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f81细胞无血清悬浮驯化后培养猫泛白细胞减少症病毒的研究

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动物医学进展 2023年第1期44卷 48-53页

作者：张久鑫邵宝顺朱辉贾浩苒梁琳汤新明崔尚金梁瑞英王龙涛吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100089 广东省华晟生物技术有限公司广东广州511300

为解决国内猫泛白细胞减少症生物制品短缺的问题,筛选出适用于猫泛白细胞减少症病毒增殖的猫肾细胞系(f81),通过对贴壁f81进行降血清悬浮驯化培养,得到了无血清全悬浮培养f81细胞系。研究建立的f81细胞系在初始传代细胞密度为1×10^(6)c... 详细信息

为解决国内猫泛白细胞减少症生物制品短缺的问题,筛选出适用于猫泛白细胞减少症病毒增殖的猫肾细胞系(f81),通过对贴壁f81进行降血清悬浮驯化培养,得到了无血清全悬浮培养f81细胞系。研究建立的f81细胞系在初始传代细胞密度为1×10^(6)cells/mL时,培养48 h后细胞密度可达到7.02×10^(6)cells/mL。对培养猫泛白细胞减少症病毒工艺进行摸索,确定最佳接毒工艺为同步接毒法,初始接毒细胞密度为1×10^(6)cells/mL、MOI为3.5×10^(-2),培养72 h后收毒,病毒滴度可达到10^(7.25)TCID_(50)/0.1 mL。该方法使用同源细胞系且未添加动物血清,为猫泛白细胞减少症生物制品生产降低了下游生产纯化难度,同时降低了生产成本,可显著提高产品核心竞争力。研究结果可为其他猫用生物制品相关研究提供参考。

关键词： f81细胞细胞驯化无血清悬浮培养猫泛白细胞减少症病毒

复方苦芩总生物碱保护f81细胞免受犬细小病毒损伤作用的探究

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西南大学学报（自然科学版） 2015年第9期37卷 11-18页

作者：邵秋红朱买勋朱兆荣罗艺晨刘娟薛新芳西南大学(荣昌校区)动物医学系重庆荣昌402460

为了探讨中药复方苦芩总生物碱(Total Alkaloids in Kuqin Compound,TAKC)保护f81细胞免受犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)损伤的作用机理,用CPV感染f81细胞,选择不同浓度的TAKC进行体外抗CPV感染f81细胞试验,采用琥珀酸脱氢酶活力... 详细信息

为了探讨中药复方苦芩总生物碱(Total Alkaloids in Kuqin Compound,TAKC)保护f81细胞免受犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)损伤的作用机理,用CPV感染f81细胞,选择不同浓度的TAKC进行体外抗CPV感染f81细胞试验,采用琥珀酸脱氢酶活力测定法检测TAKC对f81细胞的保护率,用RT-PCR法检测TAKC处理对感染CPV的f81细胞中caspase-3基因mRNA表达水平的影响.结果显示,TAKC对f81细胞有保护作用,其在整个病毒复制过程中(直接灭活作用、阻滞作用、吸附抑制作用、穿入抑制作用和复制抑制作用)均有明显的影响,其中阻滞作用、穿入抑制作用和复制抑制作用效果最明显,对细胞的保护率分别能达到31.19%,20.54%,32.28%.同时使感染CPV的f81细胞的caspase-3基因表达水平显著降低(p818.因此,推测TAKC可通过阻滞抑制、穿入抑制和DNA复制抑制CPV感染f81细胞和降低f81细胞中caspase-3基因表达水平,起到保护f81细胞免受CPV损伤的作用.

