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畜牧兽医学报 2025年第1期56卷 378-391页

作者：贾新月马静普娜赵文卿陈旭珂张艳艳孙艳薄新文王正荣省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院畜牧兽医研究所石河子832000 石河子大学动物科技学院石河子832000 塔里木大学动物科学与技术学院阿拉尔843300

旨在构建并制备细粒棘球绦虫EBY100/pYD1-egm123表面展示型酿酒酵母口服活载体菌株,并初步评价其免疫效果,以期为细粒棘球绦虫终末宿主酿酒酵母活载体口服疫苗的研发提供理论基础。克隆细粒棘球绦虫egm123基因,构建EBY100/pYD1-egm123... 详细信息

旨在构建并制备细粒棘球绦虫EBY100/pYD1-egm123表面展示型酿酒酵母口服活载体菌株,并初步评价其免疫效果,以期为细粒棘球绦虫终末宿主酿酒酵母活载体口服疫苗的研发提供理论基础。克隆细粒棘球绦虫egm123基因,构建EBY100/pYD1-egm123表面展示型酿酒酵母菌株。诱导培养表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-egm123,并进行体外分析,通过免疫荧光分析以及BCA蛋白定量法对egm123蛋白进行定位鉴定及定量分析。诱导表达表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-egm123菌株并免疫BALB/c小鼠。通过检测小鼠血清中抗体及细胞因子水平变化评价细粒棘球绦虫egm123口服酵母活载体菌株的免疫效果。结果成功克隆了细粒棘球绦虫egm123的ORF序列,长度为594 bp。PCR检测以及酶切鉴定结果表明,成功构建EBY100/pYD1-egm123表面展示型酿酒酵母菌株。免疫荧光结果显示,EBY100/pYD1-egm123表面具有绿色荧光,BCA蛋白定量法测定50 OD_(600 nm)EBY100/pYD1-egm123诱导72 h后蛋白的表达量为15.59μg,浓度为0.31μg/OD_(600 nm)。抗体水平检测结果表明,EBY100/pYD1-egm123免疫组特异IgG、IgA、IgM抗体的分泌均高于PBS组、EBY100组及EBY100/pYD1组(Pegm123免疫组对小鼠细胞因子IL-17、IFN-γ的分泌量显著加强(Pegm123表面展示型酿酒酵母口服活载体菌株免疫效果的初步评价,发现该口服活载体菌株具有免疫原性,可以刺激小鼠产生特异性免疫应答,进一步说明其具有成为终末宿主抗囊型包虫候选疫苗的潜力。

关键词：细粒棘球绦虫 egm123 表面展示型酿酒酵母口服疫苗

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细粒棘球绦虫egm123重组耻垢分枝杆菌疫苗在小鼠体内的表达及其免疫应答

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中国病原生物学杂志 2018年第12期13卷 1314-1318,1323页

作者：何黎齐文静郑雪婷郭刚李军张文宝新疆医科大学基础医学院新疆乌鲁木齐830054 中亚高发病成因与防治国家重点实验室临床医学研究院新疆医科大学第一附属医院

目的构建表达细粒棘球绦虫成虫特异性基因egm123的耻垢分枝杆菌疫苗株,接种BALB/c小鼠,观察其免疫原性。方法 PCR扩增egm123片段,定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261中,构建重组质粒pMV261-egm123。连接产物转化至大肠埃希菌... 详细信息

目的构建表达细粒棘球绦虫成虫特异性基因egm123的耻垢分枝杆菌疫苗株,接种BALB/c小鼠,观察其免疫原性。方法 PCR扩增egm123片段,定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261中,构建重组质粒pMV261-egm123。连接产物转化至大肠埃希菌DH5α中,培养后提取质粒,测序确定阅读框架正确,后电穿孔转入耻垢分枝杆菌,构建表达egm123的重组耻垢分枝杆菌疫苗(rMS-egm123),经热诱导后采用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白表达。在培养过程中连续检测菌液A600值,绘制重组菌生长曲线。取重组菌接种小鼠,检测基础接种和加强免疫接种后血清特异抗体水平。结果 PCR扩增出大小为594bp的egm123片段,egm123基因正确插入到穿梭质粒pMV261中,测序鉴定阅读框架正确。重组耻垢分枝杆菌连续传10代培养,重组质粒DNA序列未发生变异。Western blot检测表达产物能被抗egm123鼠血清识别。用重组耻垢分枝杆菌疫苗加强免疫后的小鼠血清特异性抗体呈持续上升趋势,单次加强免疫8周后抗体水平(A405值为2.504±0.659)显著高于亚单位疫苗组(Pegm123蛋白,且该重组疫苗可通过加强免疫增强基础免疫诱导小鼠产生的抗体水平。

关键词：包虫病 egm123 重组耻垢分枝杆菌疫苗

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细粒棘球绦虫成虫相关基因egm123的克隆、表达及鉴定

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中国病原生物学杂志 2017年第1期12卷 38-41页

作者：王慧齐文静何黎郭宝平张文宝李军新疆医科大学第一附属医院新疆重大疾病医学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地新疆包虫病基础医学重点实验室新疆乌鲁木齐830054

