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草鱼miR-462-731在抗细菌侵袭过程中调控机制的研究

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草鱼miR-462-731在抗细菌侵袭过程中调控机制的研究

作者：何焱上海海洋大学

学位级别：硕士

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国主要养殖鱼类,嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后诱发的草鱼败血症对草鱼产业造成了巨大的经济损失。败血症通常伴随着明显的炎症反应,若入侵的细菌没有得到迅速控制则可能导致感染性休克... 详细信息

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国主要养殖鱼类,嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后诱发的草鱼败血症对草鱼产业造成了巨大的经济损失。败血症通常伴随着明显的炎症反应,若入侵的细菌没有得到迅速控制则可能导致感染性休克或死亡。大量研究表明miRNA参与抗菌免疫应答过程,且草鱼中多个miRNAs都参与炎症反应。在动物基因组中,miRNAs主要是以簇的形式存在,且同一个miRNA簇上的miRNAs通常调控功能相关的基因。本论文分析了草鱼miR-462-731簇的序列特征,elk1/miR-462-731的负反馈回路及miR-731靶向ezrin调控巨噬细胞吞噬的作用机制,还对CLDN基因家族的序列特征、表达及调控网络进行了分析。本文的研究结果如下所示:1.miR-462-731簇序列特征分析本研究从miRBase数据库获得硬骨鱼类miR-462-731和哺乳动物miR-191-425的前体和成熟体序列,多序列比对发现miR-462-731和miR-191-425成熟体种子序列高度保守。构建系统发育树发现硬骨鱼类miR-462-731聚为一簇,哺乳动物miR-191-425聚为一簇。经过二级结构预测分析,硬骨鱼类miR-462-731和miR-191-425的二级结构茎环结构存在差异。2.elk1/miR-462-731双负反馈回路鉴定Alibaba 2.1预测并通过双荧光素酶报告系统证实转录因子elk1结合miR-462-731簇启动子,双荧光素酶报告系统证实elk1与miR-462-731簇启动子的结合,在草鱼CIK细胞系过表达elk1可抑制miR-462和miR-731的表达。RNAhybrid预测发现elk1同样存在miR-731潜在结合位点,在CIK细胞系中过表达miR-731可显著抑制elk1表达;抑制miR-731可显著促进elk1表达水平。双荧光素酶报告系统的结果进一步证明elk1是miR-731的靶基因。以上数据显示miR-731和elk1存在双负反馈调控回路。3.miR-731对炎症反应和巨噬细胞的调控miR-731在健康草鱼脾脏和肠道中表达量最高,在A.hydrophila感染草鱼后,miR-731表达出现紊乱,初步说明miR-731参与草鱼抗细菌感染免疫反应。为了研究miR-731的具体功能,利用RNAhybrid分析草鱼miR-731靶基因,生信分析ezrin为miR-731潜在靶基因。在CIK细胞系中过表达和抑制miR-731,荧光定量实验证实miR-731对ezrin的靶向作用,双荧光素酶报告系统证实ezrin为miR-731的靶基因。过表达elk1或抑制miR-731均促进下游促炎因子(il-1β和tnf-α)的表达水平。过表达miR-731可增强巨噬细胞的吞噬能力。本结果有助于进一步了解miR-731对巨噬细胞功能的调控作用。4.CLDN基因家族分析Cldn-5是miR-731的另一个潜在靶基因,草鱼CLDNs基因家族共有60个成员,含有29个串联重复基因,分布在16条染色体上。健康组织中,CLDNs在胚胎和肾脏中高表达;在A.hydrophila感染草鱼后,cldn-1、cldn-5a、cldn-8b、cldn-31a和cldn-7a等CLDN基因的表达会发生较大波动。用String进行蛋白网络互作,分析发现CLDN基因家族成员之间可互相作用,且CLDNs蛋白与其它膜蛋白之间也可以相互调控作用。RNAhybrid预测发现60个CLDNs基因被70个miRNAs靶向调控。复杂的蛋白质互作网络和miRNAs-CLDNs调控网络,说明草鱼抗细菌感染过程需要复杂的调控网络来维护机体稳态。

关键词：草鱼 miR-462-731 elk-1 ezrin 巨噬细胞 CLDN

慢性房颤对风湿性心脏病心房肌细胞elk-1、p-elk-1表达的影响

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第三军医大学学报 2007年第12期29卷 1197-1199页

作者：曾祥君肖颖彬陈林钟前进王学锋第三军医大学新桥医院全军心血管外科中心重庆400037

目的研究风湿性心脏病慢性房颤患者心房肌细胞elk-1、p-elk-1的表达,探讨房颤发生与elk-1、p-elk-1表达之间的关系。方法12例风心病换瓣患者分为2组:①慢性房颤组(6例)房颤持续时间均>6个月,②窦性心律组(6例)为正常心律。手术中切取少... 详细信息

