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eno1基因在鼻咽癌发病中的作用研究

ENO1基因在鼻咽癌发病中的作用研究

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作者：程超南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的：鼻咽癌好发于中国南方,特别是广东省,发病率最高因此又被称为“广东瘤”,是一种具有地域性和家族聚集性的高度恶性肿瘤。鼻咽癌的发生是一个多阶段、多途径、多机制的过程。流行病学调查显示,鼻咽癌的发生涉及到遗传倾... 详细信息

研究背景和目的：鼻咽癌好发于中国南方,特别是广东省,发病率最高因此又被称为“广东瘤”,是一种具有地域性和家族聚集性的高度恶性肿瘤。鼻咽癌的发生是一个多阶段、多途径、多机制的过程。流行病学调查显示,鼻咽癌的发生涉及到遗传倾向性和环境致癌因素,很可能是遗传易感性个体,接受了致癌物的作用而发生的。其中包括各种环境因素、EBV感染和遗传及表遗传学的改变导致瘤基因过表达及抑瘤基因表达下调或缺失,经过癌前病变,最终发生鼻咽癌。肿瘤的生成涉及多种基因和基因以外的变化,任何单独一种基因的改变不足以致瘤,多种基因变化的积累才能引起控制细胞生长和分化的机制紊乱,使细胞的生长失控而瘤变。在这些基因的变化中,最常发生两类基因的异常变化,即瘤基因及肿瘤抑制基因。鼻咽癌的生成同样涉及多基因的表达改变。在过去几十年中,虽然我们对于鼻咽癌发生的分子基础认识已经有了很大的提高,但这些认识还是远远不能完全揭示鼻咽癌的发病机理。因此,鼻咽癌相关新基因的发现和研究仍将有助于进一步揭示鼻咽癌的发病机理。enolasel基因的表达随细胞病理生理、代谢、发育状况的不同而改变,其主要编码两种蛋白。多数情况下,a-enolase(即eno1)是烯醇化酶家族中3种同功酶之一,是一个高度保守的胞浆糖酵解酶,既可催化糖酵解过程中2-磷酸-D-甘油酸(PGA)向磷酸-烯醇式丙酮酸(PEP)的转化,又可在糖原合成过程中,催化逆向反应,即作为磷酸丙酮酸水合酶,使PEP向PGA转化,在细胞能量代谢过程中起重要的作用。另一种称为c—myc启动子结合蛋白(MBP—1),不具有酶活性,可表达于细胞核,与核DNA c—myc启动子结合,负向调控c—myc的表达。c-myc基因是一种细胞核内癌基因,它编码的核内转化蛋白p62对正常细胞生长和分化起重要调节作用。c-myc表达活性与细胞生长分裂关系密切,据认为它是诱导增殖和凋亡双重作用的基因。正常情况下C-myc基因不显示转录活性或低水平表达。c-myc基因被激活后可致其产物p62过度表达而堆积在细胞内,使细胞获得永生。近年来多项研究表明c-myc基因在肿瘤的发生发展中起重要作用,其在肿瘤组织中的表达率与患者的生存期呈显著相关。这也提示eno1除了作为糖酵解反应的限速酶外,还参与细胞的其他生物学活动。在早期对eno1研究中发现,eno1能够抑制肿瘤细胞的生长。但有趣的是,与前述eno1抑制肿瘤细胞增生的作用截然不同,近年来越来越多的研究表明,eno1在肿瘤发生及发展中所发挥的作用并非如早年研究所指出的,是一个具有潜在抑癌能力的基因。与之相反,近年来的研究结果不断表明,eno1很可能是一个在肿瘤生发发展和转移等多个环节过程中均发挥作用的重要癌基因。目前提出eno1可能具有癌基因功能的多项研究主要集中在肝癌、非小细胞肺癌、甲状腺嗜酸细胞瘤以及黑色素细胞瘤等肿瘤上。通过蛋白质组学,western blot和免疫组化等技术发现,eno1在这些肿瘤的细胞系、活体组织中有较高水平表达。并且,多篇文献指出,在多种肿瘤患者的外周血中,检测出的eno1自身抗体的水平与该类肿瘤的分化、分期及预后显示出明显的正相关关系。在对eno1促进肿瘤细胞生长机制的探讨中,大多数认为eno1在肿瘤细胞生长过程中的能量代谢过程中起到积极作用,尤其是大多数肿瘤在高代谢情况下,其生长对于糖酵解作用获能的依赖成为目前研究的重点。在增殖较快的肿瘤细胞中,eno1有相对高水平的表达;而在非增殖的角质化细胞中,eno1的合成明显减少。由于糖酵解过程的变化与细胞增殖有关,故推测,在肿瘤细胞增殖过程中,eno1的表达可以通过影响糖酵解,三羧酸循环,以及随后的氧化磷酸化酶作用物的水平,进而影响ATP的合成,这对肿瘤细胞的生长十分重要。但目前有关eno1在鼻咽癌中的作用的研究还未见报道。在本研究所方唯意等研究中,利用基因芯片技术对8组NPC病人标本及对照,两组细胞株进行了基因筛选,结果显示,在病理标本及细胞株中,eno1的表达均显著提高。因此,本课题旨在研究eno1在鼻咽癌细胞及组织中的表达特性,并进一步通过改变eno1表达水平来观察其对鼻咽癌细胞生物学特性的影响。为进一步明确鼻咽癌的发病机制奠定良好的基础。方法：1.鼻咽癌中eno1表达特性的鉴定及临床意义。利用免疫组化检测120例鼻咽癌与40例正常鼻咽中eno1基因的表达情况。***1表达沉默对鼻咽癌细胞HONE1生物学特性的影响。荧光定量PCR检测鼻咽癌细胞系(6个细胞系,5-8F,6-10B,SUNE1,CNE2,CNE1,HONE1)中eno1的表达情况,筛选高表达eno1的细胞株。设计并体外化学合成针对eno1基因的小干扰RNA序列,以脂质体(lipofectam

