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冬凌草甲素调控MAPK-erk1/2通路促进三阴性乳腺癌细胞自噬和凋亡的机制研究

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冬凌草甲素调控MAPK-ERK1/2通路促进三阴性乳腺癌细胞自噬和凋亡...

作者：吕敏济宁医学院

学位级别：硕士

目的:本研究以三阴性乳腺癌(TNBC)细胞株MDA-MB-231和BT549为研究对象,探究冬凌草甲素对三阴性乳腺癌细胞的抗肿瘤作用,包括细胞增殖、凋亡、自噬以及erk1/2信号转导途径的可能机制。方法:(1)使用CCK-8检测法检测不同浓度冬凌草甲素干预... 详细信息

目的:本研究以三阴性乳腺癌(TNBC)细胞株MDA-MB-231和BT549为研究对象,探究冬凌草甲素对三阴性乳腺癌细胞的抗肿瘤作用,包括细胞增殖、凋亡、自噬以及erk1/2信号转导途径的可能机制。方法:(1)使用CCK-8检测法检测不同浓度冬凌草甲素干预下MDA-MB-231和BT549细胞体外存活能力,并计算两种细胞冬凌草甲素作用下的IC50值。(2)Ed U染色和克隆形成实验进一步观察MDA-MB-231和BT549细胞在不同浓度冬凌草甲素干预下的增殖能力变化。(3)流式细胞术检测在冬凌草甲素干预下MDA-MB-231和BT549细胞凋亡的变化。(4)将自噬双标腺病毒(m RFP-GFP-LC3)转染TNBC细胞后,加入冬凌草甲素观察细胞自噬溶酶体水平的变化。(5)Western blot实验观察在冬凌草甲素干预下,三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549细胞的自噬以及凋亡蛋白p62、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、Beclin1和LC3-II/I表达水平的变化。(6)通过3-甲基腺嘌呤(3MA)和冬凌草甲素存在或者不存在的情况下作用MDA-MB-231和BT549细胞,检测凋亡水平变化,以及Western blot实验检测Bcl-2、LC3-II/I、p-erk1/2蛋白的表达水平变化。(7)冬凌草甲素联合erk1/2通路抑制剂(FR180204)后观察细胞增殖和凋亡情况。结果:(1)冬凌草甲素能够抑制MDA-MB-231和BT549细胞的体外存活能力,CCK-8结果显示,不同浓度冬凌草甲素干预MDA-MB-231和BT549细胞24小时后,与对照组相比,冬凌草甲素可呈浓度依赖性显著抑制两种细胞体外存活能力(P2)Ed U染色和平板克隆形成实验显示,随着冬凌草甲素浓度的提高,MDA-MB-231和BT549细胞增殖活力逐渐下降(P231和BT549细胞的体外凋亡,可以观察到较高浓度冬凌草甲素可诱导MDA-MB-231和BT549细胞的凋亡,细胞凋亡数量呈剂量依赖关系(P2、Bcl-2蛋白水平(P1和LC3-II的水平(P通过促进自噬来调控增加细胞凋亡。(6)我们在三阴乳腺癌MDA-MB-231及BT549细胞中发现了冬凌草甲素作用下erk1/2(P44/42)磷酸化水平减低(Perk1/2表达较冬凌草甲素组上调(P通过抑制erk1/2通路的激活来调控自噬从而促进凋亡。(7)加入erk1/2抑制剂FR180204后,二者联用较单独冬凌草甲素组可协同抑制增殖和促进三阴性乳腺癌细胞凋亡率的增加的作用(P通过本实验,我们验证了冬凌草甲素具有抑制TNBC细胞增殖的功能,并能促进凋亡及自噬的发生,加入自噬抑制剂以后,可以逆转冬凌草甲素所致的促凋亡的发生,表明冬凌草甲素可能通过自噬来促进凋亡。同时发现冬凌草甲素作用下erk1/2磷酸化水平减低,加入自噬抑制剂后可以逆转该现象,我们认为冬凌草甲素通过抑制MAKP-erk1/2通路来调控自噬从而促进凋亡,将冬凌草甲素联合erk1/2抑制剂FR180204后,可以协同抑制细胞的增殖并进一步促进凋亡的增加,这些结果为冬凌草甲素的抗癌功效提供了新的见解。

