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棘球蚴eg95蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

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棘球蚴EG95蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

作者：李玲玲中国农业科学院

学位级别：硕士

棘球蚴病(echinococcosis)(俗称包虫病,hydatidosis)是由棘球绦虫(Echinococcus spp.)的幼虫(棘球蚴)寄生于人和动物肝、肺等器官所引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。根据分子分类方法将棘球绦虫分为至少9个种,其中危害最为严重的是... 详细信息

棘球蚴病(echinococcosis)(俗称包虫病,hydatidosis)是由棘球绦虫(Echinococcus spp.)的幼虫(棘球蚴)寄生于人和动物肝、肺等器官所引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。根据分子分类方法将棘球绦虫分为至少9个种,其中危害最为严重的是细粒棘球绦虫(***,eg)。eg95蛋白是细粒棘球绦虫的一种天然抗原,而且是迄今为止发现的最有效的保护性抗原之一,也是最具发展前景的包虫病候选疫苗抗原,经过二次免疫后的绵羊对虫卵攻击的保护率将近100%;此外,其氨基酸序列相当保守。因此,对eg95蛋白的研究极为重要,相信随着研究技术的不断发展,对eg95的研究将会更加深入,对免疫动物抗体水平检测、疫苗中抗原含量的检测等提供有力支撑。单克隆抗体(monclonal antibody,m Ab或Mc Ab)是由高度一致的免疫细胞制成的抗体,这些免疫细胞是单一亲本细胞的所有克隆。单克隆抗体具有理化性状高度均一、生物活性单一、特异性强、便于人为处理和质量控制,来源容易等优点,使其广泛应用于医学、兽医学等领域。多克隆抗体(polyclonal antibody,Pc Ab)是用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物,刺激机体产生针对多种抗原表位的不同抗体的混合物,能够识别多个抗原表位,因制备过程简单、周期短、易获得、敏感性强等优点广泛应用于研究和诊断方面。本研究旨在通过棘球蚴eg95蛋白免疫小鼠,取免疫鼠的B淋巴细胞,与鼠的骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选分泌针对eg95蛋白的骨髓瘤杂交细胞,制备单克隆抗体,并通过eg95蛋白免疫兔,制备多克隆抗体,为棘球蚴eg95蛋白的组织定位、功能研究、定量方法建立等提供有力工具。试验通过eg95抗原与弗氏佐剂混合后免疫BALB/c小鼠,待免疫小鼠血清效价达到细胞融合使用标准后,取小鼠的脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞在聚乙二醇(Peg)的诱导作用下融合制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA对细胞培养上清进行检测,经过三次亚克隆筛选出能够稳定生长并且持续分泌抗体的杂交瘤细胞株,通过细胞培养取上清或小鼠腹水大量制备单克隆抗体以备使用。结果成功筛选、制备了3株腹水效价大于1:409,600的杂交瘤细胞,经鉴定单克隆抗体的亚型分别为Ig G2a、Ig G2a和Ig G3,轻链均为κ。同时以eg95抗原与弗氏佐剂、Quil A佐剂混合免疫新西兰大白兔,血清效价达1:10,000以上,用于制备多克隆抗体。基于单克隆抗体3C5和多克隆抗体的竞争ELISA方法对已知20份羊阳性血清和20份羊阴性血清进行了检测,检测结果表明:阳性符合率为100%,阴性符合率为95%,与传统的间接ELISA检测抗体试剂盒相比,此竞争ELISA方法具有特异性更好、操作更简单等优点,具有良好的应用前景。本试验成功建立了疫苗免疫羊抗体竞争ELISA检测方法,同时,多株单克抗体杂交瘤细胞的获得为今后棘球蚴eg95蛋白的组织定位、保护性抗原表位鉴定、免疫保护机理研究、疫苗抗原定量和免疫抗体检测方法建立等奠定了坚实的基础。

关键词：棘球蚴病 eg95蛋白单克隆抗体多克隆抗体抗体检测方法

表达细粒棘球蚴eg95蛋白重组狂犬病病毒的构建及免疫研究

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表达细粒棘球蚴EG95蛋白重组狂犬病病毒的构建及免疫研究

作者：许彤山东大学

学位级别：硕士

背景包虫病(Hydatidosis)是由棘球绦虫的幼虫寄生宿主器官引起的一种人兽共患病。该病主要流行于中国、中亚、中东、南美和欧洲等地区。其中由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,E.g)寄生引起的囊型包虫病(Cystic echinococcus,CE)... 详细信息

