测5-氟尿嘧啶、表柔比星、丝裂霉素、奥沙利铂、顺铂五种临床常用化疗药物对细胞的抑制作用;fbw7介导下化疗药物对QBC939的抑制作用。Western Blot检测fbw7以及p-erk、erk、Bcl-2、Mcl-1、AIB1、PARP的表达情况。结果：5-氟尿嘧啶、表柔比星、丝裂霉素、奥沙利铂、顺铂对胆管癌细胞株QBC939有明显抑制作用，且呈浓度依赖;过表达和干扰fbw7分别抑制、促进QBC939的增殖;过表达后化疗药物对QBC939的抑制作用更明显，干扰fbw7后则被减弱;顺铂、表柔比星均能下调p-erk、erk、Bcl-2、Mcl-1、AIB1的表达;fbw7能下调Mcl-1、AIB1的表达。结论：化疗药物在细胞水平对胆管癌细胞株QBC939起到有效抑制，一方面通过抑制Mcl-1、Bcl-2以及AIB1蛋白的表达，另一方面通过MAPK信号通路发挥作用。fbw7增强胆管癌细胞QBC939对化疗药物的敏感性，结果显示可能与AIB1、Mcl-1有关。

关键词：胆管癌 fbw7 化疗药物

Ras信号通路对HeLa细胞增殖及fbw7、cyclin E表达的影响

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Ras信号通路对HeLa细胞增殖及FBW7、cyclin E表达的影响

作者：孙迪重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:研究Ras及其下游PI3K和MAPK信号通路对人类宫颈癌细胞株HeLa细胞增殖及细胞周期素E(cyclin E)表达的影响。在此基础上,进一步探讨介导cyclin E泛素化降解的抑癌蛋白F-盒和含蛋白7的WD重复结构域(fbw7)在HeLa细胞中的表达特点,并观... 详细信息

目的:研究Ras及其下游PI3K和MAPK信号通路对人类宫颈癌细胞株HeLa细胞增殖及细胞周期素E(cyclin E)表达的影响。在此基础上,进一步探讨介导cyclin E泛素化降解的抑癌蛋白F-盒和含蛋白7的WD重复结构域(fbw7)在HeLa细胞中的表达特点,并观察调控cyclin E表达的Ras下游信号通路对fbw7表达的影响。方法:1.以宫颈癌细胞株HeLa细胞为研究对象,观察Ras信号通路对HeLa细胞增殖、细胞周期分布及cyclin E表达的影响:不同浓度Ras信号通路阻断剂FTI-277处理HeLa细胞,噻唑兰比色(MTT)法检测FTI-277对HeLa细胞的增殖抑制率;流式细胞术(FCM)检测FTI-277对HeLa细胞细胞周期分布的影响;RT-PCR和Western blot检测FTI-277对HeLa细胞cyclin E的mRNA和蛋白水平表达的影响。2.观察Ras下游PI3K和MAPK信号通路对HeLa细胞增殖及cyclin E表达的影响:不同浓度PI3K信号通路阻断剂LY-294002和MAPK信号通路阻断剂UO-126分别处理HeLa细胞,MTT法分别检测两者对HeLa细胞的增殖抑制率;RT-PCR和Western blot分别检测两者对HeLa细胞cyclin E的mRNA和蛋白水平表达的影响。3.观察Ras下游调控cyclin E表达的MAPK信号通路对HeLa细胞fbw7表达的影响:RT-PCR和Western blot检测UO-126对HeLa细胞fbw7的mRNA和蛋白水平表达的影响;免疫荧光法观察HeLa细胞fbw7的分布及UO-126对HeLa细胞fbw7表达的影响。结果:1. MTT实验显示,Ras信号通路阻断剂FTI-277具有抑制HeLa细胞增殖的作用,且具有时效量效依赖性。结果显示10μmol/L的FTI-277药物浓度处理组线性相关性最好,因此,在后续的实验中我们采用10μmol/L的FTI-277作为干扰因素,探讨FTI-277对HeLa细胞周期及cyclin E表达的影响。FCM检测细胞周期结果显示,FTI-277作用后细胞周期滞留于G1/S期,且具有时间依赖性。RT-PCR和Western blot检测结果显示FTI-277作用后,HeLa细胞cyclin E mRNA水平无明显改变,cyclin E蛋白表达水平减弱。2.PI3K信号通路阻断剂LY-294002和MAPK信号通路阻断剂UO-126均显示出抑制HeLa细胞增殖的作用,10μmol/L的LY-294002药物浓度处理组和10μmol/L的UO-126药物浓度处理组分别显示出最好的线性相关性,因此,实验中采用10μmol/L的LY-294002和10μmol/L的UO-126处理HeLa细胞,观察不同时间梯度下cyclin E表达的变化。LY-294002对cyclin E的蛋白表达无明显影响,相对之下,UO-126能下调cyclin E的蛋白表达。3. RT-PCR和Western blot检测结果显示UO-126作用后,HeLa细胞fbw7 mRNA及蛋白表达均增多。免疫荧光结果显示,fbw7在HeLa细胞的细胞质和细胞核中有表达,细胞核部位表达较多。UO-126处理HeLa细胞后fbw7阳性表达增强,并具有时间依赖性。结论:1. HeLa细胞的异常增殖与Ras信号通路的激活有关,阻断Ras信号通路激活可以减慢HeLa细胞周期G1/S期的进程并下调cyclin E蛋白的表达。Ras-MAPK信号通路而不是Ras-PI3K信号通路在HeLa细胞cyclin E蛋白的表达调控中发挥重要作用。2. HeLa细胞中泛素化降解cyclin E的抑癌蛋白fbw7表达也与Ras-MAPK信号通路有关。fbw7位于Ras-MAPK信号通路的下游。

