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猪源大肠杆菌f18菌毛的体外表达和抗原特性

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微生物学报 2014年第2期54卷 236-242页

作者：陈祥宦海霞万婷王雷高崧焦新安扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室江苏扬州225009 扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 淮阴师范学院生命科学学院江苏淮安223300

【目的】揭示从仔猪腹泻和/或水肿病猪体内分离到的fedA+大肠杆菌所携带的毒力因子、f18菌毛在体外表达及其抗原变异情况。【方法】利用凝集试验测定O血清型,PCR方法检测毒力基因,单克隆抗体分析f18菌毛抗原特性。【结果】在75个fedA+... 详细信息

【目的】揭示从仔猪腹泻和/或水肿病猪体内分离到的fedA+大肠杆菌所携带的毒力因子、f18菌毛在体外表达及其抗原变异情况。【方法】利用凝集试验测定O血清型,PCR方法检测毒力基因,单克隆抗体分析f18菌毛抗原特性。【结果】在75个fedA+分离株中,有62株测定出其O血清型,覆盖8种血清型,以O107和O139为主(74.2%);estI、estII、elt、stx-2e、astA、orfA、irp2、fyuA、ler和eaeA基因在这75个菌株中的检出率分别为64.0%、46.7%、28.0%、62.7%、26.7%、9.3%、9.3%、9.3%、1.3%和1.3%,其中仅拥有stx-2e基因的菌株有19株,同时拥有estI/estII/stx-2e基因的菌株有20株。单抗鉴定结果显示,在33株体外表达f18菌毛的菌株中,21株(63.6%)被鉴定为f18ac变体,2株(6.1%)被鉴定为f18ab变体,其余10株(30.3%)仅跟f18"a"因子单抗反应,而不跟f18"b"、"c"因子单抗反应。间接ELISA显示,11株单抗至少识别f18菌毛的6个表位,其中"a"因子至少有3个表位,"b"因子至少有2个表位,"c"因子至少有1个表位。【结论】在猪源菌株中,f18ab菌毛在体外表达率较低;f18ac菌毛在体外表达率较高,主要与肠毒素和O107血清型相关,同时我国存在f18菌毛的抗原变异。

关键词：猪大肠杆菌 f18菌毛血清型毒力因子抗原特性

大肠杆菌f18菌毛操纵子全基因克隆、表达及生物学活性

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微生物学报 2007年第5期47卷 790-794页

作者：张建军朱国强扬州大学兽医学院扬州225009

利用PCR技术以猪产肠毒素大肠杆菌f18标准菌株107/86和2134P基因组DNA为模板成功地扩增出编码f18ab和f18ac完整菌毛操纵子fed基因。将它们分别克隆入表达质粒载体pET-22b(+),结合酶切和核苷酸序列分析证明了PCR预期扩增产物的正确性。... 详细信息

利用PCR技术以猪产肠毒素大肠杆菌f18标准菌株107/86和2134P基因组DNA为模板成功地扩增出编码f18ab和f18ac完整菌毛操纵子fed基因。将它们分别克隆入表达质粒载体pET-22b(+),结合酶切和核苷酸序列分析证明了PCR预期扩增产物的正确性。然后将克隆的重组载体DNA转化至大肠杆菌BL21(DE3),构建和筛选出分别含f18ab和f18ac完整fed基因的重组菌,经过IPTG诱导表达,在电镜下观察到上述两种重组菌能分别大量表达f18ab和f18ac菌毛。用热抽提法提纯其诱导表达的f18ab和f18ac菌毛,经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色发现提纯后菌毛获单一分子量约为15kDa蛋白条带,免疫家兔后制备出高效价的兔抗血清,玻板凝集试验和Western blot结果表明:体外诱导表达的f18ab和f18ac菌毛具有和野生f18菌毛相同的抗原性。用表达f18ab和f18ac菌毛的上述2株重组菌分别进行小肠上皮细胞体外吸附试验和吸附抑制试验,结果表明:2株重组菌和野生菌株一样具有较强的粘附易感仔猪小肠上皮细胞的能力,而用表达f18ab和f18ac重组菌提纯的菌毛制备出兔抗血清都能有效地抑制上述重组菌或野生菌株对易感仔猪小肠上皮细胞的吸附结合。

