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国际检验医学杂志 2022年第3期43卷 326-331页

作者：王齐周向东李琪钟有清王远礼胡基杨海南医学院第一附属医院呼吸内科海南海口570102 海南医学院第一附属医院检验科海南海口570102

目的探讨exocyst复合物关键亚基Sec3蛋白在气道黏液高分泌形成过程中的作用。方法将60只大鼠随机分成3组:正常对照组,烟雾暴露组、烟雾暴露+人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)组。烟雾暴露组大鼠采用烟雾暴露法建立慢性支气管炎症病理性改变,... 详细信息

目的探讨exocyst复合物关键亚基Sec3蛋白在气道黏液高分泌形成过程中的作用。方法将60只大鼠随机分成3组:正常对照组,烟雾暴露组、烟雾暴露+人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)组。烟雾暴露组大鼠采用烟雾暴露法建立慢性支气管炎症病理性改变,HNE攻击形成气道黏液高分泌大鼠模型。取肺组织支气管上皮,观察气道上皮杯状细胞的增生及黏液分泌情况,测定Sec3和气道黏蛋白5AC(MUC5AC)表达。HNE处理人支气管上皮细胞(16HBE),分析HNE对16HBE的Sec3、p-Sec3和MUC5AC蛋白表达的影响。sh-Sec3转染HNE处理的16HBE,分析转染效率,以及Sec3对HNE诱导的16HBE中MUC5AC分泌情况的影响。免疫共沉淀鉴定Sec3与MUC5AC的相互作用。结果与正常对照组比较,烟雾暴露组和烟雾暴露+HNE组大鼠气道上皮杯状细胞增生及黏液分泌量增加,Sec3和MUC5AC蛋白表达水平升高,且烟雾暴露+HNE组变化更明显(P<0.05);与16HBE组比较,16HBE+HNE组的Sec3、p-Sec3和MUC5AC蛋白相对表达水平升高(P<0.05),且呈时间依赖性;与16HBE+HNE组和空质粒转染组比较,sh-Sec3组Sec3蛋白和mRNA及MUC5AC蛋白相对表达水平降低(P<0.05);Sec3蛋白可被MUC5AC抗体共沉淀,MUC5AC蛋白亦可被Sec3抗体共沉淀,且在HNE刺激下,这种相互作用可加强。结论Sec3参与气道黏液高分泌过程,且与MUC5AC在体内外环境中均具有相互作用,介导了HNE诱导的MUC5AC高分泌。

关键词：气道黏液高分泌 exocyst复合物 Sec3 人中性粒细胞弹性蛋白酶气道黏蛋白5AC

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VAMP2协助exocyst复合物转运的MVB与膜蛋白SNAP25结合促进头颈癌细胞外泌体分泌以促进肿瘤进展

VAMP2协助exocyst复合物转运的MVB与膜蛋白SNAP25结合促进头颈癌...

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作者：张文骏安徽医科大学

学位级别：硕士

背景:头颈癌中最为常见的为头颈鳞状细胞癌,它是全球第六大常见癌症,其复发和转移概率高,对它的有效治疗仍是医学界一大难题。大量研究表明,肿瘤细胞外泌体分泌增多,且肿瘤细胞分泌的外泌体能促进肿瘤的进展。我们前期研究表明exocyst... 详细信息