关键词：鼻咽癌 eno1 增殖侵袭转移

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eno1通过AMPK/mTOR信号通路促进结肠癌的发生和转移

ENO1通过AMPK/mTOR信号通路促进结肠癌的发生和转移

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作者：赵世虎山东大学

学位级别：硕士

研究背景结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,发病率位列世界第三。近年来,随着社会人口老龄化的加剧,结肠癌的发病率呈现逐年增加的趋势。远处转移尤其是肝转移是导致结肠癌患者死亡的重要原因。导致结肠癌发生发展的因素很多,包括基因突变... 详细信息

研究背景结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,发病率位列世界第三。近年来,随着社会人口老龄化的加剧,结肠癌的发病率呈现逐年增加的趋势。远处转移尤其是肝转移是导致结肠癌患者死亡的重要原因。导致结肠癌发生发展的因素很多,包括基因突变、遗传因素、肥胖和饮食习惯等。结肠癌的治疗方法目前仍以手术、辅助化疗和放疗等为主,但是这些治疗方法对中晚期结肠癌患者均没有很好的疗效。为了提高结肠癌患者的生存和生活质量、寻找有效的治疗靶点,因此,进一步研究结肠癌的发病机制具有非常重要的意义。烯醇化酶1 (Alpha-enolase, eno1)是糖酵解过程中催化可逆反应2-磷酸甘油酸脱水形成烯醇式丙酮酸的关键酶。除此之外,eno1还参与体内很多其他重要的生理过程,如低氧耐受、炎症反应和免疫调节等。目前研究表明,eno1与肿瘤关系密切。eno1在胰腺癌、肺癌、胆管癌、头颈癌等多种肿瘤中表达异常,且其表达水平与肿瘤的不良预后密切相关。eno1还可以作为肺癌、乳腺癌和胃癌等早期诊断的生物标志物,在肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化中发挥非常重要的作用。但是eno1在结肠癌中的作用研究很少,其作用及其作用机制还有待进一步研究。本研究首先在结肠癌组织及癌旁组织标本中确定eno1表达的差异性,然后在细胞水平确定eno1对结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭及成瘤、转移能力等的影响。最后在分子水平上发现eno1可以通过调控AMPK/mTOR信号通路发挥对结肠癌发生发展的调控作用。我们的研究结果可能为结肠癌的治疗提供新的靶点和理论基础。研究目的探究eno1在结肠癌发生和转移中的作用,并通过eno1所影响的信号通路进一步阐明eno1的作用机理。研究方法1.在临床结肠癌组织标本及癌旁组织标本中检测eno1的表达变化1)提取临床结肠癌及癌旁组织标本中的RNA和蛋白质,qRT-PCR和Western blot检测上述组织中eno1 mRNA和蛋白质的表达。2)免疫组化方法检测上述组织中eno1的表达。2.探究eno1对结肠癌细胞增殖和迁移的影响1)采用逆转录病毒感染和慢病毒感染的方法分别建立eno1高表达细胞系(HCT116-eno1)、沉默细胞系(HCT116-sheno1-1和HCT116-sheno1-2)及它们相应的对照组细胞系,Western blot检测eno1基因的蛋白质表达。2)通过MTT、流式细胞术、克隆形成、soft agar、细胞划痕、Transwell、 Matrigel等方法分别检测过表达和干扰eno1对细胞周期、增殖、迁移和侵袭能力的影响。3)通过裸鼠皮下种植、尾静脉注射方式建立异种移植瘤和肿瘤远处转移模型,检测过表达和干扰eno1对细胞成瘤能力及转移能力的影响。3.探究eno1影响结肠癌发生和转移的作用机理1)应用ATP检测试剂盒,分别检测eno1过表达和沉默细胞系中的ATP水平。2)应用Western blot检测eno1不同表达状态下AMPKa/p-AMPKa、 ACC2/p-ACC2、mTOR/p-mTOR、s6rp/p-s6rp蛋白水平的变化,确定eno1对AMPK/mTOR信号通路的影响。3)分别应用AMPK通路激活剂AICAR和mTOR通路抑制剂Rapamycin处理eno1高表达及对照组细胞系,应用MTT、Transwell、Matrigel等检测细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变,确定AMPK/mTOR信号通路介导eno1的功能。4)在裸鼠异种移植瘤模型中分别给药AICAR和Rapamycin,观察成瘤能力的改变,在体内确定eno1通过AMPK/mTOR信号通路发挥作用。研究结果1.与癌旁组织相比,eno1在结肠癌组织中表达明显升高1)qRT-PCR和Western blot结果显示：结肠癌组织中eno1 mRNA和蛋白质的水平明显高于癌旁组织。2)免疫组化结果显示：癌组织比癌旁组织中的eno1蛋白质表达水平显著增高。***1促进结肠癌细胞系HCT116细胞的恶性转化1)过表达eno1促进HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭能力;而沉默eno1基因表达后显著抑制HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭能力。2)裸鼠异种移植瘤和转移模型实验显示：过表达eno1基因显著增强HCT116细胞系的成瘤及转移能力,而干扰eno1基因表达HCT116细胞的成瘤能力显著减弱。***1通过调控AMPK/mTOR信号通路发挥在结肠癌中的作用1)过表达eno1促进HCT116细胞内ATP合成,而干扰eno1抑制HCT116细胞内的ATP合成。2)过表达eno1抑制AMPKa磷酸化,进而激活mTOR信号通路从而促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭;而AMPK激活剂AICAR和mTOR信号通路抑制剂Rapamycin可以逆转过表达eno1所引起的细胞效应。3)裸鼠成瘤实验表明

