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变形链球菌临床株f-atpase亚基基因uncEBf在mRNA水平的表达

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实用口腔医学杂志 2005年第6期21卷 737-741页

作者：杨德琴刘天佳亓庆国付春华庄姮李颂遵义医学院附属口腔医院 563003 成都四川华西口腔医学院牙体牙髓科西安第四军医大学口腔医学院牙体牙髓科安徽医科大学口腔医学院牙体牙髓科

目的:研究变形链球菌临床分离株耐酸因子f-atpase c、a、b亚基联合基因uncEBf在mRNA水平的表达差异,探讨基因表达水平与细菌耐酸力以及uncEBf基因型的关系。方法:应用半定量RT-PCR两步法和凝胶成像系统定量软件分析,分别对18株来自不同... 详细信息

目的:研究变形链球菌临床分离株耐酸因子f-atpase c、a、b亚基联合基因uncEBf在mRNA水平的表达差异,探讨基因表达水平与细菌耐酸力以及uncEBf基因型的关系。方法:应用半定量RT-PCR两步法和凝胶成像系统定量软件分析,分别对18株来自不同基因型和不同耐酸力变链菌的uncEBf基因表达水平进行评价,以SPSS11.0软件分析和比较mRNA表达的差异。结果:不同基因型及不同耐酸力菌株un-cEBf的mRNA表达水平不同(Pf表达高于B基因型,高耐酸力菌株un-cEBf表达高于低耐酸力菌株。结论:变链菌不同基因型uncEBf基因的表达水平不同,表达水平高低与菌株的耐酸力相关。

关键词：变形链球菌 f-atpase 半定量 RT-PCR 基因表达

Construction of Recombinant Plasmid Containing *** f-atpase β Subunit Gene

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Chinese Journal of Biomedical Engineering(English Edition) 2005年第4期14卷 169-175页

作者： YU Dan-ni JIANG Li No. 2 Hospital of Tianjin Medical University Tianjin 300211 China

objective: construct a homologous recombinant plasmid which was expected to be transformed into *** Methods: a region at the 5’terminus of the *** f-atpase β subunit gene was amplified by PCR, the PCR product was inserted into vector pVA891,yielding recombinant ***: the DNA sequence of the recombinant plasmid was identified correct in whole by restriction endonuclease and DNA sequence ***: the recombinant plasmid of *** DNA was cloned in effect,it may assist in construction of homologues recombinant mutant.

关键词： S。mutans f-atpase Plasmid

变形链球菌f-atpase亚基基因uncEBf基因多态性的研究

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变形链球菌F-ATPase亚基基因uncEBF基因多态性的研究

生物膜中耐酸因子f-atpase的表达与龋病的关系

2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议

作者：杨德琴刘天佳付春华亓庆国庄姮李颂口腔生物医学工程教育部重点实验室四川大学华西口腔医学院龋病研究室

目的:研究变形链球菌血清c型临床分离株耐酸因子f-atpase亚基c、a、b联合基因uncEBf的遗传多态性,并探讨基因多态性与细菌耐酸力的关系。方法:从不同龋敏感人群分离得到变形链球菌血清c型分离株,18株高耐酸株、20株低耐酸株。冻干株复... 详细信息

目的:研究变形链球菌血清c型临床分离株耐酸因子f-atpase亚基c、a、b联合基因uncEBf的遗传多态性,并探讨基因多态性与细菌耐酸力的关系。方法:从不同龋敏感人群分离得到变形链球菌血清c型分离株,18株高耐酸株、20株低耐酸株。冻干株复苏、鉴定后接种于同体平板,37℃,80％N2,10％H2,10％CO2,培养48h,挑取单菌落于液体培养基于相同条件培养12- 16h增菌。按UltraPureTM试剂盒说明书抽提细菌基因组DNA,以特异引物从细菌基因组扩增uncEBf基因,选择限制性内切酶 Dde Ⅰ,Ssp Ⅰ,ALu Ⅰ分别消化PCR产物行限制性内切酶长度多态性分析（RfLP） PCR产物进行测序,序列行同源性分析,并与Genbank序列比较。Clone 3．1 version软件分析测序结果的变异位点。结果:不同限制性内切酶RfLP产生不同的基因型,测序证实导致多态性出现的基因变异;其中内切酶ALu Ⅰ产生的A、B基因型在不同耐酸力菌株的分布不同（P＜0．05）,高耐酸性菌株中A型基因的检出高出低耐酸力菌株。结论:变形链球菌f-atpase亚基联合基因uncEBf具有明显基因多态性,酸性环境下生存力强的菌株可能出现基因的适应性变异,可认为不同基因型uncEBf分布与耐酸力不同相关。