目的研究风湿性心脏病慢性房颤患者心房肌细胞elk-1、p-elk-1的表达,探讨房颤发生与elk-1、p-elk-1表达之间的关系。方法12例风心病换瓣患者分为2组:①慢性房颤组(6例)房颤持续时间均>6个月,②窦性心律组(6例)为正常心律。手术中切取少许右心房游离壁组织采用免疫组化和间接免疫荧光技术检测心房肌elk-1、p-elk-1的表达与分布。结果①免疫组化显示elk-1主要表达在心房肌细胞质和细胞核,慢性房颤心房肌较窦性心律心房肌表达明显减弱;②间接免疫荧光技术显示elk-1在窦性心律心房肌细胞核表达相对较高,在房颤心房肌细胞核中表达明显受到抑制;p-elk-1在房颤心房肌、窦性心律心房肌均表达受抑。结论转录激活因子elk-1的表达改变可能在慢性房颤心房肌的分子重构中起着重要的作用。

关键词：房颤逆向分化转录激活因子 elk-1

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elk-1 miRNA干扰质粒构建及鉴定

江苏医药 2010年第6期36卷 669-671,I0001页

作者：姚林华李玉琴马士杰张国新南京医科大学第一附属医院消化病科 210029

目的设计及构建elk-1微小干扰核糖核酸(miRNA)质粒,最终鉴定出有效干扰质粒。方法设计及构建4对elk-1的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR miRNA及1对无效对照miRNA干扰质粒,通过测序鉴定。将干扰质粒用脂质体法转染293T细胞,通过顺时转染获得细... 详细信息

目的设计及构建elk-1微小干扰核糖核酸(miRNA)质粒,最终鉴定出有效干扰质粒。方法设计及构建4对elk-1的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR miRNA及1对无效对照miRNA干扰质粒,通过测序鉴定。将干扰质粒用脂质体法转染293T细胞,通过顺时转染获得细胞系。通过倒置荧光显微镜下观察绿色荧光确定转染效率,RT-PCR检测4对干扰质粒、阴性对照质粒elk-1的mRNA的表达水平。结果测序表明,elk-1干扰序列及读框完全正确,干扰质粒瞬时转染的293T细胞系在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光达90%以上。RT-PCR结果显示,MR-2、MR-3干扰质粒对elk-1mRNA有较好的抑制效果。结论成功构建了elk-1干扰真核表达载体,筛选出有效干扰质粒,为进一步研究elk-1在肿瘤细胞中的作用提供参考。

关键词： elk-1 微小干扰核糖核酸

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elk-1调节骨骼系统功能的研究进展

中国骨质疏松杂志 2020年第12期26卷 1857-1860页

作者：王艺璇王可张舒空军军医大学航空航天生物动力学教研室/航空航天医学教育部重点实验室陕西西安710032

elk-1是一种转录因子,属于Ets转录因子家族,在基因表达调控中发挥着重要作用。最近的研究结果表明,elk-1参与调控骨组织细胞功能,主要可促进成骨细胞分化及增殖,并抑制成骨细胞凋亡。elk-1可影响骨肿瘤、骨质疏松症等骨性疾病的病理过程... 详细信息

elk-1是一种转录因子,属于Ets转录因子家族,在基因表达调控中发挥着重要作用。最近的研究结果表明,elk-1参与调控骨组织细胞功能,主要可促进成骨细胞分化及增殖,并抑制成骨细胞凋亡。elk-1可影响骨肿瘤、骨质疏松症等骨性疾病的病理过程,与骨肉瘤、骨尤文肉瘤、骨转移癌等多种骨肿瘤的侵袭、转移及预后不良密切相关,且在骨质疏松症等骨性疾病中elk-1的表达及转录活性异常。本文将对elk-1调节骨骼系统功能的研究进展进行概述。

关键词： elk-1 骨骼系统成骨细胞

转录因子elk-1调控MAZ基因启动子转录活性的体外研究

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中国细胞生物学学报 2017年第6期39卷 710-719页

作者：王博贾琳娜王小怡张潮王雪伟任剑波高哲郭大玮山西医科大学法医学院山西医科大学转化医学研究中心太原030001

该文旨在探究血清淀粉样蛋白A激活转录因子(serum amyloid A activating transcription factor,SAF),或称myc相关锌指蛋白(myc-associated zinc finger protein,MAZ)基因,除已证实的转录因子MAZ和Sp1(specificity protein 1)外,是否存在其他转录因子对MAZ基因启动子的转录激活具有调控作用。在生物信息学预测基础上,利用凝胶电泳迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)筛查MAZ启动子区的转录因子结合位点。在EMSA筛查出MAZ启动子区包含转录激活因子ETS样蛋白1(ETS-like 1 transcription factor,elk-1)结合位点后,通过该实验室构建的由MAZ启动子驱动的双荧光报告系统分析观察过表达转录因子elk-1后MAZ启动子的转录激活情况。结果显示,转录因子elk-1可结合MAZ启动子–525~–504 nt区的DNA序列;过表达elk-1及Sp1均可使MAZ的两个转录子SAF-1和SAF-3转录水平降低且后一转录子被抑制尤甚。结果提示,elk-1与Sp1共同参与调控MAZ基因两个转录子SAF-1和SAF-3的转录调控,在MAZ基因参与的细胞诸多生理疾病过程中,elk-1可能通过该途径发挥其作用。

