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eno1的表达在结直肠癌发生发展和5-氟尿嘧啶耐药中的作用及其机制研究

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ENO1的表达在结直肠癌发生发展和5-氟尿嘧啶耐药中的作用及其机制...

作者：顾金荣苏州大学

学位级别：硕士

背景:结直肠癌(CRC)是全球女性第二大常见的恶性肿瘤,男性第三大常见的恶性肿瘤。由于中晚期结直肠癌患者的治疗方法有限,其死亡率仍然居高不下。因此,迫切需要探索CRC的增殖、侵袭和转移机制,寻找抑制肿瘤进展的有效靶点。化疗药物耐... 详细信息

背景:结直肠癌(CRC)是全球女性第二大常见的恶性肿瘤,男性第三大常见的恶性肿瘤。由于中晚期结直肠癌患者的治疗方法有限,其死亡率仍然居高不下。因此,迫切需要探索CRC的增殖、侵袭和转移机制,寻找抑制肿瘤进展的有效靶点。化疗药物耐药是治疗结直肠癌和许多其他癌症的主要障碍之一。eno1(烯醇化酶1)在多种肿瘤中异常表达,并与CRC的各种生物学特征有关。目的:检测烯醇化酶1(eno1)在结直肠癌和正常组织中的表达及其临床病理意义。通过体外和体内实验研究eno1敲除对CRC耐药细胞增殖和迁移的作用并进一步研究其潜在机制。方法:采用免疫组化法检测120对肿瘤组织及癌旁组织中eno1的表达水平,通过生存分析探究eno1表达与预后的相关性。通过Western blotting、MTT、集落形成和Transwell侵袭试验研究eno1对结直肠癌5-FU(5-氟尿嘧啶)耐药细胞生物学行为的调控及其可能机制。采用小鼠异种移植试验在体内验证eno1的调控作用。结果:结直肠癌组织中eno1的表达高于癌旁组织,eno1的高表达与患者淋巴结转移、神经侵犯和TNM分期(p116/5-FU和SW620/5-FU)中eno1表达增加。下调eno1的表达可显著提高HCT116/5-FU和SW620/5-FU细胞的药物敏感性并抑制细胞的增殖和迁移能力。下调eno1的表达使得EMT(上皮间充质转化)通路相关蛋白E-Cadherin表达增加,N-Cadherin蛋白及Vimentin蛋白表达下降。最后,体内实验证实,eno1表达下调抑制了结直肠癌细胞的增殖和耐药性。结论:eno1在结直肠癌中异常高表达,并与患者的临床病理特征及不良预后相关;降低eno1的表达使得结直肠癌细胞的增殖、迁移和耐药能力下降。eno1可能通过调节EMT进程调控结直肠癌细胞生物学特性,并作为治疗5-FU耐药CRC的潜在靶点。

关键词：结直肠癌 eno1 5-FU EMT通路

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eno1单链抗体及人—鼠嵌合抗体的构建

ENO1单链抗体及人—鼠嵌合抗体的构建

作者：陈圆圆甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的本实验构建eno1单链抗体原核与真核载体及人鼠嵌合抗体真核载体,通过在BL21及Expi293F细胞中进行表达,获得特异性的eno1单链抗体及人鼠嵌合抗体。方法1.以实验室前期保存pFast Bac-Dual-eno1单链抗体质粒为模板,通过分子克隆将eno1... 详细信息

