检索结果-南通市图书馆

检索条件"主题词=Exo-RPA"

共 2 条记录，以下是1-10 订阅

全选清除本页清除全部题录导出标记到"检索档案"

详细简洁

排序：

弓形虫exo-rpa检测方法的建立与初步应用

弓形虫Exo-RPA检测方法的建立与初步应用

引用

作者：王金红吉林大学

学位级别：硕士

弓形虫病(Toxoplasmosis)是一种由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的人畜共患寄生虫病,许多温血动物会被弓形虫感染,包括人类和家畜。弓形虫感染可导致孕妇或母畜流产、产死胎、弱胎等。在中国,肉类是国民消费的主流之一,人类可因食... 详细信息

弓形虫病(Toxoplasmosis)是一种由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的人畜共患寄生虫病,许多温血动物会被弓形虫感染,包括人类和家畜。弓形虫感染可导致孕妇或母畜流产、产死胎、弱胎等。在中国,肉类是国民消费的主流之一,人类可因食用生肉或未煮熟的肉而感染弓形虫。这不仅对人类健康构成严重危害,对畜牧业的发展也造成了严重影响。因此,建立快速、准确的弓形虫检测方法,具有重要的公共卫生意义。重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,rpa)技术是一种相对较新的等温扩增方法。该方法在高效的重组酶参与下,不需要模板链的热变性,可在恒温(25～42℃)条件下,5～20 min内可快速扩增出目的片段。该技术敏感性高、特异性强、反应快速、操作简便,可用于现场即时诊断中。将扩增产物与荧光探针结合,延伸出exo-rpa检测方法,相对于PCR它更适合应用于现场检测。本研究目的是建立弓形虫exo-rpa检测方法,并初步应用于肉类样品中,以评价exo-rpa方法的检测实用价值,以期为我国弓形虫病的预防及控制、进出口检疫、肉类食品安全卫生等方面提供技术支撑。研究结果如下:1)弓形虫exo-rpa检测方法的建立。首先,选择具有高度保守性的弓形虫B1基因作为靶标基因,通过设计引物、探针,筛选出最佳引物组、探针;其次,应用不同病原进行特异性评价,结果显示,该方法与微小隐孢子虫、贾第虫、新孢子虫、柔嫩艾美耳球虫、沙门氏菌、牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒无交叉反应,表明该方法特异性较强;最后,提取弓形虫RH株基因组,进行PCR获取目的片段,构建质粒标准品,测定浓度并换算为copies/μL,随后进行倍比稀释,使浓度范围在10～10 copies/μL,以dd HO为阴性对照,每个梯度设定8次重复,分析该方法的灵敏性,结果显示建立的弓形虫exo-rpa方法检测限达到10copies/μL,灵敏度是实时荧光定量PCR(q PCR)方法的10倍。2)弓形虫exo-rpa检测方法的应用。应用建立的弓形虫exo-rpa检测方法对长春市5个地区的180份肉类样品进行检测,exo-rpa方法检测出14份弓形虫阳性样品,阳性率为7.8%(14/180);q PCR方法检出阳性率也为7.8%(14/180)。两种检测方法的符合率达100%,其中猪肉样品阳性率为10.8%(13/120),牛肉阳性率为3.3%(1/30),犬肉阳性率为0%(0/30)。综上所述,本研究建立了一种操作简单、特异性较强、灵敏度高的弓形虫exo-rpa检测方法,对我国弓形虫病的防控工作具有重要意义。

关键词：弓形虫 rpa exo-rpa 检测方法

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

溶藻弧菌exo-rpa检测方法的建立及其激活宿主巨噬细胞NLRP3炎性小体的分子机制

溶藻弧菌Exo-RPA检测方法的建立及其激活宿主巨噬细胞NLRP3炎性小...

引用

作者：王锦鑫江苏海洋大学

学位级别：硕士

溶藻弧菌是一种人畜共患的海洋性弧菌,主要引起鱼、虾、贝等海洋生物的严重感染,以及造成人类胃肠炎、结膜炎、中耳炎、外耳炎等,严重感染者出现败血症而导致死亡。近几年,随着我国经济实力的强大与海水养殖业的蓬勃发展,海鲜逐渐成为... 详细信息