关键词： MAZ基因转录因子 elk-1 凝胶电泳迁移实验双色荧光蛋白报告系统

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香菇-β葡聚糖的抗炎作用及其分子机理初探

香菇-β葡聚糖的抗炎作用及其分子机理初探

作者：石立民中南林业科技大学

学位级别：硕士

香菇是我们日常生活中常见的食用菌。我国的香菇产量巨大,位居世界之首,香菇被誉为“菇中之王”,其营养成分具有多种生理功能,其中香菇-β葡聚糖作为香菇中的重要药用生理活性物质,目前其抗炎作用的研究在国内外研究尚处于起步阶段,其... 详细信息

香菇是我们日常生活中常见的食用菌。我国的香菇产量巨大,位居世界之首,香菇被誉为“菇中之王”,其营养成分具有多种生理功能,其中香菇-β葡聚糖作为香菇中的重要药用生理活性物质,目前其抗炎作用的研究在国内外研究尚处于起步阶段,其发挥抗炎作用的分子机制尚不清楚。本论文主要研究香菇中的活性成分香菇-β葡聚糖对于炎症性结肠炎的预防和改善作用,利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7细胞炎症模型,以及硫酸葡聚糖钠(sodium dextran sulfate,DSS)诱导小鼠炎症性肠炎(inflammatory bowel disease,IBD)模型,以评估香菇-β葡聚糖的抗炎作用并探究其分子机理。为香菇资源的更有效利用提供了非常重要的理论依据。香菇-β葡聚糖保护组小鼠精神状态有所改善,肉眼可见少量便血或无便血,DAI评分降低。结肠组织中发生溃疡、水肿程度减轻,结肠壁增厚,结肠重量增加、长度缩短等症状较损伤组有所缓解。显微镜下观察结肠组织HE染色切片:DSS损伤组小鼠结肠组织呈现出显著的急性炎症反应症状:黏膜大面积糜烂、溃疡,腺体的隐窝结构被破坏,淋巴细胞及伴中性粒细胞等炎性细胞浸润,杯状细胞丢失;香菇-β葡聚糖保护组小鼠只有少量出血、炎性细胞浸润,黏膜和隐窝结构相对完整,排列比较整齐。DSS损伤组小鼠结肠组织中MPO、MDA和NO含量分别升高为对照组的2.37倍、3.06倍与2.62倍;与对照组对比,低剂量香菇-β葡聚糖保护组小鼠结肠组织中MPO、MDA和NO含量分别为其1.96、2.18和1.96倍,高剂量香菇-β葡聚糖保护小鼠结肠组织中MPO、MDA和NO含量分别为其1.56、2.00和1.79倍。DSS损伤组小鼠结肠组织中四种炎症因子mRNA含量分别升高5.58、4.12、4.09和9.73倍;与对照组比较,低剂量香菇-β葡聚糖组小鼠结肠组织中四种mRNA含量分别降低为其3.44、3.13、2.72和5.85倍,高剂量香菇-β葡聚糖保护组小鼠结肠组织中四种mRNA含量分别降低为其2.33、2.13、2.19和4.53倍。DSS损伤组小鼠结肠组织中炎症因子TNF-αuIL-1β、IL-6和iNOS的蛋白表达量分别升高为对照组的1.55、2.23、1.54和2.00倍。低剂量香菇-β葡聚糖保护组中四种蛋甶分别降低为对照组的1.48、2.14、1.51和1.50倍,高剂量香菇-β葡聚糖保护组中四种蛋白分别降低为对照组的1.24、1.49、1.26和1.55倍。LPS 组中 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 iNOS mRNA 为对照组的 4.19、4.88、6.72和4.77倍;香菇-β葡聚糖保护组与LPS组比较,100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL组中炎症因子TNF-α、IL-1 β、IL-6和iNOS表达量均显著降低。LPS诱导组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS炎症基因蛋白表达水平分别为对照组的2.27、2.09、1.88和1.93倍。与LPS组细胞比较,三种剂量的香菇-β葡聚糖保护组细胞中四种蛋白表达量显著降低,差异显著。香菇-β葡聚糖对LPS诱导巨噬细胞RAW264.7中PPARy和elk-1转录活性的影响:与对照组细胞比较,LPS组细胞中PPARγ和elk-1磷酸化蛋白表达量分别增加2.03、1.88倍。与LPS组细胞比较,香菇-β葡聚糖组细胞中PPARγ和elk-1磷酸化蛋白表达量显著降低。香菇-β葡聚糖可显著促进炎症细胞中PPARγ的转录激活同时抑制elk-1的转录激活。香菇-β葡聚糖对巨噬细胞RAW264.7中MAPKs通路关键靶分子的磷酸化作用影响：与LPS组细胞比较,香菇-β葡聚糖保护组三组细胞ERK1/2、JNK与β38磷酸化水平显著减少;在香菇-β葡聚糖与抑制剂共同作用下,PPARγ的转录抑制被进一步削弱,转录活性增强,elk-1的转录活性被进一步抑制。表明MAPKs磷酸化作用可抑制转录因子PPARγ的转录活性,促进转录因子elk-1的转录活性,从而使炎症因子/介质表达增多。香菇-β葡聚糖通过阻断MAPKs通路,发挥抗炎功效。综合分析,在整体动物实验中香菇-β葡聚糖能够显著改善由DSS诱导的结肠炎症小鼠症状,降低DAI评分:减轻结肠组织病理损伤,降低结肠组织中MPO、MDA和NO含量;抑制结肠组织中炎症因子:TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS等基因的高表达;促进过氧化物酶体增殖剂激活受体PPARγ转录活性,抑制转录因子elk-1的转录激活。在细胞水平,香菇-β葡聚糖可下调LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7细胞中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS基因的过表达;降低LPS诱导RAW264.7细胞中β38,JNK及ERK1/2的磷酸化水平;促进过氧化物酶体增殖剂激活受体PPARy转录活性,抑制转录因子elk

