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fabp7基因真核表达载体的构建及其对人乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用

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肿瘤防治研究 2009年第2期36卷 156-157页

作者：王毅君车团结张萍闫琨李琳王勤陈卫兰州大学基础医学院生物化学与分子生物学研究所 730000 兰州大学生命科学院细胞生物学研究所兰州大学生命科学院生物物理研究所

0 引言脑脂肪酸结合蛋白(BLBP/B-fabp,fabp7)通常在处于发育期中枢神经系统中的放射状胶质细胞和已分化的成年胶质细胞群例如神经胶质介膜细胞和Bergmann胶质细胞中表达~([1-2]),在成人中枢神经系统中的表达明显减少~([3]).有研究发现FA... 详细信息

0 引言脑脂肪酸结合蛋白(BLBP/B-fabp,fabp7)通常在处于发育期中枢神经系统中的放射状胶质细胞和已分化的成年胶质细胞群例如神经胶质介膜细胞和Bergmann胶质细胞中表达~([1-2]),在成人中枢神经系统中的表达明显减少~([3]).有研究发现fabp7的表达对构建和维持放射状神经胶质纤维系统是必需的~([4]).乳腺癌细胞和脑细胞同样富含脂肪,我们通过观察fabp7基因对人乳腺癌MCF-7细胞增殖能力的影响,为进一步研究fabp7的功能提供依据.

关键词：乳腺癌细胞 fabp7 抑制

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fabp7和MSI1与新城疫病毒V蛋白互作及抗病毒机制研究

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FABP7和MSI1与新城疫病毒V蛋白互作及抗病毒机制研究

作者：杨梦青西北农林科技大学

学位级别：硕士

自1926年首次报道新城疫(Newcastle Disease,ND)以来,它作为一种严重的传染病影响着世界各地的家禽业,已被世界动物卫生组织列为必须通报的疾病。新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)是一种带有囊膜的单股负链不分节段的RNA病毒,... 详细信息

自1926年首次报道新城疫(Newcastle Disease,ND)以来,它作为一种严重的传染病影响着世界各地的家禽业,已被世界动物卫生组织列为必须通报的疾病。新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)是一种带有囊膜的单股负链不分节段的RNA病毒,根据最新的病毒分类,属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)禽副黏病毒亚科(Avulavirinae)的正禽副黏病毒属(Orthoavulavirus)。NDV的6个结构基因按照3’-NP-P-M-F-HN-L-5’排列于基因组中。与其他副黏病毒一样,NDV编码非结构蛋白,通过RNA编辑现象在P基因保守的编辑位点插入一个或两个额外鸟嘌呤(G)分别翻译出V和W两个蛋白。P、V和W蛋白含有共同的氨基末端,而羧基末端不同。其中,NDV表达的V蛋白长度为239个氨基酸,分子量为36 kDa。研究发现,不能正常表达V蛋白的重组NDV致病性降低,对外源干扰素敏感性增加。失去V蛋白的NDV clone-30突变体无法在SPF鸡胚繁殖,说明V蛋白在病毒复制中发挥着重要作用。研究表明,V蛋白可通过其碳端结构域阻止干扰素应答的激活,从而帮助NDV在宿主细胞内顺利复制。既往研究表明,在干扰素表达缺陷细胞中,V蛋白碳端结构域的缺失降低了rNDV的复制水平,说明我们对V蛋白的功能尚未完全了解。(1)为了更进一步研究V蛋白在病毒复制阶段发挥的功能,实验室在之前的工作中通过酵母双杂交技术进行了筛选,检测到了多个可以与V蛋白产生相互作用的宿主蛋白。从中挑选了fabp7(脂肪酸结合蛋白7)和MSI1(Musashi RNA binding protein1),分别构建了fabp7和MSI1的真核表达载体。通过免疫共沉淀试验(Co-IP assay)和免疫荧光共定位试验验证fabp7和MSI1与V蛋白的相互作用。结果表明,fabp7和MSI1可以与NDV的V蛋白发生相互作用。(2)fabp7对病毒复制的影响。首先验证了fabp7的真核表达载体可以在DF-1细胞中正常工作。通过在DF-1细胞中过表达fabp7和用siRNA敲低fabp7,通过细胞空斑试验和Western Blot检测病毒含量,实验结果表明在过表达fabp7的DF-1细胞中病毒的复制受到了抑制。同时,使用siRNA敲低fabp7的内源性表达显示了相反的结果。进一步的研究结果表明,fabp7的过表达强烈引发了IRF3的磷酸化,增加了STAT1、TBK1的磷酸化水平。(3)MSI1的抗病毒机制研究。首先验证了MSI1真核表达载体可以在DF-1细胞中正常表达。然后,在DF-1细胞中过表达MSI1,通过Q-PCR、噬斑和Western Blot的方法检测病毒含量。通过荧光定量PCR和Western Blot对细胞中病毒mRNA水平和蛋白水平进行检测。结果表明,MSI1没有显著抑制细胞内病毒的复制过程。而通过细胞空斑试验检测细胞上清中的病毒粒子数量,发现MSI1的过表达减少了上清中的病毒粒子数量。随后结果表明发现MSI1的过表达抑制了细胞凋亡。综上所述,NDV的V蛋白可能通过与MSI1和fabp7互作,影响病毒复制。研究结果为进一步理解NDV复制过程中的分子机制奠定基础。