关键词：变形链球菌 f-atpase uncEBf基因基因多态性

来源： cnki会议评论

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生物膜中耐酸因子F-ATPase的表达与龋病的关系

作者：黄文明遵义医学院

学位级别：硕士

牙菌斑生物膜(Dental plaque biofilm)是龋病发生的始动因子,菌斑中致龋菌通过多个毒力因子在龋病的发生过程中发挥重要作用,主要表现在粘附、产酸和耐酸三个环节。其中耐酸是致龋菌最重要的生物学特征同时也是龋病发生的前提,只有能耐... 详细信息

牙菌斑生物膜(Dental plaque biofilm)是龋病发生的始动因子,菌斑中致龋菌通过多个毒力因子在龋病的发生过程中发挥重要作用,主要表现在粘附、产酸和耐酸三个环节。其中耐酸是致龋菌最重要的生物学特征同时也是龋病发生的前提,只有能耐受酸性环境,致龋菌才能继续代谢并产酸,最终导致釉质发生脱矿而引起龋病的发生。质子移位膜ATP酶(membrane-bound proton-translocating atpase, f0f1atpase, f-atpase, H+-atpase, f-type ATPsae)能通过转运质子于胞外以维持细胞内相对中性的环境,从而保护胞内的对酸敏感的酶和其他蛋白,使致龋菌具有对抗酸致死的能力,并在低pH条件下存活继续产酸,从而达到临界pH使釉质脱矿,因此,f-atpase是致龋菌最重要的耐酸毒力因子。牙菌斑生物膜是致龋菌致病的原位环境,它并非细菌结构上简单叠加,而是构建起复杂的微生物群落,具有生物膜结构和微生物生理学的功能,生物膜内细菌之间存在相互拮抗、相互依赖以及信号传导,启动一套完全不同于浮游状态的基因系统,影响致龋菌毒力因子表达和毒理作用,故观察生物膜中f-atpase的表达能真实准确地反应致龋菌耐酸毒力因子在龋病发生发展过程中的作用。目的：本课题检测耐酸因子f-atpase在多细菌人工口腔生物膜(体外生物膜,artificial biofilm, in vitro biofilm)和临床不同龋敏感个体原位菌斑中的基因表达特点及酶的活性,并观察f-atpase启动子荧光报告基因重组质粒转化的细菌在不同pH生物膜环境中的荧光表达,初步分析毒力因子f-atpase在生物膜中基因和蛋白的表达水平,对进一步明确龋病的病因、疾病风险性评估以及防治均有重要意义。方法：一、荧光定量PCR检测人工口腔生物膜中f-atpase在不同pH条件下的mRNA表达差异以变异链球菌(S. mutans)、血链球菌(***)、远缘链球菌(***)、内氏放线菌(A. naeslundii)、粘性放线菌(A. viscosus)、口腔链球菌(***)和奈瑟氏菌(Neisseria)8种口腔与龋相关菌构建口腔体外生物膜模型,不同pH环境中生长3h后,提取生物膜样本的RNA,逆转录cDNA,荧光定量PCR (SYBR Green I)检测f-atpase的mRNA表达。单因素方差分析统计结果。二、荧光定量PCR检测不同龋敏感个体牙菌斑生物膜中f-atpase的mRNA表达分别采集成年人高龋(61例)和无龋(50例)、老年人根面高龋(56例)和根面无龋(41例)人群的牙菌斑,提取菌斑RNA,逆转录cDNA,荧光定量PCR (SYBR GreenⅠ)检测牙菌斑f-atpase的mRNA表达。单因素方差分析统计结果。三、人工口腔生物膜中f-atpase的酶活性表达实验一相同方法构建人工口腔生物膜,制备混合细菌生物膜透性细胞,以检测不同pH条件下磷的释放量来反映f-atpase酶活性。单因素方差分析统计结果。四、前期构建的f-atpase启动子转化菌生长及重组荧光表达载体在人工口腔生物膜中的荧光表达特点课题前期构建的f-atpase启动子绿色荧光蛋白穿梭载体PLfgfp和管家基因recA红色荧光蛋白穿梭载体PLRred,质粒DNA电击转化变异链球菌(UA159),观察不同pH条件的生长菌在含卡那霉素BHI琼脂平板的菌落生长情况,激光共聚焦扫描显微镜观察两种穿梭载体在大肠杆菌中不同pH生物膜条件下荧光的表达。结果： 1.人工口腔生物膜中f-atpase在不同pH条件下表达不同,在初始pH 5和5.5时f-atpase表达最高,然后依次是初始pH 6、6.5、4.5、7,在初始pH 4时表达最低。酸性环境相对中性环境(pH 7) f-atpase的表达差异均有统计学意义(Pf-atpase的表达明显高于无龋组(Pf-atpase的表达高于老年人(P0.05)。f-atpase在临床个体原位牙菌斑生物膜中的表达远远高于人工口腔生物膜(Pf-atpase活性随pH升高而降低;经过3h稳定培养后,pH 5和5.5时活性最高,其他依次是pH 6、pH 4.5、pH 6.5、pH 4,在pH 7时活性最弱。相对中性环境(pH 7)酸性环境f-atpase的活性差异均有统计学意义(Pf-atpase启动子重组质粒电击转化后的变异链球菌能够生长在含卡那霉素的BHI平板上,PCR扩增结果证实转化成功,转化菌在p

