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红巴梨f3h基因的克隆及植物表达载体的构建

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南京林业大学学报（自然科学版） 2005年第2期29卷 65-68页

作者：张大生崔丽洁王景明吴少华徐州师范大学生命科学学院江苏徐州221116 福建农林大学园艺学院福建福州350002

以成熟红巴梨果皮的总 RNA为模板,根据仁果类果树的 f3h基因的保守序列设计引物,利用 RT PCR方法从果皮中克隆出花青素生成相关基因 f3h基因的全长 cDNA,并将该片段连接到 pGEM T easy载体中。核苷酸序列测定表明,该基因全长1 095 bp,... 详细信息

以成熟红巴梨果皮的总 RNA为模板,根据仁果类果树的 f3h基因的保守序列设计引物,利用 RT PCR方法从果皮中克隆出花青素生成相关基因 f3h基因的全长 cDNA,并将该片段连接到 pGEM T easy载体中。核苷酸序列测定表明,该基因全长1 095 bp,与苹果的f3h基因同源性高达92%,与矮牵牛相似系数达83%,与拟南芥相似系数达到82%。利用EcoRⅤ和BglⅡ对重组质粒进行酶切,回收 1 095 bp条带,并将其连接到 pBI121载体上,通过抗性筛选和PCR检测,证实了f3h基因已经构建到植物表达载体 pBI121上。

关键词：花青素 f3h基因克隆载体

梨f3h基因的克隆及植物载体的构建及应用RAPD技术对梨部分品种亲缘关系的探讨

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梨f3h基因的克隆及植物载体的构建及应用RAPD技术对梨部分品种亲...

作者：崔丽洁福建农林大学

学位级别：硕士

论文第一部分概述了花色素基因工程研究进展。以成熟红巴梨果皮花青素相关基因f3h基因的两个片段为模板，克隆得到了f3h基因cDNA全长，并对序列进行了初步分析。核苷酸序列分析表明，该片段与苹果的f3h基因同源性高达97％。在f3h基因两... 详细信息

论文第一部分概述了花色素基因工程研究进展。以成熟红巴梨果皮花青素相关基因f3h基因的两个片段为模板，克隆得到了f3h基因cDNA全长，并对序列进行了初步分析。核苷酸序列分析表明，该片段与苹果的f3h基因同源性高达97％。在f3h基因两侧分别引入了酶切位点，以利于植物表达载体的构建，检测表明成功地将f3h基因转入了pBI121载体。论文第二部分主要介绍了RAPD在果树研究中的应用。对梨基因组DNA的提取作出探索，并以此为模板对影响RAPD扩增的重要参数进行优化试验，建立了梨RAPD反应的优化体系(PCR扩增体系条件是：20μ1体积中，dNTP200μM、MgCl 2.5mM、随机引物0.2μM、DNA模板50ng、Taq酶1-2U)。用该优化体系对梨部分品种进行鉴定，探讨了它们之间的差异和亲缘关系。聚类分析结果显示，西洋梨系统与东方梨系统之间亲缘关系较远，而砂梨与白梨亲缘关系较近，不能各自聚类。

关键词：花青素 f3h基因克隆表达载体梨亲缘关系 RAPD

粘毛黄芩f3h基因表达载体构建及转化烟草研究

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粘毛黄芩F3H基因表达载体构建及转化烟草研究

作者：李鹏西南大学

学位级别：硕士

粘毛黄芩(Scutellaria viscidula Bge.)为唇形科黄芩属植物,具有抗炎、抗癌、抗氧化等多种生物活性。其药理作用有效成分主要是黄酮类化合物,其临床需求量增加迅速,而粘毛黄芩野生资源破坏严重,野生资源面临枯竭,无法满足人们的需要。... 详细信息