关键词：新城疫病毒 V蛋白 MSI1 fabp7

fabp7在癫痫模型中的表达及对癫痫发作的调控

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FABP7在癫痫模型中的表达及对癫痫发作的调控

作者：何微微川北医学院

学位级别：硕士

背景:癫痫(Epilepsy)是威胁人类健康的一种常见的慢性神经系统疾病。主要表现为大脑神经元反复异常放电,其高发病率和高致残率造成沉重的社会经济负担。癫痫的发病机制主要涉及离子通道、神经递质、神经胶质细胞、突触蛋白与突触可塑性... 详细信息

背景:癫痫(Epilepsy)是威胁人类健康的一种常见的慢性神经系统疾病。主要表现为大脑神经元反复异常放电,其高发病率和高致残率造成沉重的社会经济负担。癫痫的发病机制主要涉及离子通道、神经递质、神经胶质细胞、突触蛋白与突触可塑性等。其中,星形胶质细胞通过转运神经递质、调控离子通道及参与免疫应答而诱发癫痫是目前研究的热点。脂肪酸结合蛋白7(Fatty acid binding protein7,fabp7)是一类小分子胞浆蛋白,主要在海马星型胶质细胞中高表达,作为二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)的特异性配体参与细胞的维持和增殖。已有研究证明fabp7在神经发生、胶质增生、炎症等癫痫相关神经病理中发挥作用,推测fabp7可能参与了癫痫的发病机制。目的:建立海仁酸(Kainic Acid,KA)癫痫小鼠模型,检测fabp7在癫痫小鼠海马及皮层组织中蛋白水平及时空分布的表达变化。并应用腺相关病毒(Adeno-associated Virus,AAV)分别过表达和抑制fabp7,观察fabp7在KA模型中对癫痫发作的影响,探讨其对癫痫形成和进展的影响。方法:采用KA海马注射诱导癫痫模型。免疫印迹、免疫荧光检测fabp7时空表达变化。海马立体定位注射腺相关病毒干预fabp7表达,连续视频监测小鼠癫痫发作行为及在体多通道记录脑电活动改变等。1.选取成年雄性C57BL/6小鼠,海马内注射KA诱导癫痫动物模型。2.免疫印迹方法检测fabp7在癫痫组和对照组中的表达水平变化。免疫荧光方法检测fabp7脑区的表达部位。3.成年雄性C57BL/6小鼠随机分成4组:过表达组(AAV-fabp7组)、过表达空病毒组(con-AAV-fabp7)、干扰病毒组(AAV-shfabp7)、干扰空病毒组(con-shRNA)4组,海马内立体定位注射腺相关病毒并检测病毒转染效率。4.病毒注射3周后行KA癫痫模型造模,并记录造模后小鼠急性期和慢性期癫痫发作潜伏期、发作总持续时间。行为学结束后利用在体多通道技术记录海马内局部场电位,并进行统计分析,评估各组间小鼠癫痫发作的差异。结果:1.在KA癫痫小鼠急性期和慢性期模型中,fabp7在海马和皮质的表达水平较对照组均升高(Pfabp7主要在海马高表达,皮层也有部分表达,与星型胶质细胞和神经元均有共定位。3.通过海马立体定位注射腺相关病毒AAV-fabp7、con-AAV-fabp7、AAV-shfabp7、con-shRNA。3周后进行免疫荧光检测转染效率,结果显示海马区域有GFP阳性表达。免疫印迹结果检测转染水平,分别比较各组光密度(optical density,OD)值,过表达组OD值明显升高(P＜0.05),干扰组OD值显著降低(P7在KA急慢性期模型的皮层和海马组织中表达均显著增高,提示fabp7可能参与癫痫发作过程。2.通过腺相关病毒介导上调海马fabp7表达后,促进KA小鼠模型癫痫发作易感性及严重程度;相反,通过干扰海马fabp7表达,在KA小鼠模型观察到相反结果,提示fabp7可能参与癫痫发作的调控。