关键词： f-atpase pH 龋病人工口腔生物膜牙菌斑生物膜荧光蛋白

变异链球菌f-atpase及内参照启动子荧光蛋白表达载体的构建

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变异链球菌F-ATPase及内参照启动子荧光蛋白表达载体的构建

作者：徐仰龙遵义医学院

学位级别：硕士

致龋菌通过多个毒力因子在龋病发生过程中发挥重要作用,其中耐酸是致龋菌最重要的生物学特征和龋病发生的前提。只有耐受生物膜的酸性环境,致龋菌才能生存并持续代谢和产酸,导致牙体硬组织脱矿与再矿化失衡而引起龋病发生。质子移位膜AT... 详细信息

致龋菌通过多个毒力因子在龋病发生过程中发挥重要作用,其中耐酸是致龋菌最重要的生物学特征和龋病发生的前提。只有耐受生物膜的酸性环境,致龋菌才能生存并持续代谢和产酸,导致牙体硬组织脱矿与再矿化失衡而引起龋病发生。质子移位膜ATP酶(membrane-bound proton-translocating atpase,fofatpase,f-atpase)是致龋菌最重要的耐酸毒力因子,通过将胞内氢离子外运维持胞内相对稳定的中性代谢环境,同时使细胞周围生物膜环境中酸性物质不断堆积,pH持续下降直至临界pH。牙菌斑是生物膜的一种,是病原菌致龋的原位环境,研究表明致龋菌毒力因子在浮游状态与生物膜中的表达有很大差异性,在生物膜中观察f-atpase的表达能更准确反应致龋菌耐酸因子在龋病发生过程中的作用机理,为深入研究龋病的病因学及预防提供理论基础。目的:本课题以主要致龋菌变异链球菌(Streptococcus mutans,***,变链菌)为代表,构建变链菌(UA159)f-atpase操纵元启动子启动的绿色荧光蛋白穿梭表达载体,为原位环境中研究变链菌致龋过程中的耐酸力调控提供物质条件和基础,同时为有效监控其表达,我们构建以管家基因重组结合蛋白A(recombination protein A,RecA)操纵元启动子启动的红色荧光蛋白穿梭载体作为内参照,对f-atpase的表达强度进行定量。方法: 一:构建f-atpase操纵元启动子启动的绿色荧光蛋白穿梭表达载体以变链菌(UA159)基因序列设计并合成f-atpase操纵元启动子引物,PCR扩增并插入到pMD18-T载体测序,确认目的片段后经该载体将f-atpase操纵元启动子插入到绿色荧光蛋白表达载体(pEGfP-N1),构建原核荧光蛋白表达载体(pfgfp);从中分离pfgfp中目的片段(f-atpase操纵元启动子启动的绿色荧光蛋白表达载体),连接至穿梭载体(pDL276)多克隆位点,构建肠杆菌-链球菌荧光蛋白表达载体。二:构建管家基因RecA操纵元启动子启动的红色荧光蛋白穿梭表达载体于变链菌UA159中扩增获得RecA启动子并测序验证后定向重组至红色荧光蛋白载体pDSred2-N1中,构建荧光蛋白表达载体(pRred);分离pRred中目的基因片段定向插入pDL276多克隆位点,构建穿梭表达载体pLRred。三:重组载体转化变链菌验证利用基因转化试剂盒将重组表达载体转化变链菌并初步验证其表达。结果: (1)pMD18-f中的目的片段测序结果与变链菌基因组进行对比,证实为目的片段—f-atpase操纵元启动子序列;荧光显微镜对转化菌落观测及菌落PCR鉴定原核表达载体pfgfp正确;重组载体(pLfgfp)转化菌落具有绿色荧光,提取菌落中质粒双酶切(EcoRⅠ/XbaⅠ)后电泳分析,目的片段大小相一致,表明pLfgfp构建成功。 (2)对插入T载体的片段测序,与UA159全基因组对比,证实为RecA操纵元启动子序列;插入RecA启动子的pDsRed2-N1重组载体pRred,转化大肠杆菌后菌落见红色荧光,对荧光菌落行PCR鉴定;连接入RecA启动子启动的荧光蛋白编码片段的重组质粒pLRred转化到DH5α中,观测其成功表达,荧光菌落质粒抽提、酶切、电泳均证实插入片段与目的片段一致,表明pLRred构建成功。 (3)转化有穿梭表达载体的变链菌能在含有kan+的BHI培养基上生长,证实菌体荧光,表明重组载体可于变链菌内表达。结论:本实验成功构建由变链菌f-atpase启动子及内参照RecA启动子启动的荧光蛋白穿梭表达载体,通过转化鉴定,两种穿梭表达载体中的启动子均能正确启动报告基因荧光蛋白在变链菌中的表达,并随变链菌的扩增而扩增。本课题为进一步在生物膜中原位研究致龋菌耐酸因子的表达和调控提供物质条件和基础。

