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exiguobacterium sp. MY02菌株PyNPase基因的克隆与表达

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华西药学杂志 2007年第6期22卷 600-604页

作者：姜立春韩文君余蓉阮期平绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室四川绵阳621000 四川大学华西药学院四川成都610041

目的鉴定、构建并高效表达从土壤中筛选到的一株耐热型、高活性的嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)。方法以MY02总DNA为模板,通过简并PCR、特异PCR引物、筛选和DNA测序,在5’引物和3’引物中分别引入NcoI和XbaI酶切位点,将pynp基因克隆至分泌... 详细信息

目的鉴定、构建并高效表达从土壤中筛选到的一株耐热型、高活性的嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)。方法以MY02总DNA为模板,通过简并PCR、特异PCR引物、筛选和DNA测序,在5’引物和3’引物中分别引入NcoI和XbaI酶切位点,将pynp基因克隆至分泌表达载体pBAD/gIII A中,转化至*** 10F’,以L-阿拉伯糖诱导表达,并对诱导剂浓度、诱导时间等进行优化。结果成功构建了重组表达载体pBAD/gIII A-pynp,通过磷酸化和转化反应,鉴定此酶为PyNPase。结论优化PyNPase的纯化条件与复性条件,可获得大量的PyNPase。

关键词： exiguobacterium 嘧啶核苷磷酸化酶高效表达磷酸化反应

exiguobacterium ***5 α-淀粉酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

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Exiguobacterium ***5 α-淀粉酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

作者：方淑君海南大学

学位级别：硕士

a-淀粉酶(EC3.***.1.1a-amylase)能作用于淀粉分子的a-1,4糖苷键,随机地将淀粉从内部切成小分子的糊精和还原糖。α-淀粉酶是一类重要的工业用酶,广泛应用于水质改良、食品(饲料)工业、粮食加工、酿造、发酵以及医药等行业。本研究采用碘... 详细信息

a-淀粉酶(EC3.***.1.1a-amylase)能作用于淀粉分子的a-1,4糖苷键,随机地将淀粉从内部切成小分子的糊精和还原糖。α-淀粉酶是一类重要的工业用酶,广泛应用于水质改良、食品(饲料)工业、粮食加工、酿造、发酵以及医药等行业。本研究采用碘-碘化钾染色法鉴定淀粉酶产生菌,从实验室保存的海虾虾壳分离的菌种中筛选到一株高产α-淀粉酶的菌株DAU5。16S rDNA序列同源性分析和系统进化树结果表明,菌株DAU5属于微小杆菌属(exiguobacterium),但不属于该属已知的任何种,故命名该菌株为exiguobacterium sp. DAU5。为克隆exiguobacterium sp. DAU5的a-淀粉酶基因,通过鸟枪法构建了exiguobacterium sp. DAU5基因组DNA文库。从该文库筛选得到一株具有α-淀粉酶活性的克隆,对其插入的DNA片段序列分析得知AmyH基因的部分序列。根据此序列和GenBank收录的exiguobacterium ***1b全基因组序列中一段相似度极高的序列设计引物,PCR扩增得到了exiguobacterium sp. DAU5AmyH基因。该基因开放阅读框全长1545bp,编码514个氨基酸,所表达的α-淀粉酶属于糖苷水解酶家族13,N末端含有一个长28aa的信号肽。以pET-32a(+)质粒作为载体,成功构建了AmyH基因的表达载体pET-AmyH-sp,并以*** BL21(trxB)为寄主菌对该基因诱导表达。表达的AmyH以包涵体形式出现,通过8M尿素变性,组氨酸标签亲和纯化,透析复性后成功得到了具有活性的AmyH纯化蛋白,其活性为每mg蛋白19.7x103U。SDS-PAGE显示AmyH融合蛋白大小约77kDa,使用肠激酶切除标签后的大小为57kDa,和氨基酸序列预测的大小一致。通过酶学性质研究得知：AmyH在30-40℃之间具有较好的活性,其中最适温度为40℃,40℃以下比较稳定,保持1h其酶活力基本不改变。AmyH在pH8.0时表现出较好的稳定性,其最适pH为8.5(甘氨酸-NaOH缓冲液)。Zn2+,Cu2+,Fe2+,SDS和EDTA对AmyH活性有极强抑制作用,5mM的浓度即可使AmyH完全失去活性;Li+, K+, Mg2+和Mn2+对AmyH有一定的抑制作用,而Ca2+,Ni2+和尿素对AmyH的活性无影响;AmyH对醇类和丙酮有较好的耐受性,其中20%浓度的甲醇,乙醇和丙酮时,仍保留93%以上的活性。AmyH对淀粉的亲和力和最大酶活都较高,其Km=0.94mg/mL, Vmax=208×103U/mg。以Kcat/Km值作为催化效率的参考,AmyH要高于已报道的来源于Nostoc sp. PCC711、Candida Antarctia、和、Pyrococcus furiosus的a-淀粉酶。TLC检测AmyH降解各种寡聚麦芽糖和可溶性淀粉的水解产物显示,AmyH能作用的最小寡聚糖为麦芽七糖,水解淀粉的第一个明显的寡聚麦芽糖产物是麦芽三糖,最终产物为多种低聚麦芽寡糖,这说明AmyH是一个典型的淀粉内切酶。