背景:头颈癌中最为常见的为头颈鳞状细胞癌,它是全球第六大常见癌症,其复发和转移概率高,对它的有效治疗仍是医学界一大难题。大量研究表明,肿瘤细胞外泌体分泌增多,且肿瘤细胞分泌的外泌体能促进肿瘤的进展。我们前期研究表明exocyst复合物能促进外泌体的生成并促进头颈癌恶性生物学行为。利用STRING数据库分析发现exocyst复合物与25 k Da突触关联蛋白(synaptosomal-associated protein 25 k Da,SNAP25)和囊泡相关膜蛋白2(vesicle associated membrane protein 2,VAMP2)存在紧密相互作用。目的:本研究旨在探索SNAP25和VAMP2对头颈癌细胞外泌体分泌和头颈癌恶性生物学行为的影响及其相关机制。方法:利用STRING以及HNC数据库生物信息学分析不同蛋白间相互作用关系并用Co-IP实验验证;特异性si RNA敲低SNAP25或VAMP2后,利用纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)检测细胞培养上清中的外泌体浓度;利用蛋白免疫印迹法检测头颈癌细胞CD63的表达水平;利用免疫荧光染色法观察细胞内CD63的分布和表达量;利用透射电子显微镜观察细胞内多囊泡体(multivesicular body,MVB)和腔内小泡(intraluminal vesicle,ILV)的密度;利用Co-IP以及蛋白免疫印迹法比较Sec3、Sec10、Exo7、SNAP25或VAMP2敲低前、后头颈癌细胞中exocyst复合物、VAMP2和SNAP25与CD63相互作用强度变化;利用免疫组化比较喉癌与癌旁组织,蛋白免疫印迹比较头颈癌细胞与正常鼻咽上皮细胞SNAP25、VAMP2的表达差异;利用蛋白免疫印迹、CCK-8、Annexin V-FITC染色实验探索SNAP25和VAMP2对肿瘤细胞增殖以及凋亡的影响及其机制。结果:(1)exocyst复合物与SNAP25、VAMP2存在紧密相互作用。(2)在头颈癌细胞中,敲低SNAP25和VAMP2减少外泌体的分泌。(3)敲低SNAP25、VAMP2后,HN4细胞中MVB以及ILV增多。(4)exocyst复合物异常可抑制SNAP25、VAMP2与CD63相互作用,但SNAP25、VAMP2表达下调不影响exocyst复合物与CD63的相互作用,VAMP2表达下调抑制SNAP25与CD63相互作用,而SNAP25表达下调不影响VAMP2与CD63的相互作用。(5)头颈癌组织及细胞系高表达SNAP25和VAMP2。(6)敲低SNAP25、VAMP2后,头颈癌细胞增殖能力减弱、凋亡水平增加;同时,敲低SNAP25、VAMP2后的头颈癌细胞的培养上清促其他头颈癌细胞增殖以及抑制其他头颈癌细胞凋亡能力减弱。结论:(1)VAMP2结合由exocyst复合物介导转运至细胞膜附近的MVB,然后VAMP2通过与VAMP2相互作用促进MVB与质膜融合,进而促进外泌体的释放。(2)头颈癌高表达SNAP25和VAMP2,它们通过促进肿瘤细胞外泌体的分泌促进肿瘤的进展。本研究有助于理解头颈癌发生发展的机制,并为头颈癌新的治疗方法以及治疗药物的开发提供理论基础。

关键词： 25 kDa突触关联蛋白囊泡相关膜蛋白2 外泌体 exocyst复合物头颈癌

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Sec-10影响神经肌肉接头突触后敏感性的研究(英文)

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生物化学与生物物理进展 2009年第4期36卷 410-416页

作者：章雷李江丽高尚邦吴政星张蓉颖徐涛华中科技大学分子生物物理教育部重点实验室武汉430074 中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室北京100101

exocyst复合物在分泌过程中起重要作用.可是分子机理尚未研究透彻.通过TMP/UV的基因敲除方法,得到了exocyst复合物中一种组分sec-10的缺陷型线虫.药学结果显示这种线虫神经信号传递存在缺陷,可是电生理的方法证明在神经肌肉接头处的已... 详细信息

exocyst复合物在分泌过程中起重要作用.可是分子机理尚未研究透彻.通过TMP/UV的基因敲除方法,得到了exocyst复合物中一种组分sec-10的缺陷型线虫.药学结果显示这种线虫神经信号传递存在缺陷,可是电生理的方法证明在神经肌肉接头处的已报道离子型受体和野生型相比并未发生改变.因此猜测,sec-10并未直接影响神经肌肉接头处的离子型受体,而是通过其他途径来行使功能.

关键词： exocyst复合物 sec-10 神经肌肉接头离子型受体

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光遗传学技术用于定量调控肿瘤细胞信号转导及功能的研究

光遗传学技术用于定量调控肿瘤细胞信号转导及功能的研究

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作者：周晓旭浙江大学

学位级别：硕士

上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)在胚胎发育、慢性炎症、肿瘤侵袭等过程中扮演着重要角色。实验中常用TGF-β药物来诱导肿瘤细胞EMT的发生。PI3K/Akt信号通路在EMT发生过程中起着重要作用,但由于缺乏有效的研... 详细信息

