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erk基因在二化螟对Cry1Ca蛋白防御过程中的作用研究

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ERK基因在二化螟对Cry1Ca蛋白防御过程中的作用研究

作者：樊金星华中农业大学

学位级别：硕士

二化螟Chilo suppressalis(Walker)是水稻上重要的农业害虫之一,在全世界范围内均有发生。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)产生的杀虫晶体蛋白具有杀虫活性,可通过生物农药和转Bt基因作物的方式应用到有害生物的防治中,研究... 详细信息

二化螟Chilo suppressalis(Walker)是水稻上重要的农业害虫之一,在全世界范围内均有发生。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)产生的杀虫晶体蛋白具有杀虫活性,可通过生物农药和转Bt基因作物的方式应用到有害生物的防治中,研究靶标害虫对Bt蛋白的防御机制非常有必要。MAPK(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路广泛存在于生物体中,在细胞的生长、发育、分化以及凋亡中都发挥着重要的作用。erk基因在MAPK信号通路中发挥着重要作用。本研究通过RNAi技术研究Cserk在二化螟防御Cry1Ca蛋白过程中的作用,主要研究结果如下:1.利用RT-PCR结合RACE技术克隆二化螟erk基因并获得cDNA序列全长。Cserk1基因序列全长1,892 bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列为1,209 bp,编码403个氨基酸,预测蛋白的分子量为44.51 kDa;Cserk2基因序列全长2,015 bp,ORF序列为1,092 bp,编码364个氨基酸,预测蛋白的分子量为41.96 kDa。结果显示,两个序列的内同源性较低,仅为21.5%。2.利用实时荧光定量PCR技术,分析Cserk基因在二化螟不同龄期及不同组织内的时空表达模式。时间表达模式结果显示,Cserk1基因在蛹和成虫中表达量最高;Cserk2基因在成虫中表达量高于其他龄期;空间表达模式结果显示,两个Cserk基因均在中肠的表达量最高。3.将不同浓度的Cry1Ca蛋白混入饲料饲喂二化螟三龄幼虫,并通过实时荧光定量PCR技术检测二化螟erk基因的表达情况。结果显示,二化螟三龄幼虫在取食20μg/g的Cry1Ca人工饲料30 min后,Cserk1基因表达量迅速上调为对照组的3倍,Cserk2基因表达量无显著变化;取食60μg/g的Cry1Ca人工饲料30 min后,Cserk1基因表达量无显著变化,Cserk2基因表达量显著下调,1 h后出现小幅上调。4.通过饲喂法对二化螟初孵幼虫erk基因进行沉默,48 h后取样检测沉默效率,结果显示Cserk1、Cserk2基因沉默效率分别为46.2%、38.5%。干扰48 h后,将幼虫转至含30μg/g的Cry1Ca蛋白的人工饲料或表达Cry1Ca蛋白的转基因水稻胚芽中饲喂7 d。生测结果显示,两个处理组与对照组相比,幼虫死亡率均无显著差异。说明Cry1Ca蛋白虽然可以引起erk基因表达量的变化,但沉默二化螟erk基因对幼虫死亡率没有影响,这预示着erk基因不参与二化螟对Cry1Ca蛋白的防御机制。

关键词：二化螟 MAPK信号通路 erk基因 Cry1Ca RNA干扰

青蛤(Cyclina sinensis)erk基因的克隆及其在Poly I:C刺激下的表达分析

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安徽农业科学 2019年第1期47卷 99-102页

作者：侯梓园石雅峰姚远潘宝平闫春财天津师范大学生命科学学院天津市动植物重点抗性实验室天津300387

[目的]研究青蛤(Cyclina sinensis) erk基因的克隆及在Poly I:C刺激下的表达情况。[方法]在已建立的青蛤转录组文库中筛选得到青蛤细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases)基因类似序列。运用生物信息学软件在线... 详细信息

[目的]研究青蛤(Cyclina sinensis) erk基因的克隆及在Poly I:C刺激下的表达情况。[方法]在已建立的青蛤转录组文库中筛选得到青蛤细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases)基因类似序列。运用生物信息学软件在线对该基因进行结构分析。采用PCR技术克隆基因,并使用实时荧光定量PCR技术克隆得到Cs erk基因在青蛤5个不同组织中的表达情况及在干扰素诱导剂PolyI:C的刺激下erk基因在青蛤血淋巴中的时序性表达情况。[结果]erk基因序列全长为2 407 bp,开放阅读框长1 338 bp,共编码445个氨基酸。erk基因在青蛤的血淋巴、外套膜、闭壳肌、肝脏和鳃5个组织中均表达,在血淋巴中表达量最高,闭壳肌中表达量最低。青蛤erk基因在Poly I:C胁迫下表达量在6 h时达到最大值,与对照组相比差异极显著(Perk基因所指导合成的蛋白是青蛤重要的免疫信号通路蛋白。

关键词：青蛤 erk基因 PolyI:C 荧光定量PCR

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胃癌高表达基因erk的PCR扩增、克隆和鉴定

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第四军医大学学报 1997年第6期18卷 563-566页

作者：张晓光王方阎小君苏成芝王国华杨敏第四军医大学生化教研室西安710033 第四军医大学全军基因诊断技术应用研究所西安710033

对在胃癌高表达的EPH家族基因erk胞外的配体结合区基因扩增及克隆．方法：从胃癌患者手术切除标本中提取RNA，反转录为cDNA，以计算机辅助分析设计并合成引物进行RT－PCR，并将扩增片段克隆入pUC19质粒，用酶切及PCR方法筛选鉴定阳性克... 详细信息