目的本实验构建eno1单链抗体原核与真核载体及人鼠嵌合抗体真核载体,通过在BL21及Expi293F细胞中进行表达,获得特异性的eno1单链抗体及人鼠嵌合抗体。方法1.以实验室前期保存pFast Bac-Dual-eno1单链抗体质粒为模板,通过分子克隆将eno1单链抗体序列克隆在pcDNA3.1（+）与p ET30a（+）质粒上,得到单链抗体原核重组质粒载体p ET30a-eno1 sc Fv与真核载体重组质粒pcDNA3.1-NEO1 sc Fv,并进行PCR及测序验证,将验证正确的重组质粒转化至感受态细胞DH5α中扩增质粒并保存;2.以实验室前期保存eno1抗体质粒为模板,通过序列优化,将eno1单克隆抗体H1的可变区序列分别克隆到质粒pcDNA3.1（+）上,得到嵌合抗体重组质粒pcDNA3.1-VH、pcDNA3.1-VL,并进行PCR及测序验证,将验证正确的重组质粒转化至感受态细胞DH5α中扩增质粒并保存;3.以实验室前期保存eno1抗体质粒为模板,通过分子克隆将eno1单克隆抗体H1的可变区序列分别克隆到质粒p TRIOZ-h Ig G1上,得到VL-h Ig G1-VH重组质粒;4.将单链抗体原核重组质粒p ET30a-eno1 sc Fv重组质粒转化至BL21感受态细胞中,用IPTG诱导表达;5.用脂质体法按重轻链比1:2共转染pcDNA3.1-VH、pcDNA3.1-VL至Expi293F细胞中瞬时表达eno1嵌合抗体。结果1.成功构建eno1单链抗体原核载体pET30a-eno1 scFv与真核载体pcDNA3.1-eno1 sc Fv重组质粒;***1单链抗体原核载体在大肠杆菌BL21成功表达,SDS-PAGE结果显示单链抗体分子量32KDa,结果符合预估;3.成功构建重组质粒pcDNA3.1-VH、pcDNA3.1-VL与p TRIOZ-eno1;***3.1-VH与pcDNA3.1-VL重组质粒共转染至Expi293F细胞,SDS-PAGE结果表明未见特异性条带。结论***1单链抗体原核与真核表达载体构建成功;***1单链抗体原核成功表达;***1嵌合抗体真核载体构建成功,质粒共转染未见特异性条带。

关键词：宫颈癌 eno1 单链抗体人-鼠嵌合抗体蛋白表达

第一部分：高表达eno1细胞来源的外泌体通过直接增强糖酵解途径促进胃癌细胞转移的研究第二部分：高转移潜能细胞外泌体对肝癌细胞迁移侵袭影响及其机制研究

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第一部分：高表达ENO1细胞来源的外泌体通过直接增强糖酵解途径促...

作者：魏思佳北京协和医学院

学位级别：硕士

胃癌(Gastriccancer)是一个全球性的健康问题,是癌症相关死亡的第三大原因,同时也是全球第五大诊断量的恶性肿瘤。尽管近年来在治疗方面取得了一定的进步,晚期GC患者预后仍然很差,5年总生存率约为25%,主要是因为频繁复发,转移和耐药。... 详细信息