关键词： eno1 AMPK mTOR 结肠癌肿瘤发生

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烯醇化酶eno1影响非小细胞肺癌细胞EMT的研究

烯醇化酶ENO1影响非小细胞肺癌细胞EMT的研究

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作者：周鑫北京协和医学院

学位级别：硕士

上皮间质转换(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)发生侵袭和转移的一个重要环节,受到众多信号通路的精细调节。细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase, ERK)信号通路是转化生长因子(transforming growth factor β, TGFβ)诱导EMT发生的关键通路。本实验室曾利用新型蛋白质组研究体系建立非小细胞肺癌相关分泌/释放蛋白数据库,其中包含了eno1在内的糖酵解途径关键酶;并在非小细胞肺癌患者外周血中检测出EN01。已有研究报道糖酵解途径相关酶在肿瘤侵袭和转移中具有重要作用。本研究以非小细胞肺癌细胞系A549和H520为研究对象,对烯醇化酶(enolase-1,eno1)影响细胞体外EMT过程的分子机制进行了初步研究。在20.6%(20/97)的非小细胞肺癌患者石蜡包埋肿瘤组织切片中,我们发现eno1在癌巢中心集中表达。为了研究eno1过表达对EMT的影响,我们建立了稳定过表达eno1的A549细胞和H520细胞。划痕实验和Transwell细胞迁移实验检测到eno1过表达削弱细胞运动能力。同对照组相比,过表达eno1使细胞中上皮样细胞标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)水平升高,而间质样细胞标志物N-钙粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)水平降低。TGFβ-1体外诱导细胞EMT实验发现eno1过表达细胞对TGFβ-1诱导敏感程度下降。U0126抑制细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase,ERK)通路引起细胞对TGFβ-1体外诱导EMT效果减弱,表示ERK通路的激活是TGFβ-1诱导EMT的重要因素。此外,我们发现eno1过表达导致细胞中ERK磷酸化水平下降。通过上皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)刺激实验,我们发现eno1过表达细胞中ERK信号通路活化能力受到阻碍。因此,在非小细胞肺癌细胞中,eno1具有抑制细胞EMT的作用,且很可能是通过抑制MAPK通路来实现的。

关键词：非小细胞肺癌 eno1 EMT TGFβ ERK

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FBXW7新的靶蛋白eno1的鉴定及功能研究

FBXW7新的靶蛋白ENO1的鉴定及功能研究

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作者：詹盼盼山东大学

学位级别：硕士

研究背景FBXW7也称 FBW7,是F-box蛋白家族成员,为SCF(Skp-Cullin-F-box)泛素连接酶体系的靶蛋白识别组分。人FBXW7基因定位于4号染色体(4q31.3),其表达产物FBXW7的F-box基序和SKP1直接结合,形成SCFFBXw7复合体,并通过其WD40结构域识别... 详细信息