背景包虫病(Hydatidosis)是由棘球绦虫的幼虫寄生宿主器官引起的一种人兽共患病。该病主要流行于中国、中亚、中东、南美和欧洲等地区。其中由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,E.g)寄生引起的囊型包虫病(Cystic echinococcus,CE)在我国广泛流行,导致严重疾病负担及畜牧业损失。牛羊等家畜为细粒棘球绦虫的中间宿主,犬科动物是终末宿主,人作为中间宿主偶发感染。其临床症状是由幼虫感染中间宿主,导致肝肺等脏器实质性病变,损害器官功能,或包囊破裂导致过敏性休克或继发性细菌感染。CE每年导致1.93万例死亡,以及87.1万残疾调整生命年(Disable-adjusted Life-years,DALYs),每年与该病相关的治疗费用及畜牧业损失约为30亿美元。给中间宿主接种疫苗以切断其生活史发育环节是一种更实用的有效控制细粒棘球绦虫传播的选择。目前由细粒棘球蚴表达的eg95蛋白制成的亚单位疫苗在一些CE流行地区进行实验证明该抗原安全有效。但该疫苗接种程序复杂,多次接种且需要佐剂才能达到预期的免疫保护效果,社会成本高。因此,迫切需要研制更廉价、更高效的细粒棘球绦虫疫苗。同时,狂犬病(Rabies)是一种严重的人兽共患病,由弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssavirus)的狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)所引起,所有的温血动物均可感染,病死率几乎为100%。该病呈全球流行,主要发生在发展中国家,严重威胁公共卫生安全。由于犬源狂犬病控制不足和野生动物狂犬病的蔓延,我国边境牧区羊、牛等家畜狂犬病近年来迅速增加,不但造成畜牧业经济损失,而且给农民和兽医带来潜在的感染风险。世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)建议在狂犬病流行区对牛羊等进行狂犬病疫苗免疫,并在一些国家成功实施。RABV作为表达外源基因的良好载体,具有独特优势,已有很多研究者以RABV为载体研制多种表达各类外源病毒抗原蛋白的重组疫苗。综上所述,为避免包虫病和狂犬病双重流行对边境牧区牛羊造成严重的经济损失,亟待研制一种安全有效的可以同时预防牛羊细粒棘球绦虫和RABV的二联疫苗。目的1.以狂犬病病毒弱毒株LBNSE为载体表达细粒棘球蚴eg95蛋白,利用反向遗传技术构建重组病毒LBNSE-eg95。2.通过体内和体外实验,评价LBNSE-eg95的生物学特性、致病性、保护性和免疫原性,评估重组病毒LBNSE-eg95作为囊型包虫病和狂犬病的候选二联疫苗的潜力。方法1.重组狂犬病病毒LBNSE-eg95的构建与鉴定。将细粒棘球蚴eg95基因插入LBNSE感染性克隆伪基因区,获得重组感染性克隆,转染BHK-21细胞拯救获得重组病毒LBNSE-eg95。通过RT-PCR、免疫荧光实验(IFA)、流式细胞术和Western blot等鉴定该重组病毒的生物学特性。2.重组病毒LBNSE-eg95的致病性分析。雌性BALB/c小鼠(6-8周)随机分为实验组、对照组、空白组,分别经后肢肌肉免疫重组病毒LBNSE-eg95、亲本毒株LBNSE和DMEM,连续21天观察监测小鼠的体重变化、饮食情况和精神状况等。3.重组病毒LBNSE-eg95诱导小鼠产生特异性保护性抗体能力检测。免疫小鼠后第2、4、8周采集血清,利用荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测RABV中和抗体效价,用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测eg95特异性抗体水平。4.重组病毒LBNSE-eg95的保护性评价。免疫小鼠后4周,经后肢肌肉注射RABV。连续21天观察监测感染后小鼠的存活率、体重变化、饮食情况和临床症状等,评价重组病毒对小鼠的保护作用。5.重组病毒LBNSE-eg95诱导小鼠淋巴结募集/激活DCs能力检测。免疫后第3、6、9天收集小鼠腹股沟淋巴结淋巴细胞,通过流式细胞术检测LBNSE-eg95诱导小鼠淋巴结募集/激活DCs能力。6.重组病毒LBNSE-eg95诱导小鼠淋巴结和外周血募集/激活B淋巴细胞能力检测。免疫后第3、6、9天收集小鼠腹股沟淋巴结淋巴细胞,并且在免疫后第7、14、28天收集外周血,通过流式细胞术检测LBNSE-eg95诱导小鼠募集/激活B淋巴细胞的能力。7.重组病毒LBNSE-eg95诱导小鼠产生分泌IFN-γ和IL-4特异性T细胞能力检测。免疫后第7、14天收集小鼠脾脏淋巴细胞,通过流式细胞术检测在RABV和eg95蛋白特异性刺激下,LBNSE-eg95诱导小鼠产生分泌IFN-γ和IL-4的特异性CD4+和CD8+T细胞的能力。在免疫后第28天分离小鼠脾脏淋巴细胞,利用酶联免疫斑点实验(ELISpot)检测小鼠产生分泌IFN-γ和IL-4特异性T细胞的能力。8