关键词：复方苦芩总生物碱犬细小病毒 f81细胞抗损伤

猪细小病毒在f81细胞和PK15细胞增殖的研究

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畜牧与兽医 2012年第3期44卷 59-61页

作者：张磊程磊丁静静杨琴李巧云河南省开封市畜产品质量监测检验中心河南开封475000 山东滨州博莱威生物技术研究所山东滨州256600

将猪细小病毒(PPV)接种于f81和PK15细胞,研究不同的培养基、pH值、血清含量、细胞密度对病毒在细胞里增殖的影响,细胞毒液冻融3次后测半数组织细胞感染量(TCID50)。试验结果表明,接毒24 h后f81和PK15细胞都有病变产生,在细胞病变达到75... 详细信息

将猪细小病毒(PPV)接种于f81和PK15细胞,研究不同的培养基、pH值、血清含量、细胞密度对病毒在细胞里增殖的影响,细胞毒液冻融3次后测半数组织细胞感染量(TCID50)。试验结果表明,接毒24 h后f81和PK15细胞都有病变产生,在细胞病变达到75%以上时收获细胞毒液,发现PPV在f81细胞和PK15细胞中均能增殖且病毒滴度比较高。测得f81细胞接种PPV最高滴度为108.71TCID50/mL;PK15细胞接种PPV最高滴度为108.73TCID50/mL。

关键词：猪细小病毒 f81细胞 PK15细胞增殖

猫肾细胞系f81传代细胞染色体遗传变异率分析

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江苏农业科学 2010年第6期38卷 68-69页

作者：丁晓麟温海秦海斌陈杨张汇东公安部南京警犬研究所江苏南京210012

运用空气干燥法制备猫肾细胞系f81传代细胞染色体标本,常规Giemsa染色,计数f81细胞基础细胞库细胞(10代)、工作细胞库细胞(20代)、最高限制代次细胞(40代)及高于最高代次10代细胞(50代)中期分裂相染色体数目,计算染色体数目变异率,并进... 详细信息

运用空气干燥法制备猫肾细胞系f81传代细胞染色体标本,常规Giemsa染色,计数f81细胞基础细胞库细胞(10代)、工作细胞库细胞(20代)、最高限制代次细胞(40代)及高于最高代次10代细胞(50代)中期分裂相染色体数目,计算染色体数目变异率,并进行核型分析。结果表明,f81为亚二倍体细胞系,染色体众数为30,染色体各代次结构畸变率为0。f81细胞系遗传学特性相对稳定,在基础细胞库中存在的染色体标志,在最高代次细胞中也存在,并且核型相同,可候选为制苗用细胞。

关键词： f81细胞染色体核型变异率

f81单克隆细胞株无血清悬浮驯化后用于繁殖猫泛白细胞减少症病毒的初步探究

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F81单克隆细胞株无血清悬浮驯化后用于繁殖猫泛白细胞减少症病毒...

作者：张久鑫吉林农业大学

学位级别：硕士

猫泛白细胞减少症在世界范围内普遍存在,对宠物、养殖业及野生动物存在重大威胁。此病具有极高的感染率和致死率,且预后效果较差,接种疫苗被认为是最有效的防控手段。在疫苗制备过程中,抗原的制备是重要的环节,直接影响着疫苗的质量。... 详细信息