研究背景FBXW7也称 FBW7,是F-box蛋白家族成员,为SCF(Skp-Cullin-F-box)泛素连接酶体系的靶蛋白识别组分。人FBXW7基因定位于4号染色体(4q31.3),其表达产物FBXW7的F-box基序和SKP1直接结合,形成SCFFBXw7复合体,并通过其WD40结构域识别特异性底物,介导靶底物的泛素化降解。FBXW7可靶向降解多种癌蛋白,如Cyclin E、 c-Myc、mTOR、Notch1、HIF-1α等,在细胞周期进程、细胞生长、分化、细胞凋亡、肿瘤转移、肿瘤抗药性等多个方面发挥重要调控作用。FBXW7是公认的肿瘤抑制基因,在多种肿瘤中包括肺癌、胃癌、前列腺癌等存在功能性突变、缺失或表达降低。目前,FBXW7抑制肿瘤的机制尚不完全清楚,而其通过调控特定靶蛋白的含量参与肿瘤抑制作用是最常见的机制。迄今为止,已经鉴定的FBXW7底物比较局限,而FBXW7作用的靶底物不同,其抑癌机制也不同。因此,发现、鉴定FBXW7未知的靶底物,研究其与靶底物的作用方式,对进一步明确FBXW7的抑癌机制有非常重要的意义,同时也为阐明FBXW7与其他肿瘤相关基因的调控及其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。烯醇酶1(enolase1, eno1)是糖酵解过程中催化2-磷酸甘油酸形成磷酸烯醇丙酮酸的代谢关键酶,最终促进乳酸及ATP的生成。多项研究表明,除了参与糖酵解过程外,eno1是体内重要的多功能蛋白,参与细胞生长调控、缺氧耐受、自身免疫调节等多种生理过程。现有的研究报道eno1在鼻咽癌、神经胶质瘤等多种肿瘤中表达增高,且其表达水平的高低和肿瘤的发展及不良预后有关;在细胞中过表达eno1能够促进细胞增殖,侵袭和转移,表明eno1可能作为一个癌蛋白促进肿瘤的发生发展。然而,目前对于eno1的具体表达调控机制尚不清楚。我们在前期研究中以筛选鉴定FBXW7的靶蛋白为研究目标,利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)与质谱技术(MS)分离鉴定FBXW7基因敲除大肠癌细胞系HCT116 FBXW7-/-和FBXW7野生型HCI116 FBXW7+/+中差异表达的蛋白质,结果发现体外敲除大肠癌细胞FBXW7的表达可明显上调eno1的表达,提示eno1可能是FBXW7新的靶底物。本研究进一步从体外细胞实验和人结直肠癌组织标本两个层面深入探讨了FBXW7对eno1的调控作用及调控机理,该研究的完成发现和确认了新的FBXW7靶蛋白,揭示了FBXW7参与肿瘤发生发展过程的新机制,为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路和靶点。研究目的探讨FBXW7对eno1表达的调控作用及作用机理,并进一步阐明FBXW7通过调控eno1影响肿瘤的发生和发展。研究方法1.在多个细胞系及临床组织标本中确定FBXW7对eno1的调控作用1)在FBXW7野生型结肠癌细胞HCT116 FBXW7+/+和DLD-1 FBXW7+/+及利用同源重组技术建立的FBXW7基因敲除的HCT116 FBXW7-/-和DLD-1 FBXW7-/-细胞中,应用qRT-PCR和Western blotting检测eno1的表达。2)在前列腺癌细胞系PC3、Du145和乳腺癌细胞系MDA-MB-468中,通过RNA干扰技术建立FBXW7沉默表达的稳定细胞系,应用qRT-PCR和Western blotting检测eno1的表达。3)在HCT116 FBXW7-/-和HEK293细胞中转染FBXW7真核表达载体,Western blotting检测eno1的表达。4)收集50例结直肠癌及癌旁组织,免疫组织化学方法检测FBXW7和eno1的表达,分析两者的相关性。2.进一步实验确定FBXW7调控eno1蛋白水平的机理1)运用蛋白质免疫共沉淀技术检测FBXW7和eno1之间的相互作用。2)在HCYU6 FBXW7+/+和FBXW7-/-细胞中,应用放线菌酮示踪实验检测FBXW7对eno1半衰期的影响。3) 应用蛋白酶体抑制剂MG132处理HCT116 FBXW7+/+和FBXW7-/-细胞,Western blotting检测eno1水平的改变。4) 应用GSK3β特异的抑制剂GSK3β inhibitor Ⅷ处理HCT116 FBXW7+/+和FBXW7-/-细胞,Western blotting检测eno1水平的改变。5) 运用蛋白质免疫共沉淀技术检测FBXW7表达变化对eno1的泛素化水平的影响。3.检测FBXW7调节eno1的功能进而影响细胞的增殖和迁移1) 应用eno1特异的干扰RNA沉默FBXW7和FBXW-/-细胞中eno1的表达,qRT-PCR检测各组细胞中CCL20 mRNA的表达。2) 应用eno1特异的干扰RNA沉默HCT116 FBXW7+/+和FBXW-/-细胞中eno1的表达,A

关键词： FBXW7 eno1 抑癌基因癌蛋白肿瘤发生

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去乙酰化酶SirT3与烯醇化酶eno1关系及功能研究

去乙酰化酶SirT3与烯醇化酶ENO1关系及功能研究

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作者：郭睿华东师范大学

学位级别：硕士

eno1是烯醇化酶,在糖酵解的过程中起重要作用,负责催化2-磷酸甘油酸形成高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸。早期研究表明eno1是肿瘤抑制因子,近几年,研究表明eno1可能参与癌症的发生发展和转移等多个环节,eno1基因是重要的原癌基因。eno1在... 详细信息