关键词：细粒棘球蚴狂犬病病毒狂犬病病毒载体 eg95蛋白二联疫苗

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棘球蚴eg95蛋白单克隆抗体的制备

棘球蚴EG95蛋白单克隆抗体的制备

2021中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第二届青年科学家学术论坛

作者：李玲玲李敏李立吴燕涛刘萍闫鸿斌付宝权贾万忠中国农科院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家动物包虫病专业实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部人畜共患病重点实验室

棘球蚴病(echinococcosis)(俗称包虫病,hydatidosis),是由棘球绦虫(Echinococcus spp.)的幼虫(棘球蚴)寄生于人和动物肝、肺等器官所引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。众多试验发现,eg95蛋白是迄今为止发现的最有效的保护性抗原之一,... 详细信息

棘球蚴病(echinococcosis)(俗称包虫病,hydatidosis),是由棘球绦虫(Echinococcus spp.)的幼虫(棘球蚴)寄生于人和动物肝、肺等器官所引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。众多试验发现,eg95蛋白是迄今为止发现的最有效的保护性抗原之一,经过免疫后的绵羊对虫卵攻击的保护率将近100%,因此对eg95蛋白的研究具有极其重要的意义。单克隆抗体(mAb或moAb)是由高度一致的免疫细胞制成的抗体,这些免疫细胞是单一亲本细胞的所有克隆。单克隆抗体具有理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制,并且来源容易等优点,使其广泛应用于医学、兽医学等领域。本研究旨在通过棘球蚴eg95蛋白免疫小鼠,取免疫鼠的B淋巴细胞,与鼠的骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选分泌针对eg95蛋白的骨髓瘤杂交细胞,制备单克隆抗体,为棘球蚴eg95蛋白的组织定位、功能研究、定量方法建立等提供有力工具。实验通过eg95抗原与弗氏佐剂乳化后免疫Balb/c小鼠,免疫剂量分为25μg和50μg两组,待免疫小鼠血清效价达到1:20000后,取小鼠的脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞在聚乙二醇(Peg)的诱导作用下融合制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA对细胞培养上清进行检测,经过三次亚克隆筛选出能够稳定生长并且持续分泌抗体的杂交瘤细胞株,此时扩大培养的同时对细胞进行冻存,通过细胞培养取上清或小鼠腹水大量制备单克隆抗体以备使用。结果成功筛选、制备一株腹水效价大于1:240000的杂交瘤细胞,经鉴定单克隆抗体的亚型为IgG2a,为今后棘球蚴eg95蛋白的组织定位、保护性抗原表位鉴定、免疫保护机理研究、疫苗抗原定量方法建立等奠定了坚实的基础。

关键词：棘球蚴病 eg95蛋白单克隆抗体

来源： cnki会议评论

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棘球蚴(包虫)病疫苗研究进展

中国人兽共患病学报 2019年第1期35卷 59-65页

作者：朱国强闫鸿斌李立贾万忠中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

棘球蚴病是由棘球属绦虫的幼虫寄生于动物(包括人)体内而引起的一类古老疾病,其中细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病严重阻碍着畜牧业的发展和人类身体健康,造成了巨大的经济损失。棘球蚴病的有效防治需要抗棘球蚴药物和疫苗以及其他措施的综... 详细信息

棘球蚴病是由棘球属绦虫的幼虫寄生于动物(包括人)体内而引起的一类古老疾病,其中细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病严重阻碍着畜牧业的发展和人类身体健康,造成了巨大的经济损失。棘球蚴病的有效防治需要抗棘球蚴药物和疫苗以及其他措施的综合实施。虽然一些抗棘球蚴药物作为疫病防控的重要手段已被应用,但化学药物存在耐药性、药物残留、环境污染等问题,而疫苗因具有安全、无残留、动物无休药期、符合"预防为主,治疗为辅"的方针等优点,如今得到愈来愈广泛地研究和应用,并得到了长足的发展和突破。本文对棘球蚴病不同类型疫苗的研究进展做一综述,旨在对棘球蚴病疫苗的研制和开发有更加全面系统的了解和展望。