关键词： α-淀粉酶 exiguobacterium 基因克隆原核表达酶学性质

磺胺二甲嘧啶废水处理系统中exiguobacterium sp.H-1的分离及其环境适应特性

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环境工程技术学报 2024年第1期14卷 258-267页

作者：陈田王壮芦梦瑶陈研周佳屈建航潘婧诗罗宇河南工业大学生物工程学院河南工业大学国际教育学院

磺胺二甲嘧啶(SMZ)是一种难降解的广谱抗生素,其广泛存在已对水环境构成严重的威胁。微生物是环境中抗生素降解转化的主要驱动者,但高效降解SMZ的微生物资源匮乏。以SMZ废水处理系统的活性污泥为原料,采用纯培养技术从中分离筛选出一株... 详细信息

磺胺二甲嘧啶(SMZ)是一种难降解的广谱抗生素,其广泛存在已对水环境构成严重的威胁。微生物是环境中抗生素降解转化的主要驱动者,但高效降解SMZ的微生物资源匮乏。以SMZ废水处理系统的活性污泥为原料,采用纯培养技术从中分离筛选出一株SMZ降解菌H-1。经形态学观察、生理生化特征、16S rRNA基因序列分析,H-1归属于微小杆菌属(exiguobacterium sp.)。通过单因素试验研究初始SMZ浓度、接种量、pH和温度对菌株H-1降解SMZ效果的影响。结果表明,接种量、pH和温度对该菌株降解SMZ的影响较大。进一步采用响应面法优化菌株exiguobacterium sp.H-1降解SMZ的最佳条件,得出pH为7.21,温度为28.86℃,接种量为4.40%时,其对5 mg/L SMZ降解率为10.54%。本研究发现微小杆菌exiguobacterium sp.H-1具有降解SMZ的能力,其降解SMZ的独特之处是能够将SMZ脱去SO_(2),生成嘧啶环和苯胺环,经过耦合生成N-(4,6-二甲基嘧啶-2基)-1,4-二苯胺,然后进行脱氨反应,生成2-苯-4,6-二甲基嘧啶,随后去甲基化生成产物6(2-苯基-1,2-二氢嘧啶,m/z为159.97)。此外,菌株H-1在0~10%NaCl的广泛范围内也表现出很强的耐盐性,能够为SMZ污染水体的生物修复提供耐盐能力强的微生物菌株资源。

关键词：磺胺二甲嘧啶 exiguobacterium 生物降解环境适应性生物修复

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两株冲绳海槽热液细菌的研究

两株冲绳海槽热液细菌的研究

作者：陈晨中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)

学位级别：硕士

极端生存环境使深海热液区微生物具有十分独特的生理生化特征和能量代谢途径,这些微生物不仅是巨大的新型功能基因和新型生物活性物质资源库,同时也对深海生物地球化学过程有着巨大的影响,因此对深海热液微生物的研究十分必要。本文的... 详细信息