对在胃癌高表达的EPH家族基因erk胞外的配体结合区基因扩增及克隆．方法：从胃癌患者手术切除标本中提取RNA，反转录为cDNA，以计算机辅助分析设计并合成引物进行RT－PCR，并将扩增片段克隆入pUC19质粒，用酶切及PCR方法筛选鉴定阳性克隆．结果：RT－PCR扩增片段与设计相符，且特异性好，无非特异产物出现，表明所设计引物符合要求．酶切及巢式PCR、PCR－RFLP方法证明克隆片段正确插入pUC19的HindIII和BamHI位点，并将重组克隆命名为pGE42．结论；克隆的完成为进一步研究该基因在胃癌的发生中的作用，寻找其胞外配体及进行表达产物的细胞定位等工作打下基础．

关键词：胃癌基因克隆多聚酶链反应 erk基因鉴定

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细粒棘球蚴细胞外信号调节激酶（Egerk1）基因的克隆、序列分析及功能的初步鉴定

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细粒棘球蚴细胞外信号调节激酶（EgERK1）基因的克隆、序列分析及...

作者：纪静新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:从细粒棘蚴（Echinococcus granulosus,Eg）中克隆细胞外信号调节激酶（Egerk1）基因,进行序列测定,生物信息学分析,构建pET28a-Egerk1原核表达质粒,经诱导、表达并纯化重组rEgerk1,Western Blot检测rEgerk1重组蛋白生物学特性,为... 详细信息

目的:从细粒棘蚴（Echinococcus granulosus,Eg）中克隆细胞外信号调节激酶（Egerk1）基因,进行序列测定,生物信息学分析,构建pET28a-Egerk1原核表达质粒,经诱导、表达并纯化重组rEgerk1,Western Blot检测rEgerk1重组蛋白生物学特性,为进一步研究该基因在寄生虫与宿主相互作用中的功能奠定基础。方法:设计Egerk1基因特异性引物,从新疆株细粒棘球蚴中提取总RNA,RT-PCR法扩增Egerk1基因,构建pMD19-T/Egerk1质粒,测序确定序列并进行生物信息学分析。构建pET28a-Egerk1原核表达质粒,测序鉴定插入序列正确性。IPTG诱导表达rEgerk1-His重组蛋白,Ni-NTA His Bind Resin亲合层析柱纯化,SDS-PAGE法确定蛋白表达情况,Western Blot检测其生物学功能。结果:RT-PCR扩增出一条长度为1100bp的条带,测序结果显示其长度为1125bp,编码374个氨基酸,等电点为6.34,为一新基因,命名为Egerk1（EU701008）。同源性比较表明Egerk1与多房棘球绦虫EmMPK1基因同源性为95.45 %,与线虫、酵母、果蝇和人类等erk基因的同源性为43.04～61.88 %。进化树分析结果发现Egerk1和多房击球绦虫erk基因（EmMPK1）相聚集。功能分析预测Egerk1具有erk类激酶T-X-Y结构保守区和酶激活功能域。成功构建了pET28a-Egerk1原核表达质粒,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测表明rEgerk1-His重组蛋白得到成功表达,在相对分子量47KDa处有表达条带;Western Blot分析显示rEgerk1-His重组蛋白能被特异性抗人erk1/2单克隆抗体识别。结论:首次克隆细粒棘球蚴Egerk1新基因,成功构建高效融合表达基因工程菌株pET28a-Egerk1,成功诱导表达并纯化Egerk1重组蛋白,发现Egerk1重组蛋白具有与erk1/2抗体结合的功能,为进一步研究该基因在寄生虫与宿主相互作用中的功能奠定基础。

关键词：细粒棘球蚴 erk基因基因克隆序列分析功能鉴定

衣被蛋白复合体-亚基β2调控erk/MEK通路在下咽癌中作用的研究

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中国耳鼻咽喉头颈外科 2021年第7期28卷 401-404页

作者：陈学军李祖飞高文黄俊伟钟琦陈晓红黄志刚张洋首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科耳鼻咽喉头颈科学教育部重点实验室(首都医科大学)北京100730

目的分析衣被蛋白复合体-亚基β2(coatomer protein complex subunit β2,COPB2)在下咽癌发生发展中的作用及机制。方法应用TCGA数据库分析COPB2在下咽癌中的表达水平,并在下咽癌细胞系(FaDu)中检测COPB2基因敲减后对细胞增殖的影响,探... 详细信息

目的分析衣被蛋白复合体-亚基β2(coatomer protein complex subunit β2,COPB2)在下咽癌发生发展中的作用及机制。方法应用TCGA数据库分析COPB2在下咽癌中的表达水平,并在下咽癌细胞系(FaDu)中检测COPB2基因敲减后对细胞增殖的影响,探索COPB2在下咽癌细胞增殖中的作用。Western blot分析COPB2基因可能的作用机制及通路。结果通过TCGA数据库数据分析566例组织样本测序信息,相较于癌旁组织,COPB2基因在下咽癌组织中高表达(t=-3.098,P=0.005),并在肿瘤组织样本中得到验证。体外实验显示,COPB2敲减后抑制细胞增殖(敲减组平均表达量为43.400,空白对照组为105.600,P=0.000),过表达后促进细胞增殖(P=0.011)。COPB2的调控可能是通过erk/MEK信号通路发挥作用。结论 COPB2基因在下咽癌的发生发展中起到一定的作用,并对erk/MEK通路产生影响。

关键词：下咽肿瘤细胞系数据库流式细胞术 COPB2基因 erk基因 MEK基因

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