粘毛黄芩(Scutellaria viscidula Bge.)为唇形科黄芩属植物,具有抗炎、抗癌、抗氧化等多种生物活性。其药理作用有效成分主要是黄酮类化合物,其临床需求量增加迅速,而粘毛黄芩野生资源破坏严重,野生资源面临枯竭,无法满足人们的需要。黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase, f3h)基因是整个黄酮类化合物代谢途径的中枢位点,调控着合成途径中的代谢流向。它催化柚皮素生成二氢黄酮醇(DhK),而DhK是黄酮类化合物生物合成中生成黄酮、花色素和异黄酮等黄酮类化合物的重要中间产物。为了研究粘毛黄芩黄酮化合物生物合成途径,进而为提高粘毛黄芩体内的黄芩苷含量奠定基础。本研究采用基因超表达和反义抑制研究粘毛黄芩f3h基因的功能,构建了f3h基因超表达和反义植物载体,转化烟草植株,并测定了总黄酮含量,获得的主要结果如下： 1、f3h基因原核表达载体的构建用RT-PCR扩增目的基因Svf3h连接pMD19-T克隆载体,测序正确后,双酶切含目的基因的克隆载体pMD19-Svf3h和表达载体质粒pQE30,将目的片段Svf3h与载体pQE30酶切大片段连接,构建成原核表达载体pQE30-Svf3h转化原核表达菌M15,经检测验证,得到原核表达菌M15-pQE30-Svf3h。 2、f3h基因正、反义植物表达载体的构建及农杆菌菌株的转化酶切植物克隆表达载体pCXSN质粒,RT-PCR扩增目的基因Svf3h,回收目的片段与载体,构建成Svf3h的正、反义植物表达载体,结果构建了1种正义pCXSN-Svf3h,2种反义表达载体pCXSN-antiSvf3h,将验证正确的植物表达载体转入农杆菌EhA105,得到EhA105-Svf3h/anti Svf3h农杆菌工程菌。 3、根癌农杆菌介导的f3h基因对烟草的遗传转化及PCR鉴定观察转化的烟草再生过程发现转化f3h基因的烟草植株与未转化烟草植株,在形态上并无明显的差异。根据已知粘毛黄芩f3h基因、潮霉素基因序列设计特异引物,对转化的烟草植株进行PCR检测。PCR分析显示,正、反义Svf3h均被整合到烟草基因组中,筛选得到8株阳性反义烟草植株,6株阳性正义烟草植株。 4、转Svf3h烟草总黄酮含量的测定各选5株PCR检测结果阳性转化植株,3株未转化烟草植株作为对照,提取叶片中的总黄酮,用比色法测量其相对含量。结果表明,正义烟草植株总黄酮的平均含量为2.19%明显高于反义植株总黄酮类化合物1.39%的含量。阳性正义烟草植株总黄酮的含量与反义烟草阳性植株以及未转化烟草植株的黄酮含量有明显的差异。

关键词：粘毛黄芩 f3h基因黄酮类化合物载体构建遗传转化

苹果梨ChI和f3h基因克隆与解袋前后果皮中的表达规律研究

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苹果梨CHI和F3H基因克隆与解袋前后果皮中的表达规律研究

作者：刘振坤延边大学

学位级别：硕士

本试验采用RT-PCR技术成功克隆出了影响苹果梨果皮着红色的关键酶基因ChI和f3h并做了相关生物信息学分析,之后采用实时荧光定量PCR对其在解袋前后的表达规律进行了检测。结果如下：1.通过ChI、f3h基因保守区分别设计一对引物对苹果梨果... 详细信息

本试验采用RT-PCR技术成功克隆出了影响苹果梨果皮着红色的关键酶基因ChI和f3h并做了相关生物信息学分析,之后采用实时荧光定量PCR对其在解袋前后的表达规律进行了检测。结果如下：1.通过ChI、f3h基因保守区分别设计一对引物对苹果梨果皮cDNA进行扩增,得到了苹果梨ChI和f3h基因全长,大小分别为702bp和1095bp,推断其分别编码234个和364个氨基酸。2.比对结果显示苹果梨ChI、f3h与大多数已登录Genbank的蔷薇科植物碱基相似性在90%左右,部分物种高达98%以上。其中苹果梨ChI与西洋梨ChI基因相似度为98%,与沙梨ChI基因相似度为96%;f3h基因与西洋梨f3h基因相似度为99%,与苹果f3h基因相似度为98%。系统发育分析表明,苹果梨ChI基因与西洋梨ChI基因亲缘关系最近,沙梨次之;f3h基因与西洋梨f3h基因亲缘关系最近,草莓次之,与同为梨属的沙梨亲缘关系也较近。3.荧光定量PCR结果表明,套袋会抑制苹果梨果皮ChI基因的表达,解袋后ChI基因的表达量会先在短时间内达到一个较高水平,然后下降,之后伴随着果实成熟和花青苷积累ChI基因表达量又逐渐升高,说明ChI基因是受光诱导表达的酶基因,与苹果梨果皮花青苷的合成密切相关;套袋对苹果梨果皮f3h基因的表达起明显的抑制作用,解袋后f3h基因表达量会迅速达到峰值并一直保持在峰值左右,说明f3h基因也属于光诱导表达的酶基因,但与苹果梨果皮花青苷的合成关系并不密切,推测其可能与其他与花青苷合成有关的基因协调起作用。