关键词： Ras信号通路 HeLa细胞 fbw7 cyclin E

三羟异黄酮调控miR-223、miR-27a抑制人胰腺癌细胞进展的机制研究

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三羟异黄酮调控miR-223、miR-27a抑制人胰腺癌细胞进展的机制研究

作者：程龙蚌埠医学院

学位级别：硕士

背景与目的：胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤，五年生存率不到6%。吉西他滨是治疗晚期胰腺癌最有效的药物之一，虽然吉西他滨单用或者联合其它化疗药物治疗胰腺癌已经被视为常规方案，但是由于副作用和化疗耐药的出现，总体上仍然未能明... 详细信息

背景与目的：胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤，五年生存率不到6%。吉西他滨是治疗晚期胰腺癌最有效的药物之一，虽然吉西他滨单用或者联合其它化疗药物治疗胰腺癌已经被视为常规方案，但是由于副作用和化疗耐药的出现，总体上仍然未能明显提高患者生存率。因此，寻找新的、更有效的治疗胰腺癌的方法意义重大。本课题研究目的：（1）探讨三羟异黄酮对人腺癌细胞PANC-1、BxPC-3、AsPC-1增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。（2）探讨三羟异黄酮是否通过下调miR-223表达影响胰腺癌细胞生长、凋亡、迁移和侵袭。（3）探讨三羟异黄酮是否通过下调miR-27a表达影响胰腺癌细胞生长、凋亡、迁移和侵袭，进而发挥其抗肿瘤作用。方法：（1）以人腺癌细胞PANC-1、BxPC-3、AsPC-1为研究对象，采用噻唑蓝比色法、流式细胞术、创伤愈合实验和Transwell方法检测三羟异黄酮对人腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。（2）采用实时荧光定量PCR检测三羟异黄酮对人胰腺癌细胞miR-223、miR-27a表达的影响。（3）通过脂质体瞬时转染miRNAinhibitor分别下调胰腺癌细胞miR-223与miR-27a，研究相应的miRNA在胰腺癌细胞中的作用机制。蛋白质印迹实验检测fbw7和FOXO1蛋白表达。结果：1.三羟异黄酮能够抑制细胞增殖并呈剂量依赖关系;三羟异黄酮能够促进胰腺癌细胞凋亡;三羟异黄酮能够抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭能力。2.三羟异黄酮下调了胰腺癌细胞miR-223表达;三羟异黄酮通过下调miR-223抑制了胰腺癌细胞的增殖、侵袭能力，促进肿瘤细胞凋亡。三羟异黄酮通过下调miR-223上调了AsPC-1细胞中fbw7蛋白表达。3.三羟异黄酮下调了胰腺癌细胞miR-27a表达;三羟异黄酮通过下调miR-27a抑制了胰腺癌细胞的增殖、侵袭能力，促进肿瘤细胞凋亡。三羟异黄酮通过下调miR-27a上调了PANC-1细胞中FOXO1蛋白表达。结论：1.三羟异黄酮能够抑制胰腺癌细胞PANC-1、BxPC-3、AsPC-1增殖、迁移和侵袭能力，促进细胞凋亡。2.三羟异黄酮能够部分地通过下调AsPC-1细胞中miR-223的表达进而上调靶蛋白fbw7的表达，从而抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡。3.三羟异黄酮能够部分地通过下调PANC-1细胞中miR-27a的表达进而上调靶蛋白FOXO1的表达，从而抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡。