关键词： fabp7 癫痫星型胶质细胞神经元场电位

fabp7在肾癌脂肪代谢中的生物学功能研究

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FABP7在肾癌脂肪代谢中的生物学功能研究

作者：申骏龙延安大学

学位级别：硕士

背景:肾癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率逐年增加。早期肾癌的治疗以外科手术切除为主,但术后很快有约30%的患者出现复发或远处转移,转移性肾癌对放疗、化疗及细胞因子治疗高度耐受,并有严重不良反应,临床预后... 详细信息

背景:肾癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率逐年增加。早期肾癌的治疗以外科手术切除为主,但术后很快有约30%的患者出现复发或远处转移,转移性肾癌对放疗、化疗及细胞因子治疗高度耐受,并有严重不良反应,临床预后很差。这都极大地引起了科研工作者对肾癌基础及转化研究的兴趣。近10年来以索拉非尼为主的靶向血管生长的小分子化合物给转移性肾癌的治疗带来曙光。然而肾癌对这些药物的客观反应率很低,且极易发生耐药,治疗一段时间后耐药率约100%,加上药物的副作用与高昂的费用,这些致使肾癌血管靶向药物的临床应用前景不容乐观,进而也更加迫使人们对肾癌发生发展的分子生物学机制进行全面而彻底的研究,以期寻求肾癌治疗的全新靶点。研究证实,肿瘤细胞为适应异常增殖的能量和物质需求对自身代谢通路进行了重组,代谢重组突出表现为有氧糖酵解和脂类合成增强。脂类合成增强这一特征在肾癌中表现尤为鲜明,包括脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)在内的多种调控脂类代谢的基因被证实与肾癌密切相关,并参与肾癌的发生及演进。脂肪酸结合蛋白7(fatty-acid binding protein 7,fabp7)是细胞内脂肪酸结合蛋白家族成员之一,研究发现fabp7能结合及溶解长链多不饱和脂肪酸,具有脂肪酸摄取及向胞内转运等功能,调控细胞内的脂质代谢平衡。大量研究表明fabp7在肾癌中高表达并与肾癌的不良预后相关,然而fabp7在对肾癌脂肪代谢中的作用及相关机制尚无研究报道。目的:探讨fabp7在肾癌脂肪代谢中的生物学作用,同时研究fabp7对肾癌细胞生长的影响。方法:采用RT-PCR检测人正常肾小管上皮细胞HK-2和肾癌细胞OSRC-2、769-P、786-O及ACHN中fabp7 mRNA的表达情况。采用空质粒(VC)和fabp7过表达质粒(fabp7)转染内源性低水平表达fabp7的肾癌细胞系,采用G418筛选稳定转染细胞株,用免疫蛋白印迹验证转染效果。建立fabp7过表达、空质粒肾癌细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,观察肿瘤的生长现象,提取肿瘤组织制作冰冻切片,采用油红O染色检测脂肪含量。采用免疫组织化学染色的方法检测62例人肾癌组织中fabp7及FASN蛋白的表达情况,分析两种基因之间的相关性。采用RT-PCR检测转染空质粒(VC)和fabp7过表达质粒(fabp7)后的OSCR-2细胞内FASN mRNA的表达水平,进一步分析fabp7与FASN的相互关系。在过表达fabp7的OSCR-2细胞内共转染FASN的siRNA(siFASN),采用RT-PCR检测FASN mRNA的表达水平以证实基因沉默效率。采用MTT法检测转染空载体(VC)、fabp7过表达质粒(fabp7),共转染fabp7过表达质粒和FASN siRNA(fabp7+siFASN)三组细胞的体外生长能力。结果:fabp7 mRNA在不同细胞中的表达不完全相同(Pfabp7 mRNA的表达均较正常肾小管上皮细胞升高(Pfabp7 mRNA的表达水平存在差异,OSRC-2细胞中fabp7 mRNA表达水平最低(Pfabp7过表达组条带灰度值较VC组更高(Pfabp7组小鼠皮下瘤体积更大(Pfabp7组较VC组染色面积更大(Pfabp7组的FASN mRNA水平更高(Pfabp7组较VC组的肾癌细胞生长能力更强(Pfabp7过表达促进肾癌细胞的生长和脂肪合成,fabp7的表达和脂肪代谢关键基因(FASN)表达呈正相关,fabp7正向调控脂肪代谢关键基因(FASN)的表达,脂肪酸合成酶基因(FASN)参与fabp7介导的肾癌细胞体外生长。