上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)在胚胎发育、慢性炎症、肿瘤侵袭等过程中扮演着重要角色。实验中常用TGF-β药物来诱导肿瘤细胞EMT的发生。PI3K/Akt信号通路在EMT发生过程中起着重要作用,但由于缺乏有效的研究手段,人们对其具体调控机制一直缺乏清晰的认识。光遗传学技术(optogenetics)是一种结合蛋白的遗传学表达与激光光控和成像来实现对细胞行为、反应进行控制的新技术。光遗传学凭借其无损、非侵入式、高时空分辨率和高度可逆性等特点有效解决了传统研究手段的一些弊端。本文利用光遗传学技术来实现肿瘤细胞内PI3K/Akt信号通路的定量激活,从而探究其在肿瘤细胞EMT发生过程中的调控机理。exocyst 是一个由 Sec3、Sec5、Sec6、Sec8、Sec10、Sec15、Exo70 和 Exo84等八个蛋白亚基组成的蛋白复合物。它被认为是细胞胞吐过程的必要组件之一,并参与肿瘤细胞迁移及肿瘤转移等各种生理与病理过程。目前研究表明,exocyst复合物中的其他亚基,如Sec5、Sec8、Exo70等,在肿瘤细胞生理活动中发挥着重要的作用。这些蛋白亚基的缺失,会显著抑制肿瘤细胞的分裂、生长及迁移等活动。然而,Sec3亚基在肿瘤细胞生理活动中的作用目前尚不明确。因此,深入探索Sec3亚基在肿瘤细胞生理活动中的功能,对未来研究exocyst复合物的功能与调控肿瘤的机制具有重要意义。本论文研究通过对A549/HeLa细胞进行光遗传学改造,使细胞具有在蓝光刺激下特异性激活PI3K/Akt信号通路的能力,通过建立可控的蓝光刺激来实现细胞内信号通路的定量激活与操控,从而深入探究肿瘤细胞EMT发生过程中PI3K信号通路的调控机制和exocyst中关键蛋白亚基Sec3在肿瘤细胞功能发生中的重要作用。本论文的主要研究工作总结如下:(1)基于CIBN/CRY2光控体系,在哺乳动物细胞中建立光控PI3K/Akt信号通路的新型光控元件,并实现对PI3K/Akt信号激活的定量光学操控。随着蓝光照射频率的增长,细胞内Akt蛋白磷酸化(473位点和308位点)程度不断增加,从而实现通过调控光照强度来调节PI3K/Akt信号通路激活程度的控制。在此基础上,利用光遗传学技术对细胞功能开展分泌筛选实验,研究PI(4,5)P2磷酸肌醇在细胞分泌中的重要作用,发现细胞膜上PI(4,5)P2的瞬时下调会抑制细胞的分泌功能。(2)在TGF-β处理的细胞中特异性抑制PI3K信号通路,会导致其EMT表型受到一定程度的抑制。于是我们在光遗传学改造的A549/HeLa细胞中特异地及可逆地激活PI3K信号通路,发现EMT的标志性蛋白——E-cadherin,是PI3K信号的直接目标,光遗传学元件下调E-cadherin表达具有光照的剂量依赖性。光照时间越长,E-cadherin下降越明显。将细胞重新进行暗处理后,E-cadherin含量又重新恢复至原水平。光刺激诱导了 A549细胞进入另一种未被其他研究发现的EMT状态,我们将其定义为E-cadlow/Vimentinmedium,这种不完全的EMT过程具有高度可逆性。光照同样增加了 E-cadherin表达的抑制转录因子Snail1和Zeb1的表达。在肿瘤细胞功能性实验中,我们发现特异性激活PI3K信号通路有效增强了细胞的迁移能力,但低于TGF-β的刺激效果。这表明激活PI3K信号通路引起的EMT部分模拟了 TGF-β药物引起的EMT效果,而TGF-β刺激所诱导的Smad、Ras/Raf等其他信号通路应该也参与引发完全的EMT过程。(3)对A549肿瘤细胞中的Sec3蛋白进行敲低和再表达,利用光控对Sec3进行细胞内重定位等调控,初步研究Sec3蛋白在肿瘤细胞中的相关功能。结果发现敲低Sec3蛋白会对A549细胞的囊泡转运能力和细胞迁移能力产生显著的抑制作用。同时我们也发现将再表达的Sec3蛋白高效重定位于细胞膜时会引起Rab11蛋白的共定位效果。说明Sec3蛋白极有可能作为锚定蛋白首先定位于细胞膜上,接着招募其他亚基进行exocyst复合物组装,并引起Rab蛋白的相互作用。

关键词：光遗传学 PI3K/Akt信号通路定量控制上皮间质转化 exocyst复合物 Sec3蛋白

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SEC-10在秀丽线虫逆行行为中功能的研究

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生命科学研究 2010年第4期14卷 294-298页

作者：李江丽张蓉颖华中科技大学生命科学与技术学院中国湖北武汉430074

秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)是一种研究行为和神经系统相互关系的良好的模式生物,可以在实验条件下给予它物理、化学等多种外部刺激,也可以在分子水平改变其基因结构以改变线虫的行为方式,从而进一步研究神经系统中与行为相关的... 详细信息

秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)是一种研究行为和神经系统相互关系的良好的模式生物,可以在实验条件下给予它物理、化学等多种外部刺激,也可以在分子水平改变其基因结构以改变线虫的行为方式,从而进一步研究神经系统中与行为相关的分子机制.以sec-10突变为遗传背景,采用一种秀丽线虫逆行行为的简单测定方式,研究发现sec-10突变导致线虫逆行动作增多,初步探讨了在突变体线虫的神经系统中重新表达野生型SEC-10可以回复该逆行行为缺陷.

关键词：秀丽线虫逆行行为 exocyst复合物 SEC-10 探索行为

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