关键词：三阴性乳腺癌冬凌草甲素 erk1/2通路凋亡自噬

环状RNA hsa＿circ＿0007762调控erk1/2通路干预肺纤维化的机制研究

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环状RNA hsa＿circ＿0007762调控ERK1/2通路干预肺纤维化的机制研...

作者：黄彬江苏大学

学位级别：硕士

目的近年的研究揭示环状RNA(circular RNA,circ RNA)参与了特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)发病过程的调节。本实验旨在体外验证circ RNA hsa＿circ＿0007762对Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial typeⅡcells,AEC2s)或成纤维细胞增殖、迁移及凋亡的影响。进而在明确hsa＿circ＿0007762对纤维化表型调控的前提下,进一步研究其对细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,erk)1/2通路及自噬的影响。方法通过生物信息学进行hsa＿circ＿0007762信息及靶基因分析。依靠实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,RT-q PCR)检验转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)处理的人肺泡上皮细胞系A549或肺成纤维细胞系HFL1中hsa＿circ＿0007762和miR-18a-5p的变化。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)明确hsa＿circ＿0007762的亚细胞定位。通过转染小干扰RNA(si-circ＿0007762)或质粒(p LV-circ＿0007762)构建hsa＿circ＿0007762敲减或过表达模型。在敲减和过表达后,分别使用细胞计数试剂-8(cell counting kit-8,CCK-8)、划痕实验和流式细胞术比较A549及HFL1细胞增殖、迁移及凋亡改变。RT-q PCR检验hsa＿circ＿0007762与miR-18a-5p表达间的联系。双荧光素酶报告基因实验评估hsa＿circ＿0007762与miR-18a-5p、miR-18a-5p与丝裂原活性蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)-1(即erk2)的结合作用。采取Western blot法检测对照组(Control)组、TGF-β1组、TGF-β1+si-NC组、TGF-β1+si-circ＿0007762组、TGF-β1+p LV-NC组、TGF-β1+p LV-circ＿0007762组、TGF-β1+si-circ＿0007762+miR-NC组和TGF-β1+si-circ＿0007762+miR-18a-5p inhibitor组纤维化相关蛋白、erk1/2通路蛋白及自噬相关蛋白的表达。结果(1)hsa＿circ＿0007762在A549及HFL1细胞体外模型中显著升高,而miR-18a-5p的表达则降低。FISH显示在A549及HFL1细胞中,hsa＿circ＿0007762在细胞质的分布多于细胞核。(2)在细胞增殖、迁移和凋亡方面,hsa＿circ＿0007762抑制A549细胞的增殖、迁移的同时促进其早期凋亡(P2与miR-18a-5p水平存在相互抑制关系。荧光素酶实验结果显示在hsa＿circ＿0007762野生型载体中,过表达miR-18a-5p减弱了荧光素酶活性(P通过增强α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)的表达,抑制A549细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达,诱导纤维化表型(P2组较TGF-β1+si-NC组,α-SMA、collagenⅠ的表达受抑制,E-cadherin上调(P2组较TGF-β1+p LV-NC组变化则进一步增强纤维化表型(P2+miR-18a-5p inhibitor组较TGF-β1+si-circ＿0007762+miR-NC组,促进α-SMA、collagenⅠ的表达,抑制了E-cadherin表达(P2是通过miR-18a-5p实现对纤维化表型的诱导。(5)Western blot检测erk1/2通路蛋白和自噬相关蛋白显示,在A549和HFL1细胞中,TGF-β1促进