胃癌(Gastriccancer)是一个全球性的健康问题,是癌症相关死亡的第三大原因,同时也是全球第五大诊断量的恶性肿瘤。尽管近年来在治疗方面取得了一定的进步,晚期GC患者预后仍然很差,5年总生存率约为25%,主要是因为频繁复发,转移和耐药。外泌体是在正常细胞和肿瘤细胞的内体途径中合成的40-150nm的囊泡。由脂质双分子层组成,其内携带miRNA和mRNA、细胞因子、趋化因子、生长因子等。肿瘤微环境(Tumormicroenvironment,TME)内细胞之间的通信,无论是旁分泌、自分泌甚至内分泌,都离不开外泌体在其中的通讯作用。目前对外泌体囊泡内容物RNA的研究较多,而代谢酶研究较少,因此我们将从代谢酶角度展开研究。本研究中,我们首先通过迁移侵袭、增殖实验和EMT指标检测不同胃癌细胞株转移能力的差异。随后我们提取高转移胃癌细胞的外泌体去处理低胃癌细胞,发现其迁移侵袭、克隆形成、增殖能力、EMT均与未处理组相比较有所提高。通过查阅文献和外泌体数据库,我们选定了囊泡内容物eno1作为我们研究的靶点。我们提取蛋白和RNA来验证eno1在不同胃癌细胞中的表达含量,发现高转移胃癌细胞株中eno1分子高表达,与我们上述观点相符合,因此我们展开进一步研究。我们建立了高转移细胞稳定过表达和敲降eno1分子的细胞,提取过表达eno1稳转细胞株的外泌体,通过透射电镜、纳米粒子追踪实验、蛋白印迹实验对其进行鉴定,同时将过表达eno1胃癌细胞株的外泌体作为刺激因子去处理胃癌亲本细胞,与不加外泌体组和加入外泌体抑制剂GW4869组相比,加入过表达eno1外泌体组迁移侵袭能力明显增强。同时可能激活PI3K/Akt信号通路来促进EMT。高水平的eno1分子能够促进胃癌细胞的增殖能力、迁移侵袭能力、克隆形成能力,并且促进细胞上皮-间质转化;同理,敲降eno1则抑制细胞的上述体外功能实验。eno1是糖酵解途径的非限速酶,能够独立调控胃癌细胞的糖酵解水平。我们检测了过表达和敲降胃癌细胞系胞外的ATP生成量、葡萄糖消耗量和乳酸生成量,与上述体外功能实验结果相同。为了更进一步展开讨论,我们使用糖酵解抑制剂2-DG处理亲本细胞,发现其迁移侵袭能力减弱;糖酵解被抑制。2-DG处理eno1稳转细胞系后,过表达eno1组细胞和对照组细胞迁移侵袭能力均有所下降,但它们之间的差异相比未处理之前显著减小,提示2-DG能够回复eno1引起的胃癌细胞迁移侵袭能力的变化。因此我们得出结论eno1可能通过提高胃癌细胞的糖酵解激活PI3K/Akt信号通路促进其上皮-间质转化和迁移侵袭能力。通过上述实验我们证实了高表达eno1来源的外泌体通过直接增强糖酵解途径促进胃癌细胞的转移。肝癌是全球癌症死亡原因之一,是全球医疗保健方面的重大挑战。肝癌的治疗取决于肿瘤的大小、肿瘤位置和肝功能。治疗措施包括手术切除、局部消融,经动脉化疗栓塞和肝移植,手术切除仍是早期肝癌治疗最有效的方法,但由于早期肝癌的隐匿性,许多患者一般在中晚期被诊断出来。同时肝癌患者5年生存率仍然很低。外泌体是多泡体(MVB)与质膜融合分泌的直径为40-150nm的细胞外囊泡,可由多种类型的细胞分泌,广泛存在于体液中。其内容物包括核酸、蛋白质和脂质,是串联细胞间相互作用的重要介质。越来越多证据表明,肿瘤细胞可以通过分泌EV来改变肿瘤微环境,在肿瘤发生发展中起到了重要作用。在本研究中我们展示了不同转移潜能的肝癌细胞之间通过外泌体通讯作用来传递其异质性。我们前期发现高转移肝癌细胞条件培养基促进低转移肝癌细胞迁移侵袭能力及自我更新能力,移除外泌体的条件培养基处理,该促进作用减弱,因此我们将外泌体作为靶向异质性的窗口展开研究。我们首先提取了高转移潜能肝癌细胞的外泌体,并通过粒径分析、电镜实验和蛋白印迹实验进行鉴定;同时免疫荧光实验证明高转移潜能肝癌细胞外泌体可以被低转移肝癌细胞内吞发挥作用。我们提取高转移潜能肝癌细胞外泌体处理低转移肝癌细胞,结果显示,外泌体促进了肝癌细胞的迁移侵袭、自我更新、增殖能力和上皮-间质转化表型;机制上,高转移潜能肝癌外泌体处理过后的低转移肝癌细胞PI3K/AKT通路被激活,因此我们推测高转移潜能肝癌细胞外泌体通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路来促进一系列恶性表型。

关键词：胃癌外泌体 eno1 上皮-间质转化糖酵解肝癌细胞外泌体迁移侵袭干性特征上皮-间质转化

长链非编码RNA eno1-AS1通过结合YB1调控eno1表达对肝癌细胞增殖的影响

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长链非编码RNA ENO1-AS1通过结合YB1调控ENO1表达对肝癌细胞增殖...

作者：黄梦琪华中科技大学

学位级别：硕士

目的:本文主要探讨了肝癌组织及肝癌细胞系中高表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)eno1-AS1在肝癌中的生物学效应以及潜在调控机制,为开发和探寻肝癌诊断治疗靶点提供基础实验依据。方法:经生物信息学分析筛选出肝细胞肝... 详细信息