关键词：肾癌脂肪代谢 fabp7 增殖

妊娠期脂多糖暴露对F1和F2子代衰老相关性焦虑样行为及海马FABP7...

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作者：陈静安徽医科大学

学位级别：硕士

背景:焦虑障碍具有很高的患病率,其风险随着年龄的增长而增加。感染是妊娠期暴露最常见的不良因素之一,产前母体感染可影响胚胎的神经系统发育,影响子代成年后的神经精神行为。关键发育时间点的产前炎症可能会导致子代焦虑表型的长期变... 详细信息

背景:焦虑障碍具有很高的患病率,其风险随着年龄的增长而增加。感染是妊娠期暴露最常见的不良因素之一,产前母体感染可影响胚胎的神经系统发育,影响子代成年后的神经精神行为。关键发育时间点的产前炎症可能会导致子代焦虑表型的长期变化,甚至引发代际间的行为表型变化。然而,妊娠晚期炎症暴露是否会对子代衰老相关性焦虑样行为产生代际传递影响及其可能机制在很大程度上尚不清楚。脂肪酸结合蛋白7（fabp7）在海马神经发生中起关键作用,与包括焦虑障碍在内的神经精神疾病密切相关,可能参与了衰老相关性焦虑样行为的改变。本研究旨在探究妊娠期炎症暴露是否会增加F1和F2子代的衰老相关性焦虑样行为,及该代际效应是否与海马区fabp7有关。目的:探究母体（F0代）妊娠晚期炎症暴露对F1和F2子代衰老相关性焦虑样行为和海马区fabp7的影响及该代际效应的潜在性别特异性。方法:CD-1母鼠（F0代）在妊娠期第15-17天每日接受脂多糖（LPS）腹腔注射（50μg/kg）或等容积的生理盐水,第一代小鼠（F1）分为四组:F1-LPS雄性（F1-LPS-M）、F1-LPS雌性（F1-LPS-F）、F1-CON雄性（F1-CON-M）和F1-CON雌性（F1-CON-F;每组n=10）组成。F1代小鼠与年龄匹配（2月龄）的未暴露小鼠（未暴露于脂多糖或生理盐水的母鼠）或非同窝的CD-1小鼠自然交配,以产生第二代（F2）。第二代小鼠（F2）分为五组:F1-LPS雌性的后代（F2-M-LPS）;F1-LPS雄性的后代（F2-F-LPS）;F1-LPS非同窝雌性和雄性的后代（F2-P-LPS）;F1-CON雌性的后代（F2-M-CON）;F1-CON雄性的后代（F2-F-CON）,每组n=20,其中雄性和雌性各10只。在F1和F2代小鼠3月龄和13月龄时采用旷场、高架十字迷宫和黑白巷任务来评估焦虑样行为。焦虑样行为测试15天后处死小鼠,取脑组织,利用蛋白质免疫印迹技术和实时定量聚合酶链式反应检测fabp7蛋白和信使RNA在海马区的表达水平。结果:⑴衰老效应:与3月龄CON小鼠相比,13月龄CON小鼠的旷场外周时间、黑白巷潜伏期和黑端时间显著增加（Psfabp7蛋白含量显著降低（Psfabp7水平均有显著性差异（Psfabp7蛋白表达显著降低（Psfabp7水平之间的差异均有统计学意义（Psfabp7蛋白表达最低（Psfabp7表达水平均显著低于M-CON组和F-CON组（Psfabp7与焦虑样行为:F1和F2代小鼠在3月龄和13月龄时的海马区fabp7表达水平与旷场任务的外周时间呈负相关,与跨格子数呈正相关;在黑白巷任务中,F1和F2代小鼠在3月龄和13月龄时的fabp7表达水平与潜伏期和黑端时间均呈显著负相关（Psfabp7的表达水平,且此效应可延续到F2代,其代际影响主要通过母系传递。此外,海马区fabp7的表达与焦虑相关任务中的表现显著相关。本研究提示,妊娠期炎症暴露可增加F1和F2子代衰老相关性焦虑样行为,其影响可能与fabp7的表达有关。