关键词：特发性肺纤维化 hsa＿circ＿0007762 miR-18a-5p erk1/2通路自噬

Piezo1/erk1/2通路参与高血压所致心房纤维化的机制研究

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Piezo1/ERK1/2通路参与高血压所致心房纤维化的机制研究

作者：李巧巧华南理工大学

学位级别：硕士

目的:心房颤动(Atrial fibrillation,AF)是临床上最常见的快速性心律失常之一,可导致心衰、卒中等并发症,使患者致死和致残,给社会家庭带来沉重负担。高血压是AF的独立危险因素,合并高血压者AF发生率显著增加。目前,高血压的控制仍未达... 详细信息

目的:心房颤动(Atrial fibrillation,AF)是临床上最常见的快速性心律失常之一,可导致心衰、卒中等并发症,使患者致死和致残,给社会家庭带来沉重负担。高血压是AF的独立危险因素,合并高血压者AF发生率显著增加。目前,高血压的控制仍未达到理想,且压力负荷诱导AF发生的相关机制仍知之甚少,值得进一步探讨其机制,以寻找更好的治疗策略。心房纤维化是AF的重要病理机制之一。近年鉴定出来的机械压力敏感性离子通道蛋白Piezo1,具有将机械信号转化为生物学信号的生物学特性。有研究报道,Piezo1在机械力刺激下可介导Ca内流,引起erk1/2通路活化。既往研究表明,erk1/2通路与心脏纤维化的发生密切相关,erk1/2信号通路的激活可促进心房成纤维细胞增殖、分化和胶原合成。因此本研究拟探讨Piezo1/erk1/2通路是否参与高血压诱导的心房纤维化,为临床上高血压所致AF的防治提供新靶点。方法:1、利用生物信息学分析方法确立Piezo1、erk2及纤维化因子在AF患者心房组织中的表达情况及其临床意义;2、收集SR(Sinus rhythm,SR)和AF患者心房组织,Masson染色观察两组的心房纤维化程度的不同。利用western blot检测各组患者心房组织中Piezo1、erk1/2,p-erk1/2、PAI-1及胶原分子的蛋白表达;3、使用自制的压力负荷装置,通过给予不同的静水压(20,40mm Hg)负荷干预心房成纤维细胞,在体外模拟高压环境,并分别干预Piezo1和erk1/2,western blot观察不同压力干预对Piezo1、erk1/2、p-erk1/2、PAI-1及纤维化因子的蛋白表达和活性的影响;4、建立高血压动物模型,并予以缬沙坦降压处理,进一步探究Piezo1在高血压所致AF易感性增加中的重要作用。结果:(1)生物信息学分析结果提示,在人组织中,与SR患者相比,AF患者心房组织中Piezo1、erk1/2、PAI-1及纤维化因子(COL1-A1、COL1-A2、COL3-A1)的m RNA水平表达增加;且基因表达水平越高,诊断为AF的风险越大;在收集人心房组织中检测结果发现,与SR患者相比,AF患者心房纤维化更明显,心房组织中Piezo1、p-erk1/2、PAI-1及纤维化因子(COL1-A1、COL3-A1、MMP2/9)的蛋白水平表达更高;(2)在高静水压处理的小鼠心房成纤维细胞中,较高的静水压20和40mm Hg可使Piezo1、erk1/2、p-erk1/2及纤维化因子表达增加,Piezo1、p-erk1/2蛋白的表达尤以20mm Hg组增加明显;给予Piezo1si RNA或通道抑制剂Gs MTx4抑制Piezo1,可抑制p-erk1/2以及纤维化相关蛋白的表达。予以erk1/2抑制剂U0126阻断erk1/2通路,亦能逆转高静水压诱导的纤维化因子表达增加;此外,直接予以Piezo1激动剂Yoda1处理小鼠心房成纤维细胞,可模拟压力负荷诱导p-erk1/2和纤维化因子表达增加,而阻断erk1/2通路能逆转由Yoda1诱导的纤维化因子的表达;(3)在动物模型中,与对照组Wistar大鼠相比,自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rat,SHR)血压明显升高,左室射血分数和左室射血收缩速率明显下降,窦房结功能减退。AF诱发率和持续时间明显增加;缬沙坦干预8周,可使SHR的血压明显降低;且降压药干预后SHR的心脏泵血功能和心室大小得到恢复,AF诱发率与持续时间下降;与Wistar大鼠相比,SHR心房组织纤维化明显,Piezo1、p-erk1/2蛋白表达增加。而降压药干预后心房纤维化得到改善,Piezo1和p-erk1/2蛋白表达减少。结论:机械敏感性离子通道蛋白Piezo1可能通过激活erk1/2信号通路,参与高血压诱导的心房纤维化,进而促进心房结构重构,最终导致AF的发生。