目的:本文主要探讨了肝癌组织及肝癌细胞系中高表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)eno1-AS1在肝癌中的生物学效应以及潜在调控机制,为开发和探寻肝癌诊断治疗靶点提供基础实验依据。方法:经生物信息学分析筛选出肝细胞肝癌组织中高表达的lncRNA eno1-AS1,并通过PCR检测eno1-AS1在细胞系中的表达。敲低或过表达肝癌细胞内eno1-AS1后,通过PCR以及WB检测eno1的表达改变,并通过MTT,平板克隆以及Ed U实验观察细胞增殖改变。RNA免疫共沉淀以及RNA下拉实验用于检测YB1和eno1-AS1的结合,染色质免疫共沉淀实验用于检测转录因子YB1与eno1启动子序列的结合。转染YB1小干扰RNA或者过表达质粒后,通过PCR以及WB检测eno1的表达改变。敲低或过表达eno1后,以及在敲低eno1-AS1的细胞中过表达eno1进行回复性实验后,通过PCR以及WB检测eno1的表达改变并通过MTT,平板克隆以及Ed U实验观察细胞增殖改变。使用Co Cl或酸性培养基模拟低氧以及酸性条件培养肝癌细胞,并通过PCR检测处理后细胞中eno1-AS1的表达改变。结果:eno1-AS1促进eno1的表达以及肝癌细胞的增殖。eno1-AS1通过结合YB1调控其与eno1启动子的结合。敲低eno1-AS1引起的细胞增殖受抑可以在过表达eno1后被回复。低氧处理后,肝癌细胞中eno1-AS1表达上调。结论:肝癌中高表达的eno1-AS1可以促进YB1与eno1启动子的结合,通过在转录水平上调eno1的表达促进肝癌细胞增殖,而eno1-AS1在肝癌中的高表达可能受低氧微环境影响。

关键词：肝细胞肝癌肿瘤增殖长链非编码RNA 低氧微环境 eno1-AS1 eno1

微小隐孢子虫表面糖蛋白gp40受体蛋白eno1的鉴定及其生物学功能分析

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微小隐孢子虫表面糖蛋白gp40受体蛋白ENO1的鉴定及其生物学功能分...

作者：王悦欣河南农业大学

学位级别：硕士

隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种主要感染肠上皮的细胞的顶复门原虫。隐孢子虫感染在全球各地都有报道,隐孢子虫是导致全球儿童和艾滋病患者腹泻的主要原因,尤其对一些发展中国家以及资源贫乏地区的儿童影响极为严重。由隐孢子虫引... 详细信息

隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种主要感染肠上皮的细胞的顶复门原虫。隐孢子虫感染在全球各地都有报道,隐孢子虫是导致全球儿童和艾滋病患者腹泻的主要原因,尤其对一些发展中国家以及资源贫乏地区的儿童影响极为严重。由隐孢子虫引起的隐孢子虫病通常会引起儿童的发育迟缓,对免疫力低下或缺失的人群可导致脱水性腹泻。目前,已鉴定出的近44个隐孢子虫有效虫种,其中微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）目前被认为是在人与家畜之间通过粪口途经传播相关的重要虫种。***的感染通常是通过卵囊的摄入,如人和其他动物通过直接接触或者食用受污染的水或者食物。卵囊在进入肠道后释放出有感染能力的子孢子,进而感染肠道上皮细胞,在整个过程中子孢子会分泌多种糖蛋白参与入侵。微小隐孢子虫gp40蛋白是卵囊脱囊后子孢子在入侵宿主细胞过程中被鉴定到的分泌蛋白,在入侵过程中发挥着重要的作用。目前,关于gp40蛋白与宿主细胞蛋白互相作用的分子机制尚不清楚。因此,本研究首次通过GST-Pull down和LC-MS/MS技术筛选了HCT-8细胞蛋白与Cpgp40蛋白存在潜在互作可能的蛋白,并验证可能的互作关系,初步探究了受体蛋白在***子孢子体外黏附入侵中的功能特点,为进一步研究相关入侵机制以及畜牧业对隐孢子虫感染的预防和研发隐孢子虫病相关药物等奠定基础。本研究首先将*** gp40基因构建到带有GST标签蛋白的原核表达载体p GEX-4T-1上,通过将重组质粒导入表达菌中,利用原核表达系统,在37°C,1 m M IPTG条件下诱导表达,并成功表达出重组GST-Cpgp40蛋白和对照GST蛋白,并采用SDS-PAGE和Western blot技术对重组GST-Cpgp40蛋白进行了检测鉴定。通过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析得到纯度较高的重组gp40蛋白,并且成功制备了anti-GST-Cpgp40的兔多克隆抗体,为后续试验的开展与研究做好准备。在得到纯化的蛋白之后,我们通过GST-Pull down技术和蛋白质谱共鉴定26个蛋白,根据韦恩图的结果分析,共筛选出14个与Cpgp40蛋白存在互作可能的蛋白,他们大多都分布在细胞的细胞膜和细胞骨架上。我们检测了蛋白质谱结果中位于细胞膜和细胞骨架的几个蛋白对应的m RNA水平在***入侵HCT-8细胞不同时间点的变化情况,发现eno1基因的水平在***入侵后3h显著下调,这一时间点正是黏附入侵阶段。值得注意的是,eno1在寄生虫的侵染中研究较多,且主要参与细胞外基质的降解,因此根据试验结果和生物信息学分析,我们选择eno1蛋白作为后续试验研究。随后,我们利用双分子荧光互补试验和免疫共沉淀试验成功验证Cpgp40蛋白和HCT-8细胞的eno1蛋白的体外互作,为下一步试验奠定了基础。我们进一步发现anti-eno1抗体以及si-eno1能够对***的入侵具有阻断作用,说明eno1在入侵过程中发挥着一定的功能。同时外源蛋白的加入以及过表达载体转染也说明eno1蛋白对***入侵具有促进作用。此外,通过我们对入侵前后细胞层连蛋白和黏连蛋白的m RNA和蛋白水平的检测,以及对eno1蛋白功能氨基酸进行定点突变,进一步证明了eno1蛋白参与***入侵宿主过程中的细胞质外基质的降解和细胞内的糖酵解过程可能进一步影响***内生发育阶段的供能等过程。当然还需要进一步的研究来充分了解eno1在***入侵宿主中参与的相关通路调控的具体作用和功能机制。综上所述,本论文初步探究了微小隐孢子虫gp40蛋白与宿主细胞蛋白的互作,为研究微小隐孢子虫入侵机制奠定了基础。