关键词：衰老焦虑海马 fabp7 代际传递小鼠脂多糖

人脑星型细胞瘤cDNA文库的构建及人脑脂肪酸结合蛋白基因fabp7的克隆

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人脑星型细胞瘤cDNA文库的构建及人脑脂肪酸结合蛋白基因FABP7的...

作者：张萍兰州大学

学位级别：硕士

星型细胞瘤是一种极具侵袭性的恶性神经胶质瘤,目前还没有非常有效的治疗方法。近年来,随着分子生物学的发展及新型抗肿瘤药物的研究,神经胶质瘤的治疗取得了一定的进展。但是,神经胶质瘤的早期诊断还是个尚未解决的难题。为了从分子水... 详细信息

星型细胞瘤是一种极具侵袭性的恶性神经胶质瘤,目前还没有非常有效的治疗方法。近年来,随着分子生物学的发展及新型抗肿瘤药物的研究,神经胶质瘤的治疗取得了一定的进展。但是,神经胶质瘤的早期诊断还是个尚未解决的难题。为了从分子水平探讨神经系统恶性肿瘤的发生、发展病因,我们建立了星型细胞瘤的cDNA文库,为筛选神经胶质瘤相关基因的研究工作奠定了基础,也有助于神经胶质瘤早期诊断并为它的免疫或基因治疗提供一个研究平台。本实验通过SMART(Switching Mechanism At 5'end of the RNA Transcript)技术构建了人脑星型胶质细胞瘤cDNA文库:将三例星型细胞瘤组织样本提取总RNA后进行纯化,以纯化得到的mRNA做模板,用M-MLV RTase及SMART引物合成cDNA第一链,然后进行LD-PCR(长距离PCR)扩增cDNA,将扩增后的cDNA片段进行凝胶电泳分析,从胶中分段回收DNA片段,纯化该片段后与pMD18T载体连接,转化*** DH5α构建cDNA文库。所构建的文库克隆数为2×10～5,90%克隆为阳性,插入片段大小为200-2500bp。用本室设计的人类脑脂肪酸结合蛋白(fabp7)引物从文库中进行定向克隆,得到了fabp7基因的全长序列,测序结果与GeneBank中的序列100%吻合,无突变。然后对神经胶质瘤和来自同一病人的癌旁组织进行了fabp7表达含量检测,发现fabp7的表达水平随肿瘤组织恶性程度的升高有降低的趋势。