猫泛白细胞减少症在世界范围内普遍存在,对宠物、养殖业及野生动物存在重大威胁。此病具有极高的感染率和致死率,且预后效果较差,接种疫苗被认为是最有效的防控手段。在疫苗制备过程中,抗原的制备是重要的环节,直接影响着疫苗的质量。目前大部分生物制品多采用转瓶培养或微载体培养,产出的病毒效价较低,而且由于血清的使用使得产品成本居高不下,批次间差异大,质量不稳定,且容易产生污染。从行业发展和产品竞争力考虑,应用悬浮培养细胞系,通过对生物反应器培养参数的控制,开展大规模动物病毒培养,有助于降本增效,提高产品品质和企业核心竞争力。本研究从用于生产猫泛白细胞减少症疫苗的猫肾细胞(f81)系出发,采用逐步降血清法、有限稀释法和悬浮驯化等方法得到单克隆低血清悬浮f81细胞系。进而优化血清浓度、培养基、细胞传代密度、摇床转速和冻存条件等培养参数。结果表明,驯化得到的低血清单克隆f81-18细胞株,低血清悬浮细胞培养血清浓度为2%,最佳传代密度为1×10cells/m L,细胞培养72 h后达到最大密度5.83×10 cells/m L,此时细胞活率为92%。无血清单克隆株f81-09最佳培养条件为,使用无血清培养基M-03-01、细胞传代密度1.0×10cells/mL、摇床转速120 r/min、培养温度37℃。此培养条件下无血清单克隆株f81-09,细胞培养96 h后达到最大生长密度8.63×10 cells/m L,细胞活率为90%。细胞最佳冻存条件为冻存密度为1.5×10 cells/m L,冻存液组成成分为无血清培养基、胎牛血清和DMSO,相应比例为6:3:1。对猫泛白细胞减少症病毒悬浮培养关键技术参数开展优化分析,筛选细胞接种密度、MOI、培养温度等参数,进而根据病毒滴度变化确定培养条件及收毒时间。利用控制变量法筛选出适合无血清单克隆株f81-09培养猫泛白细胞减少症病毒的培养参数。结果表明,猫泛白细胞减少症病毒最佳培养工艺为,采用同步接毒法,接毒时细胞密度为1.0×10cells/m L,MOI为3.5×10,摇床转速为120 r/min、在37℃条件下培养。接毒后培养72h,培养得到的猫泛白细胞减少症病毒病毒滴度最大可达到10TCID/0.1mL,制备抗原生产疫苗,动物免疫后28 d,HI≥1∶1024。在15 L生物反应器中对培养参数p H、溶氧浓度、搅拌速度、温度进行筛选。结果表明生物反应器培养无血清单克隆株f81-09最佳培养条件为p H=7.1、溶氧浓度为50%、搅拌速度为80 rpm、温度为37℃。综上所述,本研究建立的无血清悬浮培养f81细胞可在生物反应器中稳定生长,可快速规模化繁殖病毒,且采用无血清培养基,可显著降低生产成本,提高成本效益。本文报道贴壁f81细胞成功适应无血清悬浮培养,达到了降本增效的目的,彰显了其在相关生物制品生产中的巨大潜力。利用优化后的病毒悬浮培养工艺,将所得病毒液制备疫苗对家猫进行免疫,初步评价,结果显示疫苗的免疫原性及安全性良好。为下一步生物反应器规模化生产猫泛白细胞减少症疫苗提供了基础数据,为其他以f81细胞作为细胞基质的生物制品研发提供参考和借鉴。

关键词： f81细胞单克隆悬浮驯化无血清全悬浮培养猫泛白细胞减少症病毒规模化培养

利巴韦林对猫细小病毒诱导的细胞凋亡抑制作用

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黑龙江畜牧兽医（下半月） 2015年第8期 122-125,217,218页

作者：胡莲美郑良焰余文兰李英潘家强吴玄光唐兆新华南农业大学兽医学院广州510642

为了研究利巴韦林对感染猫细小病毒(fPV)细胞的影响,试验将猫肾细胞(f81细胞)随机分为对照组、病毒组、药物组,采用MTT法检测细胞的生长曲线,Hochest 33258染色观察细胞的细胞核形态,流式细胞仪检测细胞周期。结果表明:Hochest 33258染... 详细信息

为了研究利巴韦林对感染猫细小病毒(fPV)细胞的影响,试验将猫肾细胞(f81细胞)随机分为对照组、病毒组、药物组,采用MTT法检测细胞的生长曲线,Hochest 33258染色观察细胞的细胞核形态,流式细胞仪检测细胞周期。结果表明:Hochest 33258染色试验中药物组与病毒组差异不显著(P>0.05);药物组细胞的增殖活性始终高于病毒组,但低于对照组;流式细胞仪检测利巴韦林治疗后48小时G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,G2/M期细胞变化不大;72小时G2/M期细胞增多;药物组与病毒组细胞的流式检测在G1峰的左侧均出现典型的亚G1峰,但各时间点药物组细胞的凋亡指数均明显低于病毒组。说明利巴韦林能抑制fPV诱导的细胞凋亡,具有一定的治疗指导意义。