关键词：微小隐孢子虫 gp40 GST Pull-down 互作 eno1 生物学功能

天然小分子化合物L01靶向eno1抑制伯基特淋巴瘤细胞增殖侵袭的分子机制研究

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天然小分子化合物L01靶向ENO1抑制伯基特淋巴瘤细胞增殖侵袭的分...

作者：高文娟大连医科大学

学位级别：硕士

背景:伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma,BL)是来源于滤泡生发中心高度恶性的B细胞肿瘤,为起源于淋巴系统最具侵袭性的非霍奇金淋巴瘤(NonHodgkin lymphoma,NHL)亚型之一,是一种罕见的侵袭性淋巴瘤。其典型分子特征是MYC基因易位,导致伯基... 详细信息

背景:伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma,BL)是来源于滤泡生发中心高度恶性的B细胞肿瘤,为起源于淋巴系统最具侵袭性的非霍奇金淋巴瘤(NonHodgkin lymphoma,NHL)亚型之一,是一种罕见的侵袭性淋巴瘤。其典型分子特征是MYC基因易位,导致伯基特淋巴瘤细胞异常增殖。主要临床表现为颌面部巨大包块、淋巴结肿大、发热、消瘦、盗汗。伯基特淋巴瘤患者目前无特效药,易复发并高度耐药,造血干细胞移植治疗也往往无效,因此研发新靶向药物意义重大。eno1(alpha enolase 1),α烯醇化酶,为烯醇化酶家族成员之一,是一种高度保守的胞质糖酵解酶,可催化2-磷酸甘油酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。eno1在肿瘤细胞中高表达,促进细胞增殖,迁移和侵袭,与肿瘤发生和进展相关。eno1在伯基特淋巴瘤中高表达,以eno1为分子靶点探究对伯基特淋巴瘤的有效药物具有重要的临床意义。目的:1)筛选能够靶向eno1的小分子抑制剂;2)探究L01对伯基特淋巴瘤细胞增殖侵袭的影响;3)探究L01抑制伯基特淋巴瘤细胞增殖侵袭的分子机制。方法:1)利用CETSA(Cellular Thermal Shift Assay)技术结合Western-blot和流式细胞术筛选和检测可以与eno1结合的天然小分子化合物;2)台盼蓝计数法检测L01对伯基特淋巴瘤细胞Daudi、Raji增殖的影响,流式细胞术检测L01对Daudi、Raji凋亡和周期的影响,Transwell实验检测L01对Daudi、Raji迁移和侵袭的影响;3)探究L01影响Daudi、Raji增殖侵袭的分子机制,Western-blot检测L01对Daudi、Raji中TGF-β1、MMP-9和EMT(Epithelial-mesenchymal transition)相关蛋白表达水平的影响。结果:1)在筛选候选天然小分子化合物中,发现L01与eno1具有较强的结合能力,并且与对照组相比,L01呈剂量依赖性抑制eno1与纤溶酶原(PLG)结合;2)L01呈时间和剂量依赖性抑制Daudi、Raji细胞的增殖能力;3)L01呈剂量依赖性抑制Daudi、Raji细胞的迁移和侵袭能力;4)L01促进Daudi细胞凋亡,作用24小时,20μM时的凋亡率为10.15%(Peno1具有较强的结合能力,抑制eno1与PLG的结合,减少纤溶酶(PLA)的生成;2)L01抑制伯基特淋巴瘤细胞Daudi和Raji细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡,阻滞细胞周期在G1期;3)L01使TGF-β1和MMP-9蛋白表达水平下降,影响EMT相关蛋白的表达水平,抑制EMT进程,进而使肿瘤细胞的侵袭能力减弱。