关键词：苹果梨 ChI基因 f3h基因克隆表达分析

红巴梨果实花青素生成相关基因f3h全长片段的克隆

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福建农林大学学报（自然科学版） 2002年第3期31卷 361-365页

作者：吴少华张大生福建农林大学园艺学院福建福州350002

利用 RT-PCR方法从红巴梨成熟果皮中克隆出花青素生成相关基因 f3 h的全长片段 (1 0 95 bp) .核苷酸序列测定表明 ,该基因与苹果的 f 3 h基因同源性高达 97% .

关键词：红巴梨果实花青素全长片段克隆 f3h基因基因生成

应用RAPD技术对（木奈）亲缘关系的探讨及红巴梨花青素生成相关基因f3h和dfr基因的克隆

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应用RAPD技术对（木奈）亲缘关系的探讨及红巴梨花青素生成相关基...

作者：张大生福建农林大学

学位级别：硕士

论文第一部分对(木奈)基因组DNA的提取作出探索，并以此为模板对影响RAPD扩增的重要参数进行优化试验，建立了(木奈)RAPD反应的优化体系(PCR扩增体系条件是：20μl体积中，dNTP200μM、MgCl2.5mM、随机引物0.2μM、DNA模板50ng、Taq酶1-... 详细信息

论文第一部分对(木奈)基因组DNA的提取作出探索，并以此为模板对影响RAPD扩增的重要参数进行优化试验，建立了(木奈)RAPD反应的优化体系(PCR扩增体系条件是：20μl体积中，dNTP200μM、MgCl2.5mM、随机引物0.2μM、DNA模板50ng、Taq酶1-2U)。用该优化体系对(木奈)、桃、李部分品种进行鉴定，并探讨了(木奈)与桃、李之间的亲缘关系。聚类分析结果显示，(木奈)并非是桃和李的杂交种，应当归于李属的一个种或变种。论文第二部分以改良CTAB法从成熟红巴梨果皮中提取总RNA，并以此为模板，使用RACE方法成功分离出与花青素生成相关基因f3h基因cDNA的两个片段。该片段经拼接得到1095bp全长序列，并对序列进行了初步分析。核苷酸序列表明，该片段与苹果的f3h基因同源性高达97％。但用同样方法却未能从果皮中分离出dfr基因。

关键词： (木奈) 品种鉴定亲缘关系 RAPD 花青素 f3h基因克隆

三色堇Vwf3h基因启动子克隆及其功能分析

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南方农业学报 2024年

作者：许晓兰黎洁许慧娴周扬赵莹彭婷王健海南大学热带农林学院/海南省热带特色花木资源生物学重点实验室/热带特色林木花卉遗传与种质创新教育部重点实验室华中农业大学生命科学技术学院

【目的】f3h基因是花青素合成代谢途径中的关键酶之一，研究其启动子功能，验证其与花青素相关MYB转录因子互作关系，可以为深入理解f3h在植物花青素合成过程中的调控机制提供参考。【方法】以三色堇为材料，通过fPNI-PCR克隆三色堇Vwf3... 详细信息

【目的】f3h基因是花青素合成代谢途径中的关键酶之一，研究其启动子功能，验证其与花青素相关MYB转录因子互作关系，可以为深入理解f3h在植物花青素合成过程中的调控机制提供参考。【方法】以三色堇为材料，通过fPNI-PCR克隆三色堇Vwf3h基因上游启动子序列，并对其进行生物信息学分析，通过5’端缺失、瞬时转化、荧光定量，确定其表达是否存在组织特异性，通过酵母单杂实验验证其与已验证功能的MYB转录因子是否存在互作。【结果】通过克隆获得1277 bp Vwf3h启动子序列，生物信息学分析显示其含有较多与激素响应及抗逆相关的元件，推测其可能与抗逆相关。荧光定量结果显示，Vwf3h基因在三色堇花瓣中表达量最高，因此后续进行瞬时转化时选择三色堇花瓣作为材料。三色堇花瓣GUS染色结果表明，随着5’端缺失片段增加，启动子活性减弱，根据结果确定启动子高活性片段位于-2017 bp至-1353 bp区段；瞬时转化结果显示在烟草（Nicotiana tabacum）花瓣及叶片中Vwf3h启动子活性均低于CaMV35S，而在三色堇花瓣中Vwf3h启动子活性高于CaMV35S，说明Vwf3h启动子可能存在一定物种特异性，并且Vwf3h启动子更适合作为三色堇花瓣转化载体的启动子。酵母单杂交结果显示，Vwf3h启动子能够与VwMYB27互作。【结论】Vwf3h启动子具有物种特异性，能够与VwMYB27转录因子结合，进而调控三色堇花青素的形成。