关键词：产肠毒素大肠杆菌 f18菌毛 fed基因表达生物活性

致断奶仔猪腹泻、水肿病大肠杆菌f18菌毛a因子单克隆抗体的研制及其初步应用

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中国兽医学报 2004年第6期24卷 541-544页

作者：郭玉广高崧刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

以表达 f18ac菌毛参考菌株 2 134(O15 7∶ H19)为研究对象 ,摸索出了 f18ac菌毛表达的最佳条件 ,采用热洗脱法获得了较纯的 f18ac菌毛 ,并以之免疫小鼠 ,利用淋巴细胞杂交瘤技术 ,用直接玻板凝集法筛选出 1株杂交瘤细胞株 19B4 ,能稳定... 详细信息

以表达 f18ac菌毛参考菌株 2 134(O15 7∶ H19)为研究对象 ,摸索出了 f18ac菌毛表达的最佳条件 ,采用热洗脱法获得了较纯的 f18ac菌毛 ,并以之免疫小鼠 ,利用淋巴细胞杂交瘤技术 ,用直接玻板凝集法筛选出 1株杂交瘤细胞株 19B4 ,能稳定分泌针对 f18ac菌毛和 f18ab菌毛共同抗原表位 a因子的单克隆抗体。细胞培养上清对 f18ac菌毛参考菌株 2 134和 f18ab菌毛参考菌株 10 7/ 86的直接凝集价均可达 1∶ 8,腹水单抗直接凝集效价可达 1∶ 10 2 4 ,而与猪源产 f4、f5、f6和 f4 1粘附素大肠杆菌菌株、鸡源产型菌毛大肠杆菌菌株及沙门氏菌不发生凝集反应。免疫印迹试验结果显示 ,腹水单抗可同时特异识别 f18ac菌毛 170 0 0和 f18ab菌毛 15 0 0 0左右的主要亚单位多肽。应用所研制的单抗对 2 15株断奶仔猪腹泻大肠杆菌分离株进行了检测 ,结果上述分离株 TSB培养物的 f18菌毛的检出率为13.4 % ,TSA培养物的检出率为 8.4 %。f18菌毛阳性分离株的 O血清型除了常见血清型 O139、O14 1外 ,还有非常见血清型 O10 7、O131和 O9等。TSB培养物的 f18菌毛检出率明显高于 TSA培养物的检出率 ,表明 f18菌毛在 TSB培养基中比在 TSA培养基上更容易表达 ,TSB培养基是适合 f18菌毛检测。

关键词：断奶仔猪腹泻水肿病大肠杆菌 f18菌毛 a因子单克隆抗体研制技术

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大肠杆菌f18菌毛及其亚型的PCR鉴定

微生物学报 2004年第5期44卷 683-685页

作者：成大荣徐建生孙怀昌高崧扬州大学兽医学院扬州225009

f18菌毛是产肠毒素大肠杆菌 (ETEC)与产vero细胞毒素大肠杆菌 (VTEC)的重要致病因子 ,可介导细菌对小肠细胞的黏附 ,并具有f18ab和f18ac 2个抗原亚型。根据已发表的f18ab菌毛A亚单位 (fedA ab)的基因 (fedA ab)设计 3条引物 ,建立了 2... 详细信息

f18菌毛是产肠毒素大肠杆菌 (ETEC)与产vero细胞毒素大肠杆菌 (VTEC)的重要致病因子 ,可介导细菌对小肠细胞的黏附 ,并具有f18ab和f18ac 2个抗原亚型。根据已发表的f18ab菌毛A亚单位 (fedA ab)的基因 (fedA ab)设计 3条引物 ,建立了 2种聚合酶链式反应 (PCR)扩增方法。通过对f18ab+ 大肠杆菌、f18ac+ 大肠杆菌、K88+ 大肠杆菌、K99+ 大肠杆菌、987P+ 大肠杆菌、f4 1+ 大肠杆菌的试验 ,结果表明所建立的PCR方法可特异性鉴定f18+

