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作者：罗仕永广州医科大学

学位级别：硕士

研究背景:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是最常见的恶性肉瘤,发病人群覆盖各个年龄段,10-20岁这个年龄段发病率最高[1]。据有些学者研究表明其易复发、转移的特性与肿瘤干细胞相关[2,3,4]。近年来,越来越多的学者发现在实体肿瘤中存在着一... 详细信息

研究背景:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是最常见的恶性肉瘤,发病人群覆盖各个年龄段,10-20岁这个年龄段发病率最高[1]。据有些学者研究表明其易复发、转移的特性与肿瘤干细胞相关[2,3,4]。近年来,越来越多的学者发现在实体肿瘤中存在着一类特殊的细胞,这些细胞是顶层次结构的亚群,通过不对称分裂,一方面增加实体肿瘤的大小,另一方面继续保持原有分化、分裂的潜质。这类细胞被称为肿瘤干细胞[5]。根据肿瘤干细胞理论,实体肿瘤是由大量具有易构性和异型性的细胞构成,其中有一小部分细胞处于干细胞生态位中,这种环境包含邻近的支持细胞、刺激细胞、微血管、细胞外基质和可溶性因子,如趋化因子和细胞因子[6]。在骨的干细胞生态位中,干细胞存在于干细胞池中,环境相对密闭,是产生耐药及其他干性特征的主要原因[7]。国内外学者陆续从野生型的各种骨肉瘤干细胞中分离出了骨肉瘤干细胞,并对其进行了一定程度的研究,发现了相关的细胞分子表面标志物,并与非肿瘤干细胞作出了相关的比较,提示骨肉瘤干细胞确实存在,并通过与相关正常组织的干细胞作对比,发现了骨肉瘤干细胞的来源[5,8]。eid3是eid家族中的第三个成员,其作用与抑制细胞分化、翻译等有关。目前有关于eid3基因功能研究的文章仅仅有两篇,其主要作用是抑制细胞分化[9,10]。本课题组通过前期研究,挑选合适的骨肉瘤细胞株作为研究对象,并构建过表达eid3的骨肉瘤稳定转染细胞株,检测eid3基因对骨肉瘤MG-63细胞的影响,结果证明,eid3基因可以使骨肉瘤MG-63细胞增殖、侵袭、耐药等能力增强,而这些增强的能力,据大量文献报道,均与细胞干性相关,结合文献报道的eid3基因的功能,因此,本课题组大胆猜测,eid3基因可增强骨肉瘤MG-63细胞的干性,查阅相关资料后,并未发现有关eid3增强肿瘤细胞干性的报道;后通过长期液体培养,计算其成瘤率,并与野生型骨肉瘤细胞株作对比,并最终证实eid3对骨肉瘤MG-63干性的影响。最后再利用转录组细胞测序初步探索eid3基因影响干性的可能通路,为进一步探讨eid3对肿瘤干细胞的作用机制打下基础。第一部分构建过表达eid3基因的骨肉瘤MG-63细胞株及初步探索其作用研究目的:1.在正常细胞及各种骨肉瘤细胞株中检测eid3的表达情况,挑选研究的细胞株;2.用阿霉素（Doxorubcin,Dox）处理MG-63,检测Dox对eid3表达的影响;3.初步构建过表达eid3的骨肉瘤MG-63细胞株;4.鉴定过表达eid3的骨肉瘤稳定转染细胞株;5.初步探索eid3对骨肉瘤MG-63细胞的作用。研究方法:1.检测各种骨肉瘤细胞株中eid3的表达情况收集BMSC、MG-63、HOS、U2OS细胞,提取蛋白,利用western-blot检测eid3在各个细胞株中的表达情况。***对骨肉瘤MG-63细胞中eid3表达的影响将一定浓度梯度的Dox加入骨肉瘤MG-63细胞中,24h后,提取蛋白,利用western-blot检测eid3在不同浓度诱导下的表达情况。3.慢病毒转染慢病毒购于苏州吉玛基因公司,将各个不同滴度的病毒液与细胞共培养,开始出现荧光后,换成正常培养基,大量扩增后,再用嘌呤霉素（Puromycin）进行筛选,获得初步构建完成的细胞株。4.对初步构建完成的细胞株进行验证4.1利用PT-q PCR技术对初步构建好的细胞在转录水平进行验证收集野生型、空转组、过表达eid3组三种骨肉瘤MG-63细胞,进行荧光定量PCR（q PCR）,检测eid3在各组细胞中的表达量。4.2蛋白印迹法（western-blot）分析收集野生型、空转组、过表达eid3组三种骨肉瘤MG-63细胞,利用western-blot技术测量eid3在各组细胞中的表达情况。***-8法测细胞活性将相同数量的eid3过表达组（实验组）、野生型（对照组）种入96孔板中,分别于第0,1,3,5天用cck-8法测每组的细胞活性。***法测细胞侵袭能力将相同数量的实验组（过表达组OE）、对照组（野生型WT）种入有基质胶的小室中,24h后,取出小室,固定后染色,计每个小室200倍视野下随机5个视野的细胞数。7.细胞耐药性检测收集野生型及过表达eid3组骨肉瘤MG-63细胞,以相同浓度将细胞接种在96孔细胞培养板内,以相同浓度梯度的阿霉素（Doxorubicin,Dox）进行处理,分别于24h、48h用cck-8法测细胞活性,并计算出半数抑制浓度（half inhibitory concentration IC50）。结果:1.在各株骨肉瘤细胞株中,骨肉瘤MG-63细胞的eid3表达量偏高,最终研究对象确定为骨肉瘤MG-63细胞;2.用不同浓度的Dox处理MG-63细胞,eid3蛋白表达量增加,呈浓