关键词：房颤高血压 Piezo1 erk1/2通路心房纤维化

erk1/2通路对内脏高敏感大鼠肠道树突细胞表面MHC-Ⅱ分子表达的影响

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中华医学杂志 2015年第48期95卷 3930-3934页

作者：李蒙胡玥王霄腾吕宾张梦陈超英浙江中医药大学附属第一医院消化科杭州310006

目的研究肠易激综合征（IBS）肠道树突细胞（DC）表型变化及细胞内丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的变化,初步探讨erk1/2通路在介导DC异常免疫应答中的可能作用机制.方法以母幼分离联合结直肠扩张刺激建立SD大鼠IBS模型（模型组... 详细信息

目的研究肠易激综合征（IBS）肠道树突细胞（DC）表型变化及细胞内丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的变化,初步探讨erk1/2通路在介导DC异常免疫应答中的可能作用机制.方法以母幼分离联合结直肠扩张刺激建立SD大鼠IBS模型（模型组,10只）,10只健康SD大鼠作为对照（对照组,10只）,以腹部收缩反射（AWR）实验评估大鼠内脏敏感性,造模成功后采用磁珠分选技术分离肠系膜淋巴结树突细胞（MLNDC）,流式检测其分选纯度及对照组大鼠表面主要组织相容性复合体Ⅱ（MHC-Ⅱ）类分子的表达,Western印迹法检测对照组及IBS组大鼠MLNDC中MHC-Ⅱ、磷酸化p38丝裂原激活蛋白激酶（p-p38）、p38丝裂原激活蛋白激酶（p38）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-erk1/2）、细胞外调节蛋白激酶（erk1/2）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）的表达情况.结果 IBS组大鼠内脏敏感性显著高于对照组.流式细胞术检测磁珠分选后大鼠DC特异性抗原OX62＋ MLNDC为85.57％±7.67％.对照组大鼠MLNDC表面高表达MHC-Ⅱ类分子;与对照组相比,IBS组大鼠MLNDC表达MHC-Ⅱ类分子升高（1.05±0.13比0.67 ±0.18,t=-2.973,P=0.041）,同时,p-erk的表达水平明显升高（3.21±0.48比2.34±0.85,江-3.130,P=0.035）,而p-JNK及p-p38的表达水平与对照组相比,差异无统计学意义（0.95±0.17比0.76±0.36,t=0.808,P=0.464;1.07±1.13比1.19±0.91,t=0.137,P=0.897）.结论 IBS大鼠肠道DC上调表达MHC-Ⅱ类分子,其可能与细胞内erk1/2信号通路的活化有关.