关键词：伯基特淋巴瘤细胞 eno1 增殖侵袭天然小分子化合物 EMT

PLCE1/eno1调控小鼠食管成瘤组织中糖酵解及抑制CD4+/CD8+T细胞免疫功能的初步研究

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PLCE1/ENO1调控小鼠食管成瘤组织中糖酵解及抑制CD4+/CD8+T细胞免...

作者：俞雪燕石河子大学

学位级别：硕士

目的:探究4NQO药物诱导成瘤和eno1抑制药物处理的PLCE1不同基因型C57BL/6小鼠癌组织中的糖酵解水平和CD4/CD8T细胞免疫功能。方法:(1)利用4NQO药物诱导PLCE1不同基因型的C57BL/6小鼠构建食管癌模型并且腹腔注射eno1抑制剂;(2)利用葡萄... 详细信息

目的:探究4NQO药物诱导成瘤和eno1抑制药物处理的PLCE1不同基因型C57BL/6小鼠癌组织中的糖酵解水平和CD4/CD8T细胞免疫功能。方法:(1)利用4NQO药物诱导PLCE1不同基因型的C57BL/6小鼠构建食管癌模型并且腹腔注射eno1抑制剂;(2)利用葡萄糖、乳酸、丙酮酸及ATP检测试剂盒检测食管癌组织中的糖酵解产物水平和糖酵解关键酶己糖激酶、磷酸果糖激酶及丙酮酸激酶的m RNA水平;(3)生物信息学预测糖酵解相关酶eno1表达水平与CD4/CD8T细胞的相关性;(4)流式细胞实验检测基因鼠食管癌组织中CD45T细胞、CD3T细胞、CD4T细胞、CD8T细胞的比例;(5)q PCR实验检测组织中细胞因子IFN-γ、TNF-α、Granzyme B、PD-1的m RNA水平;(6)流式细胞实验检测CD8T细胞的IFN-γ、TNF-α、Granzyme B及PD-1表达水平;(7)流式细胞实验检测CD4T细胞的IFN-γ、TNF-α及PD-1表达水平。结果:(1)野生型对照组基因鼠相比于野生型处理组、纯合子对照组和纯合子处理组,食管癌组织中的葡萄糖水平降低(2.128±0.158vs 2.653±0.162vs2.529±0.286vs2.972±0.270,P1),乳酸水平升高(3.260±0.598vs2.103±0.753vs2.080±0.252vs1.555±0.718,P1),ATP水平升高(217.164±60.561vs105.887±83.626vs100.505±52.988,P=0.016),丙酮酸水平升高(0.048±0.001vs0.026±0.006vs0.024±0.006vs0.012±0.003,P=0.005),同样己糖激酶的m RNA水平升高(1.677±0.097vs1.203±0.166vs1.001±0.060vs0.419±0.050,P1),丙酮酸激酶的m RNA水平升高,但丙酮酸激酶的m RNA水平只在野生型对照组与纯合子处理组之间有统计学意义(0.556±0.031vs0.503±0.035vs 0.558±0.034vs0.457±0.026,P=0.0002),磷酸果糖激酶的m RNA水平组间无统计学意义(0.734±0.063vs 0.465±0.192vs0.674±0.254vs0.463±0.054,P=0.0351);(2)食管鳞癌中eno1的表达水平高时CD4/CD8T细胞的浸润水平下降(P13.867±1.703vs18.277±4.681vs17.505±3.392vs23.823±2.921,P1)、CD3T细胞(13.867±1.703 vs18.277±4.681vs17.505±3.392vs23.823±2.921,P1)、CD4T细胞(13.867±1.703vs18.277±4.681vs17.505±3.392vs23.823±2.921,P1)和CD8T细胞(13.867±1.703vs18.277±4.681vs17.505±3.392vs23.823±2.921,P1)的比例较野生型处理组、纯合子对照组中和纯合子抑制剂组显著降低;(4)在野生型对照组中肿瘤组织中的FN-γ的m RNA水平较野生型处理组、纯合子对照组中和纯合子抑制剂组显著降低(5.836±0.382vs8.717±0.824vs7.770±0.438,P1),相反PD-1的表达水平则升高(0.480±0.019vs0.389±0.065vs0.370±0.052vs0.267±0.051,P1),在野生型对照组中肿瘤组织中的TNF-α(1.608±0.162vs2.135±0.645vs2.310±0.414vs2.529±0.106,P=0.013)和Granzyme B(18.79±2.255vs 19.85±1.864vs18.92±2.014vs22.27±1.037,P=0.031)的m RNA水平与纯合子处理组相比较低,且有统计学意义,而与野生型处理组和纯合子对照组相比无统计学意义;(5)在纯合子抑制剂组中肿瘤组织中CD8T细胞的FN-γ(4.48±0.622vs7.74±2.482vs10.007±2.541vs18.897±6.052,P1)、TNF-α(0.657±0.048vs1.007±0.116vs0.953±0.311vs1.535±0.167,P1)、Granzyme B(13.867±1.703vs18.277±4.681vs17.505±3.392vs23.