关键词：大肠杆菌 f18菌毛亚型 PCR鉴定

断奶仔猪源大肠杆菌f18菌毛的分子流行病学研究

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中国预防兽医学报 2006年第2期28卷 231-234页

作者：成大荣孙怀昌徐建生高崧扬州大学兽医学院江苏扬州225009

利用f18菌毛a因子单克降抗体以及已建立的鉴定f18菌毛及其亚型的双重PCR法,对来自断奶仔猪水肿病和/或腹泻病例的60株VTEC、24株VTEC/ETEC以及24株ETEC的进行了f18菌毛检测,以了解f18ab+和f18ac+大肠杆菌在江苏省断奶仔猪群的分子流行... 详细信息

利用f18菌毛a因子单克降抗体以及已建立的鉴定f18菌毛及其亚型的双重PCR法,对来自断奶仔猪水肿病和/或腹泻病例的60株VTEC、24株VTEC/ETEC以及24株ETEC的进行了f18菌毛检测,以了解f18ab+和f18ac+大肠杆菌在江苏省断奶仔猪群的分子流行病学。结果表明:通过f18菌毛a因子单克隆抗体,可检测出52株大肠杆菌为f18+,检出率为48.15%;而通过双重PCR方法,共检测出63株大肠杆菌为f18+,检出率为58.33%,其中53株(49.07%)为f18ab+,10株(92.6%)为f18ac+。另外还发现:在VTEC、VTEC/ETEC以及ETEC的菌株之间,这2种f18菌毛亚型的分子流行病学是不同的。在VTEC中,f18ab+,菌株37株(61.67%),未发现f18ac+菌株;在VTEC/ETEC中,f18ab+菌株15株(62.50%),fl8ac+菌株8株(33.33%);而在ETEC中f18ab+菌株只有1株(4.17%),f18ac+菌株只有2株(8.33%)。以上数据表明:①PCR法检测f18菌毛优于单抗法;②fI8菌毛是VTEC/ETEC、VTEC的重要致病因子,而在ETEC中则明显低于VTEC/ETEC和VTEC;③f18ab+菌株—般为SLT-Ⅱe+,而f8ac+菌株一般为STI+。

关键词：大肠杆菌 f18菌毛检测分子流行病学

大肠杆菌f18菌毛A亚单位基因的多样性分析

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中国兽医学报 2005年第4期25卷 359-361,365页

作者：成大荣徐建生曹军唐波吕玲孙怀昌高崧扬州大学兽医学院江苏扬州225009

根据已经发表的大肠杆菌f18ab菌毛A亚单位(fedA/ab)的基因序列(fedA/ab)设计1对引物,利用PCR技术从本实验室保存的10株大肠杆菌(f107/86、YCED1、YCED2、C、D、E、12f、2134P、8199、8813)中分别扩增到一段序列,并克隆至pGEM-T载体,获... 详细信息

根据已经发表的大肠杆菌f18ab菌毛A亚单位(fedA/ab)的基因序列(fedA/ab)设计1对引物,利用PCR技术从本实验室保存的10株大肠杆菌(f107/86、YCED1、YCED2、C、D、E、12f、2134P、8199、8813)中分别扩增到一段序列,并克隆至pGEM-T载体,获得重组质粒Tf107A、TYCED1A、TYCED2A、TCA、TDA、TEA、T12fA、T8813A、T8199A、T2134PA。通过序列测定,并与已发表的fedA/ab进行比较、基因树分析,可将这10个菌株分为2个基因群,其中f107/86、YCED1、YCED2、C、D、12f与fedA/ab具有高度同源性,属于fedA/ab,大小为513bp;E、8813、8199、2134P构成另一单独的分支,属于fedA/ac,大小为516bp。