关键词：变异链球菌 f-atpase RecA 荧光蛋白穿梭表达载体

敲低f-atpase促进变形链球菌感染人牙髓成纤维细胞成骨/成牙本质分化的研究

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临床口腔医学杂志 2021年第3期37卷 136-141页

作者：李亚熊洁湖北医药学院附属东风口腔医院湖北十堰442000

目的:研究敲低耐酸因子f-atpase促进变形链球菌感染人牙髓成纤维细胞(human dental pulp fibroblasts,HDPfs)成骨/成牙本质分化的作用。方法:培养HDPfs并采用免疫荧光染色、流式细胞术进行鉴定,而后分为对照组、感染组、感染+si-NC组、... 详细信息

目的:研究敲低耐酸因子f-atpase促进变形链球菌感染人牙髓成纤维细胞(human dental pulp fibroblasts,HDPfs)成骨/成牙本质分化的作用。方法:培养HDPfs并采用免疫荧光染色、流式细胞术进行鉴定,而后分为对照组、感染组、感染+si-NC组、感染+si-f-atpase组、感染+si-f-atpase+NLR家族PYRIN域蛋白3(NLRP3)激动剂(NIG)组。比较各组间白介素(IL)-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNf-α)、NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1、骨钙素(OCN)、Runt相关转录因子2(Runx2)以及成骨诱导分化后茜素红染色OD540nm值、碱性磷酸酶(ALP)活力的差异。结果:感染组HDPfs中IL-1β、IL-18、TNf-α的含量,NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1的表达量均高于对照组,OCN、Runx2表达量及成骨诱导后的OD540nm水平、ALP活力均低于对照组;感染+si-f-atpase组HDPfs中IL-1β、IL-18、TNf-α的含量,NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1的表达量均低于感染组,OCN、Runx2表达量及成骨诱导后的OD540nm水平、ALP活力均高于感染组;感染+si-f-atpase+NIG组HDPfs中IL-1β、IL-18、TNf-α的含量,NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1的表达量均高于感染+si-f-atpase组,OCN、Runx2表达量及成骨诱导后的OD540nm水平、ALP活力均低于感染+si-f-atpase组。结论:敲低f-atpase能够促进变形链球菌感染HDPfs的成骨/成牙本质分化,抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应是可能的分子机制。

关键词：龋病变形链球菌 f-atpase 炎症反应成骨分化 NLRP3炎症小体

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变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株的基因组比较