关键词：猫细小病毒利巴韦林细胞凋亡细胞周期 f81细胞

利巴韦林对感染猫细小病毒细胞的治疗作用研究

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黑龙江畜牧兽医 2015年第4期 43-46,51页

作者：胡莲美郑良焰余文兰唐兆新华南农业大学兽医学院广州510642

为了研究利巴韦林对感染猫细小病毒(fPV)细胞的作用,试验采用f81猫肾细胞,在猫细小病毒感染后不同时间点收集细胞,应用MTT法检测细胞的增殖活性;利用利巴韦林毒性试验,摸索出药物对细胞的安全浓度;利用不同浓度利巴韦林处理已攻毒细胞,... 详细信息

为了研究利巴韦林对感染猫细小病毒(fPV)细胞的作用,试验采用f81猫肾细胞,在猫细小病毒感染后不同时间点收集细胞,应用MTT法检测细胞的增殖活性;利用利巴韦林毒性试验,摸索出药物对细胞的安全浓度;利用不同浓度利巴韦林处理已攻毒细胞,MTT法检测细胞的增殖活性,酶标法检测细胞氧化损伤情况。结果表明:利巴韦林能明显抑制fPV引起的细胞死亡率,病毒组过氧化氢(H2O2)含量和细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性在各个采样时间点均显著高于对照组,显示细胞氧化损伤严重,致使LDH从细胞内渗出。病毒组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性和还原型谷胱甘肽(GSH)含量均明显低于对照组,揭示病毒所引起的细胞氧化损伤进一步激发了细胞自体保护性ROS清除机制,最终导致了细胞内SOD活性和GSH含量的下降。利巴韦林药物组LDH活性和H2O2含量都呈现升高趋势,但其增长幅度明显低于病毒组;在各采样时间点,药物组细胞内SOD活性和GSH含量均明显(P细胞具有一定的修复治疗效果。

关键词：利巴韦林猫细小病毒(fPV) 抗氧化 f81细胞治疗

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猫杯状病毒的分离鉴定及其细胞传代

猫杯状病毒的分离鉴定及其细胞传代

作者：应瑛吉林农业大学

学位级别：硕士

猫杯状病毒(feline calicivirus,fCV)是杯状病毒科的成员,是引起猫科动物疾病的一种重要病原体。猫感染fCV后,出现发热、口腔溃疡、鼻-结膜炎等临床症状,发病严重时会导致死亡。猫杯状病毒流行广泛,在世界多个国家均有流行。我国从猫、... 详细信息