关键词：胰腺癌三羟异黄酮 miR-223 miR-27a fbw7 FOXO1 细胞增殖凋亡迁移侵袭

脯氨酰异构酶TaPIN1和泛素连接酶fbw7的克隆表达纯化

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脯氨酰异构酶TaPIN1和泛素连接酶FBW7的克隆表达纯化

作者：宋宁静安徽农业大学

学位级别：硕士

环形泰勒虫病是由泰勒科泰勒属的环形泰勒虫寄生于牛体内白细胞而引起的一种血液性原虫病,该病流行于北非、南欧、亚洲,在我国主要发生在北方的干旱和半干旱地区,如未及时治疗,死亡率高达80%,给畜牧业带来严重的经济损失。研究发现,环... 详细信息

环形泰勒虫病是由泰勒科泰勒属的环形泰勒虫寄生于牛体内白细胞而引起的一种血液性原虫病,该病流行于北非、南欧、亚洲,在我国主要发生在北方的干旱和半干旱地区,如未及时治疗,死亡率高达80%,给畜牧业带来严重的经济损失。研究发现,环形泰勒虫在侵染宿主牛白细胞后,分泌一种肽基脯氨酰异构酶TaPIN1蛋白,该蛋白可异构化宿主细胞中一种泛素连接酶fbw7,致使其发生自身泛素化而降解,其负调控的一些下游原癌基因Jun/Fos家族的所有蛋白表达会出现上调,进而促使宿主细胞具有无限增殖与侵袭能力等癌化特点。通过环形泰勒虫致病机理可知,诱发宿主白细胞的不断增殖对环形泰勒虫的致病性来说是十分重要的环节。若能在这一环节上进行阻断,将为预防与治疗该病提供了新的思路和可能性,因此解析TaPIN1与fbw7蛋白复合物结构对于研发出特异性针对寄生虫的药物是十分必要的。在本课题研究中,我们利用了PCR技术扩增了TaPIN1基因和fbw7基因,将扩增产物克隆到原核表达载体pPGH中,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合蛋白诱导表达,并用PPase酶切验证是我们需要的目的蛋白,在通过离子交换层析和凝胶过滤层析后,我们得到了符合结晶要求的高纯度的TaPIN1(22-142)蛋白和fbw7(150-257)蛋白。然后,采取悬滴法对TaPIN1蛋白进行初筛,初筛试剂盒使用来自Hampton Research、Emerald Bio Systems和Molecular Dimensions三种不同的公司产品,互相弥补缺失的晶体生长条件,经过大量的初筛,我们得到了TaPIN1(22-142)蛋白晶体,为后续研究做铺垫。

关键词：环形泰勒虫 TaPIN1 fbw7 克隆纯化晶体筛选

E3泛素连接酶fbw7在血管新生中的功能研究

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E3泛素连接酶FBW7在血管新生中的功能研究

作者：张凯华东师范大学

学位级别：硕士

“泛素-蛋白酶体”体系介导的蛋白质降解过程与人体许多重要生理和病理过程密切相关。在正常细胞中,如果某些原癌基因发生突变,可能导致其相应原癌蛋白的降解过程发生障碍,从而导致细胞的恶性转化及肿瘤的发生;在肿瘤细胞中,如果某些肿... 详细信息