关键词：食管鳞癌 PLCE1 eno1 糖酵解免疫

食管鳞癌中PLCE1通过E3泛素连接酶FBXW7调控eno1进而促进糖酵解的机制研究

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食管鳞癌中PLCE1通过E3泛素连接酶FBXW7调控ENO1进而促进糖酵解的...

作者：何尚峰石河子大学

学位级别：硕士

目的:课题前期研究已验证PLCE1可以通过eno1促进食管鳞癌糖酵解,本研究旨在进一步验证该结论,并初步探究食管鳞癌中PLCE1通过E3泛素连接酶FBXW7调控eno1进而促进糖酵解的分子机制。方法:(1)通过酶联免疫吸附试验检测血清中eno1水平。(2... 详细信息

目的:课题前期研究已验证PLCE1可以通过eno1促进食管鳞癌糖酵解,本研究旨在进一步验证该结论,并初步探究食管鳞癌中PLCE1通过E3泛素连接酶FBXW7调控eno1进而促进糖酵解的分子机制。方法:(1)通过酶联免疫吸附试验检测血清中eno1水平。(2)通过Seahorse细胞能量代谢分析仪检测PLCE1通过eno1对食管鳞癌细胞胞外酸化率的影响。(3)通过裸鼠成瘤实验检测PLCE1通过eno1对食管鳞癌肿瘤生长及糖酵解的影响。(4)通过免疫共沉淀蛋白质谱筛选食管鳞癌细胞中与PLCE1相互作用的泛素酶。(5)通过Western Blot检测沉默PLCE1后FBXW7的蛋白表达;检测正常食管上皮细胞与食管鳞癌细胞中FBXW7蛋白表达。(6)通过免疫共沉淀实验检测食管鳞癌细胞中FBXW7与eno1的相互作用。(7)利用免疫组织化学技术检测食管鳞癌组织与正常食管上皮组织中FBXW7的蛋白表达(8)通过PCR重测序技术检测食管鳞癌组织与食管鳞癌细胞中FBXW7的突变情况。(9)通过Western Blot检测食管鳞癌细胞中过表达野生型及突变型FBXW7后eno1的蛋白表达及加入放线菌酮后eno1蛋白稳定性。(10)通过免疫沉淀实验检测293T细胞中野生型及突变型FBXW7与eno1相互作用;检测293T细胞中赖氨酸位点突变后eno1的泛素化情况。(11)通过CCK8、平板克隆、细胞划痕、Transwell迁移、侵袭实验检测过表达FBXW7后食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。(12)采用SPSS 25.0软件进行统计分析。结果:(1)食管鳞癌患者血清中eno1表达升高。(2)PLCE1可以通过eno1提高食管鳞癌细胞胞外酸化率。(3)PLCE1通过eno1提高成瘤小鼠体重、肿瘤体积、肿瘤重量及瘤体组织葡萄糖摄取、丙酮酸、乳酸和ATP生成。(4)食管鳞癌细胞中PLCE1与FBXW7存在相互作用且沉默PLCE1后FBXW7表达降低。(5)食管鳞癌细胞中FBXW7与eno1存在相互作用(6)食管鳞癌细胞与组织中FBXW7低表达,并与患者的分化程度及预后相关。(7)食管鳞癌细胞中过表达野生型FBXW7后,eno1蛋白表达下调,蛋白稳定性降低。过表达突变型FBXW7后(除V341A突变),eno1蛋白表达无显著改变,蛋白稳定性不变。(8)293T细胞中突变型FBXW7(除V341A突变)与eno1结合能力降低。(9)突变eno1的K406、K420、K422、K434位点后,293T细胞中eno1泛素化水平降低。(10)过表达FBXW7后,食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均降低。结论:(1)PLCE1可以通过eno1促进食管鳞癌生长及糖酵解。(2)PLCE1通过FBXW7介导的eno1泛素化降解调控eno1蛋白水平。(3)FBXW7突变会降低与eno1的结合进而抑制eno1的泛素化降解。(4)FBXW7表达降低提示患者不良预后,过表达FBXW7抑制食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