猫杯状病毒(feline calicivirus,fCV)是杯状病毒科的成员,是引起猫科动物疾病的一种重要病原体。猫感染fCV后,出现发热、口腔溃疡、鼻-结膜炎等临床症状,发病严重时会导致死亡。猫杯状病毒流行广泛,在世界多个国家均有流行。我国从猫、老虎、猎豹等多种动物体内分离到fCV。不同猫杯状病毒毒株间变异程度较大,抗原性有差异,现有疫苗并不能提供完全的保护效果。目前,猫杯状病毒疫苗主要为弱毒疫苗和灭活疫苗,随着fCV的广泛流行,不断出现新的变异毒株。因此,开展对fCV的相关研究对其防控具有重要的意义。本研究对采自吉林地区疑似猫传染性鼻结膜炎患猫鼻咽拭子进行处理后,在f81细胞上进行分离培养,开展分子生物学、形态学、免疫学等系统鉴定;将分离病毒及实验室保存的1株豹源猫杯状病毒在f81细胞上连续传至20代。每次细胞传代前,测定病毒的半数感染量(TCID50),然后以0.1MOI的感染复数接种f81细胞,记录病变时间,并绘制病毒的生长曲线;采用RT-PCR方法扩增fCV各代次(P1、P5、P10、P15、P20)的ORf2基因片段,进行基因序列的测定;利用DNASTAR、MEGA等软件将测序结果与Genbank上收录的fCV参考序列进行比对,分析其氨基酸变异位点,并绘制遗传进化树;应用Net NGlyc1.0、Yin OYang1.2、Prot Scale等在线软件预测ORf2基因编码蛋白的糖基化位点和疏水性。实验结果显示,猫鼻咽拭子接种f81细胞后,出现葡萄串样典型病变,经过分子生物学、形态学和免疫学鉴定,证实所分离毒株为猫杯状病毒,分别命名为CH-JL1株、CH-JL2株、CH-JL3株和CH-JL4株;细胞传代后,5株fCV滴度逐渐稳定,最终达到109.0TCID50/mL以上;生长曲线测定结果表明,fCV各毒株在细胞上的复制特点有差异,CH-JL3株和CH-SH株在16h左右达到最高的病毒滴度,CH-JL2株和CH-JL4株均在20h左右病毒滴度最高,而CH-JL1株病毒的滴度高峰在24h之后;ORf2基因序列比对分析结果表明,fCV细胞传代后的氨基酸变异位点包括CH-JL1株的P57S和G494R、CH-JL3株的S440L和N519D、CH-JL4株的V614I、CH-SH株的K448R;遗传进化分析表明CH-JL2株和CH-JL3株处于同一进化分支上,同源性为95.9%;CH-JL1株和国内fB-NJ-13株、CH-SH株和国内GD株分别在一个进化分支,CH-JL4株和国外f65株遗传关系较近。ORf2基因编码蛋白的糖基化位点和疏水性预测分析发现5株fCV疏水性相似,均存在多个O-糖基化位点。本研究从猫鼻咽拭子中成功分离出猫杯状病毒,通过细胞连续传代,获得了滴度高、稳定性好的猫杯状病毒株,为下一步fCV疫苗株的研发打下了基础。

关键词：猫杯状病毒细胞传代 f81细胞基因变异

5株猫杯状病毒中国分离株的细胞适应性及遗传进化分析

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经济动物学报 2016年第1期20卷 8-12页

作者：应瑛王一鸣马剑钢曹东梅李响高玉伟杨松涛胡桂学吉林农业大学动物科学技术学院军事医学科学院军事兽医研究所

将CH-JL1、CH-JL2、CH-JL3、CH-JL4、CH-SH 5株猫杯状病毒中国分离株分别在f81细胞上连续传至15代。细胞传代前,测定病毒的细胞半数感染量(TCID;),再以0.1 MOI的感染复数接种细胞。采用RTPCR方法扩增fCV各代次的ORf2基因片段并测序,用DN... 详细信息

将CH-JL1、CH-JL2、CH-JL3、CH-JL4、CH-SH 5株猫杯状病毒中国分离株分别在f81细胞上连续传至15代。细胞传代前,测定病毒的细胞半数感染量(TCID;),再以0.1 MOI的感染复数接种细胞。采用RTPCR方法扩增fCV各代次的ORf2基因片段并测序,用DNASTAR和MEGA软件分析其氨基酸变异和遗传进化特点。试验结果显示,细胞适应传代后,fCV各代次毒株滴度逐渐稳定,均位于10;TCID;/mL;0;。TCID;/mL之间。ORf2基因测序表明,fCV传代后氨基酸变异位点包括CH—JL1的P57S和G494R、CH-JL3的S440L和N519D、CH—JL4的V614I、CH—SH的K448R。遗传进化分析表明CH—JL2和CH-JL3处于同一进化分支上,同源性为95.9%;CH-JL1和国内fB-NJ-13株、CH-SH和国内GD株分别在一个进化分支,CH-JL4和国外f65株遗传关系较近。5株猫杯状病毒在f81细胞传代后滴度较高,稳定性良好,为将来fCV疫苗株的研发奠定了基础。

关键词：猫杯状病毒 f81细胞适应性传代