关键词：星型细胞瘤 SMATR技术 cDNA文库 fabp7

miR-502-3p通过对fabp7的调节作用抑制肾透明细胞癌进展的分子机制研究

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罕少疾病杂志 2024年第2期31卷 71-73页

作者：刘正清梁冬波丁红龙四军马将糯曾丽君湖北中医药大学附属随州中医医院重症医学科湖北随州441300

目的探究mi R-502-3p通过对脂肪酸结合蛋白7(fabp7)的调节作用抑制肾透明细胞癌(CCRCC)进展的分子机制。方法本研究通过病例对照研究,对100名肾透明细胞癌患者及100名健康对照者fabp7的mi R-502结合位点基因型测序,分析基因型与肾透明... 详细信息

目的探究mi R-502-3p通过对脂肪酸结合蛋白7(fabp7)的调节作用抑制肾透明细胞癌(CCRCC)进展的分子机制。方法本研究通过病例对照研究,对100名肾透明细胞癌患者及100名健康对照者fabp7的mi R-502结合位点基因型测序,分析基因型与肾透明细胞癌发病风险之间关系,并通过免疫组织化学法测定不同基因型肾透明细胞癌肿瘤组织fabp7蛋白表达量,分析fabp7基因表达量与mi R-502-3p之间关系,为肾透明细胞癌防治提供参考。结果分析mi R-502有3个基因型:TT、CT和CC,在100例CCRCC患者中,TT、CT、CC基因型频率分别是57.00%、33.00%、10.00%,C、T等位基因频率在CCRCC病人和健康者之间有差异(Pfabp7与CC基因型无显著差异(P>0.05),fabp7在CT、TT型呈高表达(Pfabp7的表达,进而家加速CCRCC细胞凋亡,有可能作为肾癌治疗的潜在靶点。

关键词：肾透明细胞癌 miR-502-3p fabp7 危险因素和预后

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脂肪酸结合蛋白7对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性的影响

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中风与神经疾病杂志 2020年第11期37卷 1004-1010页

作者：陈丽折霞谷超超张晓辉赵嘉欣袁蕊李锐陕西省人民医院神经内三科陕西西安710068

目的探究脂肪酸结合蛋白7(fabp7)对脑缺血再灌注(I/R)大鼠血脑屏障(BBB)通透性的影响,及其涉及的机制。方法将大鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养以建立BBB细胞模型。用氧葡萄糖剥夺再复氧(OGD/R)方式建立I/R损伤BBB模型;用fabp... 详细信息

目的探究脂肪酸结合蛋白7(fabp7)对脑缺血再灌注(I/R)大鼠血脑屏障(BBB)通透性的影响,及其涉及的机制。方法将大鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养以建立BBB细胞模型。用氧葡萄糖剥夺再复氧(OGD/R)方式建立I/R损伤BBB模型;用fabp7重组蛋白(rh-fabp7)单独处理,或与S7155共处理此细胞模型。采用ENDOHM仪器、Western blotting法、流式细胞术分别测定细胞跨内皮电阻(TEER)、fabp7和紧密连接(TJ)以及基质金属蛋白酶(MMP)蛋白表达、细胞凋亡。建立大鼠脑I/R模型,腹腔注射rh-fabp7,采用神经功能评分法、湿重和干重法、伊文思蓝染色法分别测定大鼠神经功能、脑含水量、BBB通透性。结果过表达fabp7逆转OGD/R诱导的fabp7和TJ蛋白表达、及TEER的下调,以及MMP2/9表达和细胞凋亡的上调(P7155处理促进fabp7对MMP2/9和TJ蛋白表达、TEER、以及细胞凋亡的作用(Pfabp7逆转I/R诱导的大鼠神经功能评分、脑含水量、BBB通透性上调及fabp7蛋白表达下调(Pfabp7通过抑制MMP2/9,减轻脑I/R对BBB完整性的破坏。

关键词： fabp7 血脑屏障 MMP2/9 脑缺血再灌注

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