关键词：食管鳞癌 PLCE1 eno1 FBXW7 泛素化

腺相关病毒介导的糖酵解酶eno1人鼠嵌合抗体对宫颈癌细胞的作用研究

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腺相关病毒介导的糖酵解酶ENO1人鼠嵌合抗体对宫颈癌细胞的作用研...

作者：赵源旭甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的构建重组eno1鼠源性单克隆抗体轻重链可变区基因与人Ig G1轻重链恒定区基因的腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),探讨重组腺相关病毒介导的烯醇化酶1(eno1)人鼠嵌合抗体抗宫颈癌细胞的作用。方法1.采用PCR方法,选择p AAV2-MC... 详细信息

目的构建重组eno1鼠源性单克隆抗体轻重链可变区基因与人Ig G1轻重链恒定区基因的腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),探讨重组腺相关病毒介导的烯醇化酶1(eno1)人鼠嵌合抗体抗宫颈癌细胞的作用。方法1.采用PCR方法,选择p AAV2-MCS载体,将鼠源性eno1单克隆抗体轻重链的可变区基因与人Ig G1轻重链的恒定区基因通过FMDV 2A序列连接,构建重组质粒r AAV-eno1-ximab,并鉴定质粒。2.采用AAV载体系统,在辅助质粒(p Helper、p AAV-RC)的基础上,将重组质粒r AAV-eno1-ximab转染到AAV293细胞中,制备r AAV-eno1-ximab重组病毒。同时制备对照组r AAV-GFP,表达绿色荧光蛋白。3.采用PEG法分离、浓缩和纯化腺相关病毒,并根据荧光表达情况测定重组病毒的滴度。4.培养人宫颈癌He La细胞,通过MTT法体外检测r AAV-eno1-ximab作用后,对宫颈癌细胞的作用。结果1.成功构建质粒p AAV-eno1-ximab,PCR检测、酶切鉴定及测序目的基因条带正确。2.将重组质粒r AAV-eno1-ximab和r AAV-GFP转染到AAV293细胞中,转染效率为90%。3.将重组病毒r AAV-eno1-ximab和r AAV-GFP纯化和浓缩后,测定二者滴度均为4.0×10～7PFU/ml。***法表明,重组病毒r AAV-eno1-ximab可以显著抑制宫颈癌He La细胞的增殖,与阴性对照组(r AAV-GFP)和空白对照组(control)组相比有显著统计学差异(Peno1)人鼠嵌合抗体的重组腺相关病毒r AAV-eno1-ximab,可高效、靶向介导重组eno1人鼠嵌合抗体基因进入细胞质;2、重组腺相关病毒r AAV-eno1-ximab可以显著抑制宫颈癌He La细胞的增殖,为宫颈癌的治疗提供新思路。

关键词：重组腺相关病毒 eno1 嵌合抗体宫颈癌