eno1是烯醇化酶,在糖酵解的过程中起重要作用,负责催化2-磷酸甘油酸形成高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸。早期研究表明eno1是肿瘤抑制因子,近几年,研究表明eno1可能参与癌症的发生发展和转移等多个环节,eno1基因是重要的原癌基因。eno1在癌症患者外周血和肿瘤细胞系中表达水平很高,具有潜在肿瘤诊断价值。SirT3为去乙酰化酶,主要分为FLSirT3和ShortSirT3。近几年SirT3因其对各种非组蛋白去乙酰化作用受到越来越多关注。目前,已发现位于线粒体中的Short SirT3,对很多新陈代谢相关酶进行去乙酰化修饰,但细胞质中FLSirT3的底物和功能已知较少。本文首次发现细胞质中FL SirT3与eno1相互结合,通过免疫共沉淀和体外结合实验,证实FL SirT3与eno1无论在体内还是体外都直接结合。然后本文发现FL SirT3主要结合在eno1 376-434氨基酸区域内,并对eno1进行去乙酰化修饰。最后本文发现FLSirT3可能通过对eno1去乙酰化修饰,调控eno1的分泌,对eno1的分泌有促进作用。已发现eno1在很多肿瘤患者血液中高表达,提示eno1可作为肿瘤标记物,具有潜在医学诊断价值。本文的发现为eno1作为肿瘤标记物的研究提供了一些理论依据,也为FL SirT3的功能研究提供了新思路。

关键词： eno1 相互作用 SirT3 去乙酰化蛋白质分泌

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肺癌细胞中B7-H3与eno1的相互作用方式及下游信号通路研究

肺癌细胞中B7-H3与ENO1的相互作用方式及下游信号通路研究

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作者：丁聪聪中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

B7-H3分子属免疫球蛋白超家族成员,是2001年由Chapoval等人进行B7分子同源基因分析时发现的免疫分子。作为B7家族中的一员,不同于PD1/PDL1这些已知受体的分子,由于B7-H3的确切受体至今仍未完全明确,其具体作用及机制(共刺激或共抑制)尚... 详细信息

B7-H3分子属免疫球蛋白超家族成员,是2001年由Chapoval等人进行B7分子同源基因分析时发现的免疫分子。作为B7家族中的一员,不同于PD1/PDL1这些已知受体的分子,由于B7-H3的确切受体至今仍未完全明确,其具体作用及机制(共刺激或共抑制)尚存争议。发现之初,有学者认为B7-H3主要通过促进T细胞的增殖和上调IFN-γ(γ干扰素)表达水平发挥免疫激活作用。但随着对B7-H3的进一步研究,发现其在多种恶性肿瘤细胞中高表达,大量研究均表明B7-H3与肿瘤增殖、转移、侵袭等恶性表型及肿瘤免疫逃逸关系密切。值得关注的是,近年来多篇研究报道B7-H3与肿瘤细胞的能量代谢异常关系紧密。eno1(烯醇化酶1)属烯醇化酶家族,是糖酵解途径中一种重要的限速酶,可催化2-D-磷酸甘油酸形成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP),并产生ATP。作为糖酵解过程中的重要分子,eno1在肿瘤异常代谢中发挥至关重要的作用。而能量代谢异常是恶性肿瘤的重要特征之一。查阅相关文献发现,在多数肿瘤中,eno1表达水平都较高,且有实验证实eno1的过表达与细胞的异常代谢和恶性增殖密切相关,同时eno1与肿瘤的临床诊断、预后、复发均有相关性,可作为肿瘤相关标志物。实验室前期通过免疫共沉淀实验、质谱测序证实了B7-H3与糖酵解酶eno1之间存在直接作用关系。二者之间如何作用,作用机制为何,正是本实验所要探究的。目的:本研究通过制备B7-H3过表达载体、eno1过表达载体,构建B7-H3过表达的肺癌细胞、eno1过表达的肺癌细胞;利用细胞增殖实验、划痕实验探究过表达B7-H3、过表达eno1对肺癌细胞增殖、迁移能力的影响,利用流式细胞术探究过表达B7-H3、过表达eno1对细胞凋亡、细胞周期的影响;利用RT-PCR、Western-blot实验分析B7-H3与eno1的表达相关性,利用eno1活性检测试剂盒分析过表达B7-H3对eno1活性的影响;用eno1活性抑制剂处理B7-H3过表达的细胞,利用细胞增殖实验、划痕实验探究eno1活性改变对B7-H3过表达促瘤作用的影响;利用Western-blot实验探究过表达B7-H3引起下游信号通路分子蛋白表达的变化以及抑制eno1活性对其影响作用。方法:第一部分:构建B7-H3过表达细胞模型和eno1过表达细胞模型(1)设计eno1基因扩增引物,通过PCR扩增合成,连接到pc DNA3.1载体,构建eno1过表达载体pc DNA3.1/eno1,同时利用空白载体pc DNA3.1作为阴性对照;B7-H3过表达载体pc DNA3.1/B7-H3为实验室保存;(2)利用lip2000将pc DNA3.1/B7-H3载体转染至sbc-5细胞,构建B7-H3过表达细胞模型;将pc DNA3.1/eno1载体转染至PC14细胞,构建eno1过表达细胞模型。用RT-PCR和Western-blot实验鉴定B7-H3、eno1过表达效果。第二部分:B7-H3/eno1对肺癌细胞表型的作用研究(1)取B7-H3过表达细胞、eno1过表达细胞及相应对照细胞铺96孔板,做CCK-8细胞增殖实验,记录吸光度值OD450nm(0h、24h、48h、72h、96h),绘制生长曲线,评估各组细胞增殖能力;(2)取B7-H3过表达细胞、eno1过表达细胞及相应对照细胞铺6孔板,进行划痕实验,记录细胞划痕距离(0h和48h),计算细胞相对迁移率[(0h划痕距离-48h划痕距离)/0h划痕距离×100%],比较各组细胞迁移能力;(3)取B7-H3过表达细胞、eno1过表达细胞及相应对照细胞,用流式细胞术检测细胞周期、凋亡,计算细胞周期分布比例以及细胞凋亡率,并进行比较。第三部分:B7-H3与eno1相互作用的探究(1)对第一部分构建的B7-H3过表达细胞,eno1过表达细胞以及相应对照细胞,提取各组细胞的RNA及蛋白,通过RT-PCR以及Western-blot实验检测B7-H3、eno1的m RNA、蛋白表达水平,分析B7-H3与eno1的表达相关性;(2)利用eno1活性检测试剂盒,检测B7-H3过表达细胞及相应对照细胞中eno1酶活性,分析过表达B7-H3对eno1活性的影响;(3)用eno1活性抑制剂处理B7-H3过表达的细胞,利用CCK-8细胞增殖实验、划痕迁移实验探究抑制eno1活性对B7-H3过表达促瘤作用的影响。第四部分:B7-H3作用机制的初步研究(1)提取B7-H3过表达细胞及野生型对照细胞的蛋白,检测下游信号通路分子(PI3K-p85α、PTEN、Akt、m TOR、GSK3β)以及这些分子磷酸化水平的蛋白表达情况;(2)利用eno1活性抑制剂处理B7-H3过表达的细胞,检测上述信号通路分子蛋白表达情况。结果:(1)利用lip2000将p