关键词：肠易激综合征树突细胞主要组织相容性复合物Ⅱ erk1/2通路

表没食子儿茶素-3-没食子酸酯通过erk1/2通路对肝癌HepG2细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭的影响

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肿瘤药学 2023年第1期13卷 50-55页

作者：张金颖陈俊玲新疆维吾尔自治区人民医院中医科新疆乌鲁木齐830000

目的探讨表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)通过erk1/2通路对肝癌HepG2细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭的影响。方法将体外培养的肝癌HepG2细胞分为空白组、EGCG组、EGCG+erk抑制剂组。收集细胞裂解液,CCK-8检测细胞增殖,相差显微镜和Hoech... 详细信息

目的探讨表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)通过erk1/2通路对肝癌HepG2细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭的影响。方法将体外培养的肝癌HepG2细胞分为空白组、EGCG组、EGCG+erk抑制剂组。收集细胞裂解液,CCK-8检测细胞增殖,相差显微镜和Hoechst 33258染色观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-qPCR检测erk mRNA水平,Western blotting分析erk、磷酸化erk、Bax和Bcl-2表达水平,并计算Bax/Bcl-2比值。结果EGCG可以显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭(P2细胞的凋亡(Perk通路抑制剂可显著逆转EGCG对HepG2的作用。结论EGCG可通过erk1/2信号通路发挥对肝癌HepG2细胞的抑制作用。

关键词： HepG2细胞没食子儿茶素-3-没食子酸酯 erk1/2通路

DHA诱导3T3-L1前脂肪细胞G2/M期阻滞及erk1/2通路的作用

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营养学报 2011年第4期33卷 354-357页

作者：徐琛玮沈颖卓龚清海陈士勇张晓宏宁波大学医学院宁波315211

目的探讨erk1/2丝裂素活化蛋白激酶信号转导途径在DHA抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖中的作用。方法四唑盐比色法(MTT法)检测DHA处理24h对体外培养的3T3-L1前脂肪细胞活力的影响,流式细胞术检测细胞周期,蛋白免疫印迹法检测erk1/2、p-erk1/2... 详细信息

目的探讨erk1/2丝裂素活化蛋白激酶信号转导途径在DHA抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖中的作用。方法四唑盐比色法(MTT法)检测DHA处理24h对体外培养的3T3-L1前脂肪细胞活力的影响,流式细胞术检测细胞周期,蛋白免疫印迹法检测erk1/2、p-erk1/2、p21水平。结果 MTT结果显示DHA干预24h可剂量依赖性降低3T3-L1前脂肪细胞的活力,抑制增殖,IC50为100μmol/L;流式细胞术结果表明,DHA可将3T3-L1前脂肪细胞阻滞在G2/M期;蛋白免疫印迹发现,DHA可明显升高3T3-L1前脂肪细胞erk1/2磷酸化水平、增强p21蛋白表达。结论 DHA可能通过活化erk1/2通路诱导G2/M期阻滞,进而抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖。

关键词： DHA 3T3-L1前脂肪细胞 G2/M期阻滞 erk1/2通路

敌百虫经erk1/2通路影响类固醇激素的合成

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毒理学杂志 2010年第2期24卷 104-107页

作者：瞿建华江俊康陈刚南通大学公共卫生学院职业卫生与环境毒理学教研室江苏南通226007

目的初步探讨细胞外信号调节激酶(erk1/2)通路在敌百虫抑制小鼠睾丸间质细胞瘤细胞(MLTC-1)类固醇激素合成中的作用。方法运用放射免疫法检测不同浓度敌百虫及加入erk1/2通路抑制剂UO126后对MLTC-1细胞孕酮合成的影响;采用蛋白质印迹技... 详细信息

目的初步探讨细胞外信号调节激酶(erk1/2)通路在敌百虫抑制小鼠睾丸间质细胞瘤细胞(MLTC-1)类固醇激素合成中的作用。方法运用放射免疫法检测不同浓度敌百虫及加入erk1/2通路抑制剂UO126后对MLTC-1细胞孕酮合成的影响;采用蛋白质印迹技术(Western-blot)检测敌百虫对erk1/2磷酸化表达的影响。结果敌百虫显著抑制MLTC-1细胞孕酮的合成,并且随敌百虫剂量的增加,孕酮合成量呈下降趋势;当同时加入UO126后,随敌百虫染毒剂量的升高孕酮合成量的下降趋势更为明显;敌百虫与UO126一样能明显抑制erk1/2的磷酸化,而对总erk1/2表达无明显影响。结论在本试验条件下,敌百虫能明显抑制MLTC-1细胞的孕酮合成,其机制可能是通过erk1/2通路。