目的构建细粒棘球绦虫成虫相关基因egm123基因原核表达载体,诱导表达并鉴定egm123蛋白。方法提取pET41b-egm123重组质粒,以此为模板PCR扩增egm123基因片段,克隆至原核表达载体pET28a中,经限制性内切酶双酶切和测序鉴定。将重组菌质粒转... 详细信息

目的构建细粒棘球绦虫成虫相关基因egm123基因原核表达载体,诱导表达并鉴定egm123蛋白。方法提取pET41b-egm123重组质粒,以此为模板PCR扩增egm123基因片段,克隆至原核表达载体pET28a中,经限制性内切酶双酶切和测序鉴定。将重组菌质粒转化大肠埃希菌BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因表达,采用SDS-PAGE对表达蛋白进行分析,Western blot鉴定其免疫反应性。结果 PCR扩增egm123基因片段长度为594bp,经酶切分析和测序鉴定证明pET28a-egm123原核表达载体构建正确。重组质粒转化BL21在37℃条件下,经IPTG(终浓度为0.4mmol/L)诱导3h,获得分子质量单位约为29ku的egm123蛋白,与理论值相符。该蛋白能被egm123-GST免疫兔抗血清识别。结论成功构建了pET28a-egm123原核表达载体,表达蛋白具有免疫反应性,为研制包虫病疫苗奠定了基础。

关键词：包虫病细粒棘球绦虫 egm123 蛋白表达疫苗

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细粒棘球绦虫egm123重组霍乱毒素B亚单位构建及其免疫特性鉴定

细粒棘球绦虫EgM123重组霍乱毒素B亚单位构建及其免疫特性鉴定

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作者：齐文静新疆农业大学

学位级别：硕士

包虫病是由棘球绦虫的幼虫引起的人兽共患疾病,呈世界性分布。中国是包虫病高发区,25个省/自治区有病例报道,其中新疆、甘肃、宁夏、陕西、内蒙古、青海、四川和西藏为包虫病高发区,严重影响我国农牧区的经济发展和群众健康。霍乱毒素B... 详细信息

包虫病是由棘球绦虫的幼虫引起的人兽共患疾病,呈世界性分布。中国是包虫病高发区,25个省/自治区有病例报道,其中新疆、甘肃、宁夏、陕西、内蒙古、青海、四川和西藏为包虫病高发区,严重影响我国农牧区的经济发展和群众健康。霍乱毒素B亚单位(CTB)是一种新型的免疫佐剂,通过构建细粒棘球绦虫成虫特异表达基因egm123与霍乱毒素B亚基融合重组为CTB-egm123融合蛋白,并在大肠杆菌中表达为亚单位疫苗,通过免疫接种小鼠确定其免疫原性。为了构建表达系统,通过PCR扩增细粒棘球绦虫的egm 123基因,并将其连接到含有CTB片段的下游构建为CTB-egm123融合原核表达质粒载体pET28a-CTB-egm123。在通过IPTG诱导,并用吸附标签-His的亲和柱纯化,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白分子量为35kDa。Western blotting结果显示重组蛋白被抗egm123血清特异识别。纯化的egm123和CTB-egm123蛋白分别用于免疫接种小鼠。在三次接种后,通过ELISA测量针对egm123的抗体,其滴度为(血清滴度>320,000),ELISA也被用于测量免疫小鼠血清中的抗体IgG亚类,结果显示,免疫后1周后,IgG1,IgG2a和IgG2b为主要的抗体存在于血清中。然而,在免疫后第6周,IgG2a和IgG2b在小鼠血清中占优势;同时,在小肠组织中可以检测到IgG2a、IgG2b和IgG3抗体的表达。免疫接种后小鼠血浆中的细胞因子用流式细胞的方法测定,结果显示,CTB-egm123免疫小鼠细胞因子IL-17A,TNF,IL-4,IL-6和IFN-γ表达上调,并且在免疫一周后,这些细胞因子在血浆中的含量高于正常对照小鼠(Pegm123蛋白仅上调细胞因子TNF和IL-6,并下调IL-4(Pegm123可在早期接种时诱导Th1应答。免疫6周后,接种CTB-egm123的小鼠中细胞因子IL-17A和IL-6仍然高于正常对照小鼠血浆中的这些淋巴因子(Pegm123的小鼠在免疫6周后诱导血浆中高水平的IL-17A,TNF,IL-6和IFN-γ,与对照组相比,差异显著(Pegm123可以诱导Th1和Th2免疫应答。本研究用流式细胞技术分析了免疫小鼠的淋巴细胞群。结果显示,免疫后第1周时,egm123和CTB-egm123均降低CD8+T细胞百分比,增加CD4+T细胞百分比(Pegm123诱导很强的细胞免疫。本研究结果表明,重组蛋白egm123和CTB-egm123可以作为候选疫苗蛋白,CTB-egm123诱导了很强的Th1和Th2免疫反应,为研发犬抗细粒棘球绦虫疫苗奠定了基础。

关键词：细粒棘球绦虫霍乱毒素B亚单位 egm123 融合蛋白疫苗

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