关键词：棘球蚴病疫苗 eg95蛋白基因工程研究进展

载体介导的细粒棘球绦虫eg95疫苗的研制现状

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中华地方病学杂志 2023年第8期42卷 684-688页

作者：李文桂陈雅棠重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所重庆400016

由细粒棘球绦虫(eg)续绦期幼虫引起的囊型棘球蚴病(CE)是目前我国重点防控的寄生虫病之一。eg95蛋白是一种公认的疫苗候选分子,研制载体介导的eg95疫苗是当前CE研究热点之一。本文概述了牛痘病毒、羊口疮病毒、山羊痘病毒、狂犬病毒、... 详细信息

由细粒棘球绦虫(eg)续绦期幼虫引起的囊型棘球蚴病(CE)是目前我国重点防控的寄生虫病之一。eg95蛋白是一种公认的疫苗候选分子,研制载体介导的eg95疫苗是当前CE研究热点之一。本文概述了牛痘病毒、羊口疮病毒、山羊痘病毒、狂犬病毒、鼠伤寒沙门菌、卡介苗、根癌农杆菌和两歧双歧杆菌等载体介导的eg95疫苗的研制现状,旨在为CE的免疫预防研究提供有价值的资料。

关键词：细粒棘球绦虫 eg95蛋白疫苗

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包虫病特异性疫苗抗原研究现状及展望

中国普外基础与临床杂志 2023年第6期30卷 734-738页

作者：杨先伟陶浪魏金文刘谨贤电子科技大学附属医院·四川省人民医院四川省医学科学院·四川省人民医院甲状腺外科成都610072 电子科技大学医学院成都610056

目的总结包虫病特异性疫苗抗原研究现状,分析其来源及应用前景,以期为包虫病疫苗抗原研发和药物治疗提供新思路。方法检索国内外有关包虫病特异性疫苗抗原相关的研究并进行综述。结果天然包虫抗原,如囊液粗抗原、原头节、生发层等,由于... 详细信息

目的总结包虫病特异性疫苗抗原研究现状,分析其来源及应用前景,以期为包虫病疫苗抗原研发和药物治疗提供新思路。方法检索国内外有关包虫病特异性疫苗抗原相关的研究并进行综述。结果天然包虫抗原,如囊液粗抗原、原头节、生发层等,由于材料获取困难和制备繁琐,常常会出现批间差异而造成敏感度、特异度等评价指标不稳定。新型重组包虫自身特异抗原、多肽、DNA分子等结构已知,重复性和特异性较好,更适合批量化生产测试,是目前研究的主要方向,如rAgB8/1、rEm18、rEm2等。结论疫苗研发是攻克包虫病的主要方向之一,在棘球蚴与人或动物宿主的相互作用中,棘球蚴自身结构蛋白及排泄/分泌蛋白等刺激宿主产生抗虫免疫和免疫清除,寻找这些特异性蛋白抗原对于疫苗研发及新型药物治疗具有重要意义。

关键词：包虫病疫苗 eg95蛋白基因重组抗原

羊棘球蚴(包虫)间接ELISA抗体检测试剂盒的研制

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安徽农业科学 2015年第30期43卷 105-108页

作者：邓灿新田东升李春燕赵扬扬曾仁权曹政西南大学荣昌校区动物医学系重庆402460 重庆澳龙生物制品有限公司重庆402460

[目的]研制基于eg95重组蛋白为检测抗原的羊棘球蚴(包虫)间接ELISA抗体检测试剂盒。[方法]以细粒棘球蚴eg95重组蛋白为检测抗原,筛选间接ELISA的最佳反应条件,确定ELISA的判定标准,检测敏感性和重复性,组成、包装试剂盒并初步应用。[结... 详细信息

[目的]研制基于eg95重组蛋白为检测抗原的羊棘球蚴(包虫)间接ELISA抗体检测试剂盒。[方法]以细粒棘球蚴eg95重组蛋白为检测抗原,筛选间接ELISA的最佳反应条件,确定ELISA的判定标准,检测敏感性和重复性,组成、包装试剂盒并初步应用。[结果]建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,检测阳性血清和阴性血清的准确率均为100%。[结论]研制的羊棘球蚴(包虫)病ELISA抗体检测试剂盒可用于细粒棘球蚴eg95亚单位疫苗抗体水平的检测。

关键词：细粒棘球蚴 eg95蛋白试剂盒 ELISA