溶藻弧菌是一种人畜共患的海洋性弧菌,主要引起鱼、虾、贝等海洋生物的严重感染,以及造成人类胃肠炎、结膜炎、中耳炎、外耳炎等,严重感染者出现败血症而导致死亡。近几年,随着我国经济实力的强大与海水养殖业的蓬勃发展,海鲜逐渐成为人们日常饮食的一部分。随之而来的是关于溶藻弧菌引起食物中毒事件的报道变得屡见不鲜。溶藻弧菌引起的弧菌病呈世界性分布,一旦发病往往造成的就是大流行,对养殖业的经济是一个巨大的打击,对人们的身体健康是一个潜在的威胁。为了做到早期干预而达到“以防代治”的目的,建立溶藻弧菌致病菌的现场快速检测方法对控制疾病的爆发和传播具有深远意义。此外,在当前对于溶藻弧菌病的治疗采用的是广谱抗生素抗菌疗法,尚缺乏专门的药物或疫苗用于防治该病。但是,抗生素的抗菌疗法会不可抑制的导致溶藻弧菌耐药菌株的出现从而使得治疗变得更加困难。为了达到减少抗生素使用的目的,转换治疗思路,从使用抗生素的“抗菌”转为治疗宿主炎症的“抗炎”,期望寻找到新的治疗靶点。如今人们把越来越多的目光集中于溶藻弧菌与宿主之间的天然免疫应答研究。溶藻弧菌进入体内后迅速增殖是导致人类急性细菌感染的首要因素,而宿主的先天免疫应答系统则在对溶藻弧菌的识别、应答和介导炎症介质产生并促使病原消除过程中起了举足轻重的角色,其先天免疫细胞所表达的病原模式识别受体(PRRs)是发挥功效的第一站。尽管有文献报道称溶藻弧菌可以引起小鼠组织的炎性损伤,然而在宿主胞内的PRRs是怎样参与溶藻弧菌的识别并调节宿主炎性细胞应答,并未见研究。本课题以溶藻弧菌为研究对象:基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,rpa)技术结合exo荧光探针建立了溶藻弧菌现场快速检测方法,并从特异性、灵敏度、可行性等方面对建立的检测方法进行评估;通过建立小鼠巨噬细胞体外感染模型,筛选出宿主细胞识别溶藻弧菌调控炎性应答的关键模式样识别受体TLR2和NLRP3;利用NLRP3,Caspase1/11基因缺失小鼠确定溶藻弧菌通过激活宿主NLRP3炎性小体正调控炎性细胞因子分泌;测定TLR2、MAPK、AKT、NF-κB信号通路在溶藻弧菌调节宿主炎症反应及调控NLRP3炎性小体生成的作用。最终明确溶藻弧菌激活宿主NLRP3炎性小体的分子机制,以期为开发潜在的溶藻弧菌抗炎治疗提供理论依据。首先,以溶藻弧菌tox R基因为靶序列建立exo-rpa快速检测溶藻弧菌的方法。以常见弧菌致病菌菌株和常见食源性致病菌菌株为模板验证exo-rpa检测溶藻弧菌的种间特异性;以10 CFU/μL～10 CFU/μL的梯度浓度菌液为模板测定exo-rpa检测的灵敏度;以80份临床样本的基因组DNA为模板验证exo-rpa检测方法的可行性。结果显示:该方法具有良好的特异性,除溶藻弧菌外,并未检测到其他常见弧菌致病菌和常见食源性致病菌;该方法的灵敏度较高,能够检测到10 CFU/μL的溶藻弧菌,其最低检测下限为0.174 CFU/反应且对粗制样本有很好的兼容性;在80份临床样本检测中,对标方法q PCR与exo-rpa方法都能够检测到相同的11份阳性样本,一致率为100%。该方法的成功建立在现场检测中具有广泛的发展前景。其次,本研究建立的小鼠巨噬细胞体外感染模型,q PCR检测腹腔巨噬细胞中炎性细胞因子的转录水平;随后,利用Western blotting技术对NLRP3炎性小体的相关蛋白NLRP3、Caspase-1和IL-1β进行测定;酶联免疫吸附试验(ELISA)被用于进一步确定IL-1β、IL-12、IL-6和TNF-α等蛋白的表达水平;免疫荧光法测定NLRP3蛋白的亚细胞定位;此外,为了进一步确认NLRP3炎性小体在溶藻弧菌感染巨噬细胞中的关键作用,glyburide、CA-074 methyl ester、Ac-YVAD-CHO和Z-VAD-FMK等相关抑制剂以及NLRP3,Caspase-1/11小鼠巨噬细胞被用于本实验。q PCR结果表明溶藻弧菌可诱导巨噬细胞多种细胞因子的转录水平,包括IL-1β、IL-12、IL-18、TNF-α、IL-17、IL-6、IFN-γ、和IL-10,其中IL-1β的分泌水平最为显著;Western blotting检测NLRP3、Caspase-1和IL-1β发现,溶藻弧菌诱导NLRP3炎性小体激活从而导致IL-1β成熟分泌和Caspase-1活化,且反应呈感染时间和感染剂量依赖性,ELISA的检测验证了该结果;当溶藻弧菌感染巨噬细胞后NLRP3蛋白在细胞内由散在分布变为点状聚集,进一步证明NLRP3炎性小体可被溶藻弧菌激活;glyburide、CA-074 methyl ester、Ac-YVAD-CHO和Z-VAD-FMK等相关抑制剂预处理巨噬细胞

关键词：溶藻弧菌 exo-rpa NLRP3炎性小体腹腔巨噬细胞 TLR2异二聚体

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

全选清除本页清除全部题录导出标记到“检索档案”

共1页 << < 1 > >>

回到顶部

执行限定条件

欢迎您,

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

欢迎您,

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：