关键词： B7-H3 eno1 促瘤作用肺癌

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高糖环境通过调控eno1表达在胃癌细胞上皮-间质转化中的作用研究

高糖环境通过调控ENO1表达在胃癌细胞上皮-间质转化中的作用研究

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作者：徐信安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:越来越多的研究表明,高糖血症与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。但其在胃癌中的具体机制仍不清楚。本研究旨在探讨高糖环境对胃癌细胞上皮-间质转化（EMT）的影响以及潜在的作用机制。方法:使用来自GEO和TCGA数据库的表达数据检... 详细信息

目的:越来越多的研究表明,高糖血症与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。但其在胃癌中的具体机制仍不清楚。本研究旨在探讨高糖环境对胃癌细胞上皮-间质转化（EMT）的影响以及潜在的作用机制。方法:使用来自GEO和TCGA数据库的表达数据检测糖酵解相关酶和EMT相关转录因子的表达情况。利用小分子干扰RNA（si RNA）转染下调胃癌细胞eno1的表达。免疫组织化学,蛋白质印迹和荧光定量PCR分析用于检测目的基因蛋白质或m RNA水平的表达情况。使用CCK-8,划痕实验以及Transwell实验评估胃癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力。结果:高浓度葡萄糖能够增强胃癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力。在糖酵解酶相关基因中,eno1在胃癌组织中表达上调最明显,且与患者不良预后有关。eno1的表达也随着葡萄糖浓度的增加而上调。此外,下调eno1表达可以部分逆转高糖对胃癌恶性表型的影响。Snail介导的EMT可以被高糖血症所促进,并受到下调eno1表达的抑制。TGF-β/Smad信号通路参与了以上过程的调控。结论:高糖血症诱导的eno1过表达通过TGF-β/Smad信号通路促进胃癌细胞的EMT进程。

关键词：高糖血症上皮-间质转化 eno1 胃癌

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重组eno1单克隆抗体可变区基因的腺相关病毒对宫颈癌细胞的作用研究

重组ENO1单克隆抗体可变区基因的腺相关病毒对宫颈癌细胞的作用研...

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作者：杨小娟甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的本实验拟制备重组eno1单克隆抗体可变区基因的腺相关病毒(rAAV-eno1mAb-5),介导重组eno1单抗可变区基因靶向进入细胞质,体外研究rAAV-eno1mAb-5对宫颈癌Hela细胞糖酵解的影响,及其对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用。方法1.在实验室... 详细信息