变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株的基因组比较

作者：丁春燕天津医科大学

学位级别：硕士

目的:氟化物防龋已有很长的历史,长期局部高浓度氟化物的使用,可导致耐氟菌株选择性的生长。耐氟菌株的出现,给氟化物防龋提出了新的问题,如何避免耐氟菌株的出现而又能充分发挥氟化物的防龋作用,探讨耐氟菌株的耐氟机理便显得极为重要... 详细信息

目的:氟化物防龋已有很长的历史,长期局部高浓度氟化物的使用,可导致耐氟菌株选择性的生长。耐氟菌株的出现,给氟化物防龋提出了新的问题,如何避免耐氟菌株的出现而又能充分发挥氟化物的防龋作用,探讨耐氟菌株的耐氟机理便显得极为重要。本实验运用分子生物学技术对变形链球菌耐氟菌株与亲代株的基因组、蛋白组进行比较,判定变形链球菌耐氟突变后,其遗传型是否发生显著性改变。变形链球菌的致龋能力主要是它具有产酸和耐酸两大特性,而这种耐酸能力主要通过细菌的f-atpase得以实现。通过测定并比较变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株的f-atpase的活性,并进一步对其基因组进行比较,探讨耐氟菌株耐酸性提高的原因。为进一步研究其基因改变的具体部位及耐氟机理提供理论依据,为研究变形链球菌耐氟菌株耐酸性的增强机制奠定基础。方法:1 提取变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株的整体基因组,运用AP-PCR技术对其DNA进行对比研究;2 提取变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株的可溶性蛋白组和不可溶性蛋白组,运用SDS-PAGE技术进行对比研究;3 将变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株通过甲苯处理,2个循环的液氮冷冻和解冻,制备透性细胞。将透性细胞悬液加入测试缓冲液中,测定不同时间段样品中水解ATP所释出的无机磷量来评价其膜上的atpase活性高低;4 自行设计f-atpase区域的引物,用PCR法对变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株f-atpase的基因组进行比较研究。结果:1 运用AP-PCR技术对变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株的全菌DNA进行扩增,得出的条带不完全相同;2运用SDS-PAGE技术对变形链球菌耐氟菌株

关键词：变形链球菌耐氟菌株 f-atpase AP-PCR SDS-PAGE

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高压CO2酸化杀菌机理研究

高压CO2酸化杀菌机理研究

作者：宋俊骅合肥工业大学

学位级别：硕士

高压CO2杀菌技术是近年来发展起来的一种新型的冷杀菌技术,具有杀菌成本低、无毒副作用、杀菌效果好、可操作性强等优点。90年代至今,国内外各学者越来越重视对高压CO2杀菌技术的研究,但是对高压CO2杀菌机理的研究一直都停留在猜测中,... 详细信息

高压CO2杀菌技术是近年来发展起来的一种新型的冷杀菌技术,具有杀菌成本低、无毒副作用、杀菌效果好、可操作性强等优点。90年代至今,国内外各学者越来越重视对高压CO2杀菌技术的研究,但是对高压CO2杀菌机理的研究一直都停留在猜测中,尚无实验依据。本论文为弄清高压CO2的各大杀菌机理中的“酸化机理”,利用间接试验方法来检验酸化杀菌机理。根据细菌内f-atpasei(质子移位膜ATP酶)和P-atpase(即细胞膜ATP酶)会自动调节胞内质子浓度,减轻外来酸化对微生物不利影响的原理,设计试验。本试验以大肠杆菌为研究菌种,利用紫外和抑制剂相结合的方法来构建低活性P-atpase型和低活性f-atpase型基因突变株;利用单因素试验和正交试验得出高压CO2杀菌的最佳工艺条件;利用高压CO2对正常型大肠杆菌和诱变菌的杀菌效果的对比结果,H+-atpase活力对高压CO2杀菌的影响,以及H+-atpase对高压CO2杀菌影响的显著性分析对高压CO2酸化杀菌机理进行初步研究。研究结果表明：高压CO2对低活性H+-atpase型大肠杆菌的杀菌效果好于正常型大肠杆菌;H+-atpase活力对高压CO2杀菌效果具有显著影响;说明了酸化机制在杀灭微生物过程中扮演着重要的角色。

关键词：高压CO2 H+-atpase P-atpase f-atpase 大肠杆菌酸化机理