关键词：敌百虫 erk1/2通路类固醇激素合成

erk1/2通路在VEGF促进绵羊卵泡颗粒细胞增殖中的作用

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中国兽医学报 2012年第10期32卷 1532-1535,1559页

作者：曹颖楠刘松财郝林琳姜怀志吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062

选取10只1.5岁成年小尾寒羊母羊,分别取卵泡颗粒细胞并进行培养。设置5个试验组和1个空白对照组,试验组采用不同质量浓度血管内皮生长因子(VEGF)刺激,空白组不添加VEGF。并用MTT检测细胞增殖情况,Western-blotting检测细胞中P-erk1/2表... 详细信息

选取10只1.5岁成年小尾寒羊母羊,分别取卵泡颗粒细胞并进行培养。设置5个试验组和1个空白对照组,试验组采用不同质量浓度血管内皮生长因子(VEGF)刺激,空白组不添加VEGF。并用MTT检测细胞增殖情况,Western-blotting检测细胞中P-erk1/2表达水平。MTT比色结果表明,当VEGF质量浓度为5μg/L时对细胞增殖的促进作用最大,且试验组均高于对照组;Western-blotting结果显示,P-erk1/2表达水平随VEGF的添加而显著增加,并在5μg/L时达到最大值(P10、15、20μg/L质量浓度下其表达量差异不显著(P>0.05)。这说明不同质量浓度VEGF对颗粒细胞增殖的促进作用各不相同,其中以5μg/L的VEGF效果最好。当颗粒细胞培养至48h时,P-erk1/2表达水平较24h时略有提高,并在5μg/L VEGF刺激时达到最大值。VEGF可能是通过促进P-erk1/2的表达进而促进颗粒细胞的增殖。

关键词：血管内皮生长因子 erk1/2通路颗粒细胞

人参皂苷CK通过调控erk1/2通路诱导人肝癌细胞线粒体凋亡作用机制的研究

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时珍国医国药 2021年第5期32卷 1094-1097页

作者：赵嘉琪苏杰琳陈佳欣张学武延边大学医学院吉林延吉133002

目的探讨人参皂苷Compound K(人参皂苷CK)通过调控erk1/2通路诱导人肝癌细胞线粒体凋亡的作用及其机制。方法采用CCK-8、流式细胞术检测不同浓度人参皂苷CK(0,20,40,60,80μmol/L)对人肝癌细胞SMMC-7721增殖及细胞周期的作用;荧光探针... 详细信息

目的探讨人参皂苷Compound K(人参皂苷CK)通过调控erk1/2通路诱导人肝癌细胞线粒体凋亡的作用及其机制。方法采用CCK-8、流式细胞术检测不同浓度人参皂苷CK(0,20,40,60,80μmol/L)对人肝癌细胞SMMC-7721增殖及细胞周期的作用;荧光探针法检测人参皂苷CK对肝癌细胞线粒体膜电位的影响;Western blot实验检测线粒体凋亡蛋白及erk1/2通路相关蛋白的表达。结果人参皂苷CK能够抑制人肝癌细胞增殖,使肝癌细胞线粒体膜电位下降;Western blot结果显示,与对照组比较,线粒体凋亡相关蛋白Cyt-c、Cleaved Caspase-3表达量增加,Bcl-2/Bax下降;与对照组相比,p-erk1/2的表达量降低,加入erk1/2通路抑制剂SCH772984后,p-erk1/2的表达量增加,Bcl-2/Bax下降。结论人参皂苷CK可以通过调控erk1/2通路诱导人肝癌细胞线粒体凋亡。

关键词：人参皂苷CK erk1/2通路线粒体凋亡肝癌