关键词：香菇-β葡聚糖炎症性结肠炎炎症因子 MAPKs PPARγ elk-1

EPHB6受体型酪氨酸蛋白激酶对ERK信号通路的调控效应

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第四军医大学学报 2009年第19期30卷 1864-1867页

作者：铁茹陈宝莹刘利兵陈健康张学策周幸春曲萍黄小军于军第四军医大学基础部基础医学教学实验中心陕西西安710033 第四军医大学唐都医院放射科陕西西安710038

目的:探讨促红细胞生成素产生肝细胞B6(EPHB6)对于胞外信号调节激酶(ERK)信号转导通路的作用.方法:以非小细胞肺癌细胞系A549作为研究对象,采用Western Blot法检测ERK的磷酸化水平及通路检测(PathDe-tect)法检测ERK下游分子和Ets结构域... 详细信息

目的:探讨促红细胞生成素产生肝细胞B6(EPHB6)对于胞外信号调节激酶(ERK)信号转导通路的作用.方法:以非小细胞肺癌细胞系A549作为研究对象,采用Western Blot法检测ERK的磷酸化水平及通路检测(PathDe-tect)法检测ERK下游分子和Ets结构域蛋白1(elk-1)转录因子的活性.结果:A549细胞中EPHB6的表达导致ERK的磷酸化.相反,siRNA干涉EPHB6的表达可以逆转ERK的磷酸化.并且,EPHB6导致的ERK磷酸化与elk-1转录因子脱偶联.结论:表明EPHB6对于ERK信号通路具有调控作用.

关键词： EPHB6 受体型酪氨酸蛋白激酶非小细胞肺癌细胞外信号调节激酶有丝分裂原蛋白活化激酶 elk-1

elk-1与原发性高血压大鼠左心室重构关系的研究

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中国医药指南 2013年第13期11卷 73-74页

作者：杰吉甫杨志刚新疆库尔勒市巴音郭勒蒙古族自治州卫生学校解剖教研室新疆巴州841000 北方民族大学管理学院甘肃银川750004

目的研究elk-1在原发性高血压大鼠(SHR)左心室的表达情况,探讨elk-1与高血压左心室重构的关系。方法对比观察各周龄SHR大鼠与WKY大鼠血压,心脏/体质量比值变化;RT-PCR方法检测左心室elk-1的表达。结果在整个实验过程中,WKY血压保持在正... 详细信息

目的研究elk-1在原发性高血压大鼠(SHR)左心室的表达情况,探讨elk-1与高血压左心室重构的关系。方法对比观察各周龄SHR大鼠与WKY大鼠血压,心脏/体质量比值变化;RT-PCR方法检测左心室elk-1的表达。结果在整个实验过程中,WKY血压保持在正常水平,24周龄SHR组尾动脉收缩压明显高于同周龄WKY组(Pelk-1含量逐渐增高,24周龄的SHR组含量明显高于同周龄WKY组大鼠(Pelk-1可能对高血压左心室心肌肥厚发展有促进作用。

关键词：高血压左心室肥厚 SHR elk-1