极端生存环境使深海热液区微生物具有十分独特的生理生化特征和能量代谢途径,这些微生物不仅是巨大的新型功能基因和新型生物活性物质资源库,同时也对深海生物地球化学过程有着巨大的影响,因此对深海热液微生物的研究十分必要。本文的第一部分对来自冲绳海槽热液区的一株细菌exiguobacterium ***1进行了研究。HVEsp1分离自冲绳海槽深海热液沉积物,能在50℃生长,游动能力强,具有多种重金属和抗生素抗性。HVEsp1的基因组大小为2838499 bp,G+C含量为48.2%,包含2948个编码序列。基因组序列分析显示了大量与细胞运动、重金属抗性、抗生素抗性和耐热相关基因。通过与其亲缘关系最近的菌株exiguobacterium ***1b进行比较基因组分析发现,HVEsp1的基因组中移动元件数量丰富,它们可能在细菌通过基因水平转移获得有利基因的过程中发挥重要作用。这些结果加深了我们对深海热液细菌适应极端环境机制的了解,也为以后的深入研究奠定了基础。在本文第二部分中,我们从分离自热液沉积物和大型生物样品的细菌中筛选了出一株致病菌株Bacillus ***-52。分析发现,SR-52对大菱鲆和小鼠有较高致死率。进一步研究发现SR-52在大菱鲆血清和小鼠血清中具高存活率,与SR-52孵育后的大菱鲆血清溶血活性和杀菌活性均显著降低,说明SR-52能激活宿主血清中的补体系统,同时也能够抵抗补体的杀伤作用。大菱鲆体内感染实验表明,SR-52能侵入肝、脾和肾,且随感染时间延长组织中细菌数量增加,说明细菌能在宿主组织内繁殖。这些研究结果为深海致病菌的致病机制的深入研究奠定了基础。

关键词：深海热液 exiguobacterium 环境适应 Bacillus 致病菌

一株能降解牛奶中过敏原αs1-酪蛋白的蛋白酶产生菌的筛选、鉴定及免疫学研究

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工业微生物 2013年第6期43卷 60-67页

作者：谈铭张娟朱婷堵国成陈坚食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122 糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122

从牛奶场附近土壤中筛选得到1株能降解牛奶过敏原蛋白(αs1-酪蛋白)的菌株exiguobacterium BBE201110,能产分子量约为55 kDa的蛋白酶,酶活达到346.48 U/mL,对该酶降解牛奶过敏原(αs1-酪蛋白)效果进行免疫学研究(Western blot)表明,在... 详细信息

从牛奶场附近土壤中筛选得到1株能降解牛奶过敏原蛋白(αs1-酪蛋白)的菌株exiguobacterium BBE201110,能产分子量约为55 kDa的蛋白酶,酶活达到346.48 U/mL,对该酶降解牛奶过敏原(αs1-酪蛋白)效果进行免疫学研究(Western blot)表明,在牛奶中添加4%的酶溶液进行降解20 min,酪蛋白特异性清除显著,过敏原蛋白αs1-酪蛋白浓度明显的降低。本实验筛得降解牛奶过敏原蛋白(αs1-酪蛋白)的菌株并成功纯化出蛋白酶,具有一定的食品工业开发价值及商业应用潜力。

关键词： αs1-酪蛋白 exiguobacterium BBE201 1 10 免疫验证

小麦丝核菌病害抑制作用的相关微生物及其机理(英文)

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山东科学 2005年第3期18卷 16-21页

作者： Stephen John BARNETT South Australian Research and Development Institute GPO Box 397Adelaide 5001 South Australia

由Rhizoctoniasolani引起的小麦丝核菌根腐病是世界范围内小麦的主要病害之一。保留作物残体的精耕栽培制度可使土壤变为对病害有抑制作用的抑病土。研究了南澳大利亚埃文抑病土壤中与抑制作用相关的生物体。分离到许多在苗期抑制病害... 详细信息

由Rhizoctoniasolani引起的小麦丝核菌根腐病是世界范围内小麦的主要病害之一。保留作物残体的精耕栽培制度可使土壤变为对病害有抑制作用的抑病土。研究了南澳大利亚埃文抑病土壤中与抑制作用相关的生物体。分离到许多在苗期抑制病害的细菌(Pantoeaagglomerans,exiguobacteriumacetylicum,微杆菌以及Streptomyces),木霉菌和食真菌线虫。研究结果表明,埃文抑病土的抑病作用与多种生物有关,其作用机理也多种多样。

关键词：病害抑制 Rhizoctonia solani Pantoea exiguobacterium 微杆菌 Trichoderma