目的本实验拟制备重组eno1单克隆抗体可变区基因的腺相关病毒(rAAV-eno1mAb-5),介导重组eno1单抗可变区基因靶向进入细胞质,体外研究rAAV-eno1mAb-5对宫颈癌Hela细胞糖酵解的影响,及其对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用。方法1.在实验室前期基础上,选择eno1单抗H5的可变区序列,中间用Linker--(GGGGS)连接,Xba I和Hind III为酶切位点,将其克隆在pAAV2-MCS载体上,得到重组质粒AAV-eno1 mAb-5,将重组质粒AAV-eno1 mAb-5和辅助质粒(p Helper、pAAV-RC)共转染到AAV293细胞中,得到rAAV-eno1mAb-5。同时将带有绿色荧光蛋白的pAAV-IRES-Zs Green5转入AAV293细胞中,作为空载体对照(rAAV-GFP)。2.采用Na Cl-PEG8000和冰乙醇沉淀法进行粗纯化和浓缩,并用TCID50法测定二者的滴度。3.通过糖酵解试剂盒测定rAAV-eno1mAb-5对Hela细胞糖酵解产物(丙酮酸和乳酸)的抑制作用。4.通过MTT实验、划痕实验体外检测rAAV-eno1mAb-5对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用。结果1.成功制备rAAV-eno1mAb-5和rAAV-GFP,转染效率为90%,二者滴度均为2.0×10PFU/ml。***-eno1mAb-5对Hela细胞糖酵解产物(丙酮酸和乳酸)的生成有明显抑制作用(P1)。3.当rAAV-eno1mAb-5的MOI值达到80时,Hela细胞增殖率为(48.38±3.94)%,与rAAV-GFP组和PBS组相比有显著统计学差异(P1)。4.划痕实验中,rAAV-eno1mAb-5对Hela细胞有显著的迁移抑制作用,与rAAV-GFP组和PBS组相比具有明显统计学差异(P1)。结论***-eno1mAb-5高效、靶向负载eno1单克隆抗体可变区基因进入细胞质;***-eno1mAb-5能够明显抑制宫颈癌Hela细胞乳酸和丙酮酸生成;***-eno1mAb-5可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移。

关键词：宫颈癌 eno1 糖酵解单克隆抗体重组腺相关病毒

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多功能介孔二氧化硅负载eno1单克隆抗体对宫颈癌的治疗作用研究

多功能介孔二氧化硅负载ENO1单克隆抗体对宫颈癌的治疗作用研究

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作者：火夏琴甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的本课题拟制备eno1单克隆抗体(eno1 mAb),通过多功能介孔二氧化硅纳米颗粒(DMSN)介导eno1 mAb进入细胞质,体外研究eno1 mAb对宫颈癌细胞增殖和迁移的抑制作用,为宫颈癌靶向代谢治疗提供实验室依据。方法1.利用体内诱生法制备eno1 mAb... 详细信息

目的本课题拟制备eno1单克隆抗体(eno1 mAb),通过多功能介孔二氧化硅纳米颗粒(DMSN)介导eno1 mAb进入细胞质,体外研究eno1 mAb对宫颈癌细胞增殖和迁移的抑制作用,为宫颈癌靶向代谢治疗提供实验室依据。方法1.利用体内诱生法制备eno1 mAb,并用辛酸-硫酸铵法及Protein A层析柱纯化;2.应用油水两相分层法制备树枝状介孔二氧化硅纳米(DMSN)载体,使其负载eno1 mAb,并通过二硫键连接透明质酸(HA);应用扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、动态光散射(DLS)、Zeta电位、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)等进行纳米颗粒的表征;3.利用MTT法检测eno1 mAb对宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用,用细胞划痕实验检测eno1 mAb对宫颈癌细胞的迁移抑制作用。结果1.成功制备eno1 mAb,并优化纯化条件,最终使用p H 7.4,0.02M PB+0.15M Na Cl的结合缓冲液,p H 3.0,0.1M柠檬酸钠为洗脱液,获得高纯度eno1 mAb;2.成功制备树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒,通过各种表征发现其粒径约100nm,孔径约10nm,均符合实验需求;通过Zeta电位及FT-IR等验证,发现透明质酸成功修饰于树枝状介孔二氧化硅表面,且具有良好的生物相容性;3.当DMSN@eno1 mAb及DMSN-SSHA@eno1 mAb浓度达到200μg/ml时,Hela细胞相对增殖率分别为53.13±1.547%、44.92±0.678%,与对照组相比均有显著统计学差异;当eno1 mAb与Hela细胞共孵育12h时,游离eno1 mAb、DMSN-SS-HA@eno1 mAb组Hela细胞迁移率分别为:9.765±1.02%、12.40±0.71%,与对照组(19.67±1.71%)相比均有统计学差异,而DMSN@eno1 mAb组细胞迁移率为18.14±1.85%,与对照组相比无统计学差异。结论1.成功制备并纯化eno1 mAb;2.成功制备DMSN,并对其进行透明质酸修饰,可高效负载eno1 mAb;3.多功能介孔二氧化硅负载eno1 mAb可抑制宫颈癌细胞增殖和迁移。

关键词：单克隆抗体 eno1 宫颈癌介孔二氧化硅

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卵巢高低级别浆液性腺癌中FBXW7和eno1的表达和意义

卵巢高低级别浆液性腺癌中FBXW7和ENO1的表达和意义

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作者：沈爱红河北医科大学

学位级别：硕士

背景:卵巢上皮性癌(Ovarian cancer)是一种恶性肿瘤,由于早期无明显症状及筛查手段,大多数患者确诊时已经是晚期。在2008年,全世界约有卵巢癌患者222,500名,其中有140,200名死于这种疾病。卵巢上皮性恶性肿瘤中最多见的是卵巢浆液性癌,... 详细信息