关键词：三色堇 f3h基因启动子 MYB转录因子

长叶红砂黄烷酮-3-羟基转移酶3基因(Rtf3h3)的克隆、表达分析及酵母表达载体的构建

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华北农学报 2015年第5期30卷 45-50页

作者：张慧荣赵萍萍冯杰王迎春郑琳琳内蒙古大学生命科学学院内蒙古呼和浩特010021

黄烷酮-3-羟基转移酶(f3h)是植物黄酮合成途径上游的一个关键酶,它催化黄烷酮C3位羟化,形成二氢黄酮醇。构建长叶红砂Rt f3h3基因酵母表达载体,为进一步研究Rt f3h3基因功能奠定基础。基于高通量转录组测序结果,利用RT-PCR技术克隆获得... 详细信息

黄烷酮-3-羟基转移酶(f3h)是植物黄酮合成途径上游的一个关键酶,它催化黄烷酮C3位羟化,形成二氢黄酮醇。构建长叶红砂Rt f3h3基因酵母表达载体,为进一步研究Rt f3h3基因功能奠定基础。基于高通量转录组测序结果,利用RT-PCR技术克隆获得长叶红砂f3h3(Rt f3h3,GenBank登录号LC055546)基因,其开放阅读框长1 014 bp,编码338个氨基酸,推测蛋白分子量为38.46 k Da,理论等电点为5.7。通过定量RT-PCR研究发现,Rt f3h3在茎中表达量较高,在根和叶中表达量较低。不同程度Na Cl(100,300,500 mmol/L)和不同时间UV(12,24,36 h)胁迫都能诱导Rt f3h3基因表达量升高。另外,构建了Rt f3h3基因酵母表达载体,为进一步研究Rt f3h3基因功能奠定基础。

关键词：长叶红砂 f3h基因定量RT-PCR 真核表达载体

斑地锦黄烷酮-3-羟化酶基因及启动子的克隆与分析

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西北植物学报 2021年第9期41卷 1475-1481页

作者：钟小菊吴晴阳张永康饶泽昌王飞黄胜和江西中医药高等专科学校医学基础部江西抚州344000 南昌大学抚州医学院江西抚州344000

该研究以斑地锦茎叶为材料,利用同源克隆结合RACE和Tail-PCR法,克隆了1个黄烷酮-3-羟化酶(f3h)基因,命名为Emf3h(GenBank登录号为MW767838),其ORf区为1092 bp,编码364个氨基酸。生物信息学分析显示,Emf3h蛋白相对分子质量为40.93 kD,等... 详细信息

该研究以斑地锦茎叶为材料,利用同源克隆结合RACE和Tail-PCR法,克隆了1个黄烷酮-3-羟化酶(f3h)基因,命名为Emf3h(GenBank登录号为MW767838),其ORf区为1092 bp,编码364个氨基酸。生物信息学分析显示,Emf3h蛋白相对分子质量为40.93 kD,等电点为5.47,属于2-酮戊二酸铁依赖的双加氧酶超家族,其氨基酸序列与油桐的序列相似性为85.5%,在系统进化上为相对独立的一个分支。采用Tail-PCR法获得1604 bp的Emf3h启动子序列,分析发现其内含TAAT-box、CAAT-box等序列和G-box等光反应元件。qRT-PCR结果表明,Emf3h基因在不同生长期各组织中均有表达,其中花期的根和果期的果实中表达水平最高。此结果为进一步研究Emf3h基因表达调控奠定了基础,也为完善斑地锦槲皮素生物合成途径提供了新思路。

关键词：斑地锦 f3h基因启动子克隆 qRT-PCR