关键词：大肠杆菌 f18菌毛 A亚单位基因多样性

大肠埃希氏菌f18菌毛结构蛋白与黏附特性的关系

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中国兽医科技 2005年第9期35卷 694-697页

作者：成大荣孙怀昌徐建生高崧扬州大学兽医学院江苏扬州225009

利用已表达的f18ab和f18ac菌毛各结构亚单位的融合蛋白(GST-fedA/ab、GST-fe-dA/ac、GST-fedE、GST-fedf/ab、GST-fedf/ac)分组肌肉注射健康家兔,制备抗fedA/ab、fe-dA/ac、fedE、fedf/ab、fedf/ac多价血清。结果表明,所制备的5种抗fed多价血清均能凝集f18ab+大肠埃希氏菌107/86株和f18ac+大肠埃希氏菌8813株。利用抗大肠埃希氏菌f18菌毛主要结构亚单位fedA特异抗体和次要结构亚单位fedE、fedf特异抗体,研究了f18菌毛与小肠上皮细胞的黏附特性。结果发现,fedA抗体和fedE抗体单独和合并均不能抑制f18+菌与小肠上皮细胞的黏附,而单用抗fedf抗体即能明显抑制f18+大肠埃希氏菌与小肠上皮细胞的黏附,表明fedA和fedE与f18菌毛的黏附不具相关性,而fedf才是f18菌毛的黏附性结构亚单位。

关键词：大肠埃希氏菌 f18菌毛结构亚单位抗血清黏附特性

大肠埃希菌f18菌毛结构亚单位抗原特性的研究

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动物医学进展 2009年第2期30卷 4-7页

作者：成大荣朱善元钱金梅董丙敏扬州大学兽医学院江苏扬州225009 江苏畜牧兽医职业技术学院江苏泰州225300

利用已经表达的大肠埃希菌f18ab和f18ac菌毛各结构亚单位(fedA、fedE、fedf)的融合蛋白GST-fedA/ab、GST-fedA/ac、GST-fedE/ab、GST-fedf/ab、GST-fedf/ac分组肌肉注射免疫成年健康家兔,分别制备抗GST-fedA/ab、GST-fedA/ac、GST-fedE、GST-fedf/ab、GST-fedf/ac的多价血清。玻板凝集试验结果表明,抗GST-fedA/ab、GST-fedA/ac、抗GST-fedE/ab、GST-fedf/ab、GST-fedf/ac多价血清均能同时凝集f18ab+大肠埃希菌f107/86株、f18ac+大肠埃希菌8813株。通过荧光抗体染色法对抗fedA/ab、fedA/ac、fedE/ab、fedf/ab、fedf/ac的单因子血清的研究,发现f18菌毛"a"抗原因子分布于fedA、fedE、fedf亚单位上,"b/c"抗原因子分布于fedA、fedf亚单位上。

关键词：大肠埃希菌 f18菌毛结构亚单位抗原因子

肠毒素型大肠杆菌f18菌毛对产蛋鸡免疫的原性

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福建农林大学学报（自然科学版） 2009年第6期38卷 608-611页

作者：由昭红姜中其枣庄学院旅游与资源环境系山东枣庄277160 浙江大学动物科学学院浙江杭州310029

提取猪源肠毒素型大肠杆菌(ETEC)标准株和临床分离株f18菌毛,并制备弗氏佐剂苗,分别免疫产蛋母鸡后用间接ELISA法定期检测母鸡卵黄抗体和血清抗体效价.结果表明:无论标准株还是分离株,f18菌毛对产蛋鸡均具有良好的免疫原性,卵黄抗体效... 详细信息

提取猪源肠毒素型大肠杆菌(ETEC)标准株和临床分离株f18菌毛,并制备弗氏佐剂苗,分别免疫产蛋母鸡后用间接ELISA法定期检测母鸡卵黄抗体和血清抗体效价.结果表明:无论标准株还是分离株,f18菌毛对产蛋鸡均具有良好的免疫原性,卵黄抗体效价最高可达1∶25600,血清抗体效价高于卵黄抗体效价,最高可达1∶51200.

关键词： f18菌毛产肠毒素型大肠杆菌免疫原性