背景:卵巢上皮性癌(Ovarian cancer)是一种恶性肿瘤,由于早期无明显症状及筛查手段,大多数患者确诊时已经是晚期。在2008年,全世界约有卵巢癌患者222,500名,其中有140,200名死于这种疾病。卵巢上皮性恶性肿瘤中最多见的是卵巢浆液性癌,其发病学说——二元论模型,将卵巢浆液性腺癌分为两型。Ⅰ型卵巢癌也就是说低级别卵巢癌,具有较低的恶性,临床上发展缓慢,其发展过程主要是良性的上皮肿瘤演变成卵巢浆液性腺癌,Ⅱ型(高级别)卵巢癌恶性度高,多数来源于输卵管上皮。因此研究卵巢癌的发病机制,找到特异性指标对早期诊断和治疗卵巢癌是至关重要的。FBXW7即F框/WD-40域蛋白7也称为FBW7,是F-box蛋白家族成员。FBXW7作为抑癌基因,其抑癌作用是特异性识别底物并对其进行降解,在多种肿瘤组织中总的突变率是低的。FBXW7在宫颈癌组织中表达比宫颈正常组织中低,并且发现在子宫内膜癌中也存在较低的突变率。在卵巢癌中的作用研究较少。eno1即烯醇酶1(enolase 1),作为糖酵解途经的关键酶和多功能蛋白,促进多种消化系统肿瘤的转移增殖,且促进子宫内膜癌的转移增殖等,但是在卵巢癌中作用尚不清楚。目的:研究FBXW7和eno1在卵巢浆液性腺癌和正常输卵管组织、卵巢组织中的表达情况,以及二者在卵巢浆液性腺癌发展中的作用,分析二者的表达与卵巢癌的病理分期、细胞分级等的预后关系,并分析二者的相关性。方法:收集2006年1月至2011年5月冀中能源峰峰集团总医院妇产科卵巢浆液性腺癌标本60例,术前未给予任何治疗,其中包括20例高级别腺癌,40例低级别腺癌,所有病例诊断均由病理证实。取15例正常输卵管组织和15例正常卵巢组织分别作为高级别腺癌组和低级别腺癌组的对照组,采用免疫组化方法检测不同级别卵巢浆液性腺癌中的FBXW7和eno1的表达情况,并对其中18例高级别腺癌,37例低级别腺癌进行随访分析,来比较不同级别卵巢浆液性腺癌的3年和5年生存率,COX多因素分析筛选出影响卵巢癌预后的因素,确定独立预后因素,分析FBXW7和eno1蛋白的表达情况以及与病理分级、手术病理分期,术后化疗等预后的关系。使用SPSS13.0软件进行统计学分析,x2检验来分析计数资料,Spearman分析二者的相互关系,结果以Peno1蛋白在卵巢高级别腺癌中的表达1.1 FBXW7蛋白的表达FBXW7在高级别腺癌及正常输卵管中的表达阳性率分别是25.0%和60.0%,统计学结果表明:比较二者有统计学意义(Peno1蛋白的表达eno1蛋白在高级别腺癌及正常输卵管中的表达阳性率分别是75.0%和26.7%,二者比较有统计学意义(Peno1蛋白的表达2.1 FBXW7蛋白的表达FBXW7在低级别腺癌及正常卵巢组织中的表达阳性率分别是22.5%和66.7%,二者比较有显著的统计学意义(Peno1蛋白的表达eno1蛋白在低级别腺癌及正常卵巢组织中的表达阳性率分别是67.5%和33.3%,二者比较有统计学意义(Peno1蛋白在卵巢不同级别浆液性腺癌中的表达情况FBXW7蛋白在卵巢低级别腺癌中的强阳性表达率22.5%与在高级别腺癌组强阳性表达率25.0%,二者比较没有显著差异(P>0.05),在卵巢低级别腺癌和高级别腺癌组,eno1蛋白强阳性表达率分别为67.5%和75.0%,统计学分析表明,二者之间不具有统计学意义(P>0.05)。4卵巢高低级别浆液性腺癌中FBXW7和eno1蛋白表达与患者的预后根据免疫组化的试验结果,对18例高级别腺癌进行随访,FBXW7高表达组与FBXW7低表达组相比3年生存率(60.0%vs 15.4%)差异有统计学意义(P0.05)。对37例低级别腺癌进行随访,FBXW7高表达组与FBXW7低表达组相比其3年生存率(77.8%vs 60.7%)和5年生存率(44.4%vs 32.1%)差异均无统计学意义(P>0.05)。在卵巢高级别腺癌组,eno1蛋白高表达组与低表达组3年生存率和5年生存率分别为(15.4%vs 80.0%)和(0.00%vs 40.0%)差异均有统计学意义(Peno1蛋白高表达组与低表达组其3年生存率和5年生存率分别为(59.3%vs 100.0%)和(7.4%vs50.0%)统计学分析均有显著差异(Peno1的相关性在卵巢高级别腺癌中FBXW7低表达与eno1高表达有显著的相关性(P<0.05),在卵巢

关键词： FBXW7 eno1 卵巢低级别浆液性腺癌卵巢高级别浆液性腺癌预后

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