“泛素-蛋白酶体”体系介导的蛋白质降解过程与人体许多重要生理和病理过程密切相关。在正常细胞中,如果某些原癌基因发生突变,可能导致其相应原癌蛋白的降解过程发生障碍,从而导致细胞的恶性转化及肿瘤的发生;在肿瘤细胞中,如果某些肿瘤抑制因子发生突变或者被过度降解,使其肿瘤抑制活性大大降低,从而促进肿瘤的生长并加速病情的恶化。“泛素-蛋白酶体”体系介导的蛋白质泛素化降解过程广泛地参与调控细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等多种细胞生物学过程,对细胞的生命活动具有重要而深刻的影响。“泛素-蛋白酶体”体系介导的蛋白质泛素化降解一直以来是分子生物学、细胞生物学、生理学和病理学等领域的研究热点。 “泛素-蛋白酶体”降解体系的主要成分有：泛素、泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3和26S蛋白酶体等。各种成分通过有序的级联催化反应最终特异性介导底物蛋白的泛素化修饰,最终在26S蛋白酶体的催化作用下降解,该过程需要ATP提供能量。“泛素-蛋白酶体”体系对细胞生命活动的调控具有“广泛性”和“精确性”双重特征。“广泛性”体现在“泛素-蛋白酶体”途径几乎介导体内所有蛋白质的降解,几乎参与调控细胞生命活动的各个方面。“精确性”体现在“泛素-蛋白酶体”对底物蛋白的高度选择性和特异性。E3泛素连接酶是保证“泛素-蛋白酶体”体系特异性识别并降解底物蛋白的关键组分。在目前发现的大约600多种E3泛素连接酶中,fbw7是近些年来备受关注的明星分子之一。 fbw7的英文全称为"F-box and WD repeat domain-containing7",它是F-box蛋白家族的成员之一。fbw7属于SCF型E3泛素连接酶,由SKP1、CUL1、RBX1和F-box四种蛋白构成,通过结构域之间的相互作用结合在一起,以蛋白复合物的形式发挥E3泛素连接酶功能。在fbw7调控的众多底物蛋白中,有些是被广泛研究的原癌蛋白,如MYC、KLF5等;有些参与细胞周期调控,如cyclinE等;有些则是某些信号通路的转录因子,如Notch、Jun等。由于fbw7的许多降解底物都与肿瘤发生密切相关,fbw7是公认的极其重要的肿瘤抑制因子。大量研究表明,在许多肿瘤细胞中fbw7发生了基因突变,这直接导致fbw7肿瘤抑制因子功能的丧失。根据文献报道,fbw7基因敲除型小鼠在胚胎发育E10.5天前后致死,这可能与其血管和造血系统发育存在严重缺陷密切相关。美国密歇根大学Sun Yi教授的研究团队发现,与fbw7具有高度相似性的SCF家族E3泛素连接酶SAG/RBX2/ROC2在小鼠血管系统和神经系统发育中具有重要的调控作用。然而人们目前对于fbw7在血管系统发育中的调控作用知之甚少,这个问题激发了我们以极大的研究热情去探索fbw7在血管生物学中的作用。 “血管发生”和“血管新生”是血管系统发育过程中两个既相互独立又密切相关的概念和现象。前者是指在胚胎发育过程中,起源于中胚层的部分细胞特化为“血-血管干细胞”,这些细胞进而聚集形成团状,被称为“血岛”。血岛的外部细胞进一步发育为成血管细胞,成血管细胞最终分化为血管内皮细胞。血管内皮细胞在某些信号因子刺激下,生长迁移形成细长的管状结构,它们相互交织并连接成为网络,形成初级毛细血管丛。初级毛细血管丛最终分化为静脉、动脉和毛细血管等成熟的血管系统,此过程称为“血管发生”。血管新生则是在某些环境因素或者信号刺激下,已存在血管内皮细胞增值分裂、迁移萌发形成细微幼稚新生血管的过程。由此可见,“血管发生”是从“源头”开始的,是从“无”到“有”的发育过程;“血管新生”是在己有血管基础上,从“旧”到“新”的过程,这是两者的不同之处。本论文的主要内容分为以下几部分进行论述：一、fbw7在小鼠主要脏器的血管内皮中呈高表达。免疫组织化学染色表明fbw7在小鼠肝脏、心脏、肾脏等组织的血管内皮中呈显著表达。同时我们利用RT-PCR和Western Blot实验方法,进一步证明了在以上血管丰富的脏器中fbw7的表达量丰富。这提示我们fbw7可能在血管生物学中发挥作用。二、fbw7蛋白表达量下调抑制内皮细胞的成管能力以及血管新生活性。 “内皮细胞成管实验”是检验内皮细胞血管新生活性的常规实验方法。用siRNA下调人脐静脉内皮细胞HUVECs中fbw7的表达量,发现内皮细胞的成管能力和血管新生活性均受到显著抑制。三、fbw7蛋白表达量下调抑制生理性和病理性血管新生。 “小鼠角膜微囊袋实验”和‘’Matrigel Plug实验”表明,在血管内皮生长因子VEGF诱导下,fbw7可以调控基质胶中新生血管的萌发,也可调控小鼠角膜区域的血管新生。四、fbw7蛋白表达量下调抑制畸胎瘤生长和畸胎瘤内部的血管发育。我们构建了强力霉素诱导shRNA表达的慢病毒载体,当我们用该慢病毒感

关键词：泛素-蛋白酶体蛋白质降解血管新生 fbw7 KLF2