关键词：骨肉瘤 eid3 增殖侵袭耐药干细胞

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eid3对人牙周膜干细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响及机制探究

EID3对人牙周膜干细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响及机制探究

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作者：田慧山东大学

学位级别：硕士

实验目的:本实验旨在阐明eid3对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）增殖、凋亡和成骨分化等生物学性能的影响,探究eid3对hPDLSCs成骨分化潜在的作用机制,进一步扩展Hippo/TAZ信号通路在hPDLSCs成骨过程... 详细信息

实验目的:本实验旨在阐明eid3对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）增殖、凋亡和成骨分化等生物学性能的影响,探究eid3对hPDLSCs成骨分化潜在的作用机制,进一步扩展Hippo/TAZ信号通路在hPDLSCs成骨过程中发挥的重要调控作用。实验方法:1、hPDLSCs的分离、培养及鉴定:采用组织块贴壁的方法获取原代细胞,使用流式细胞术对间充质干细胞的表面标志物的表达情况进行鉴定;然后经成骨向和成脂向诱导后检测细胞是否具有多向分化能力;用结晶紫染色检测其是否具有克隆增殖能力。2、敲低和过表达eid3稳定细胞株的构建:筛选干扰效率最好的序列用于包装慢病毒载体;采用携带绿色荧光蛋白的慢病毒感染系统对hPDLSCs进行感染,实验分组为敲低对照（shNC）、敲低组（sheid3）、过表达对照（oeNC）及过表达组（oeeid3）;q-PCR及Western blot验证eid3敲低和eid3过表达的效率。3、敲低和过表达eid3对增殖、凋亡和成骨分化的影响:通过EdU染色和克隆形成实验检测细胞增殖活性;使用流式细胞术分析敲低和过表达eid3对细胞周期和凋亡的影响;通过q-PCR及Western blot检测实验各组细胞增殖、凋亡和成骨相关基因或蛋白水平的变化;进行成骨诱导后,通过碱性磷酸酶和茜素红染色及碱性磷酸酶活性实验确定各组细胞的早期及晚期成骨能力差异。4、eid3通过Hippo/TAZ通路调控hPDLSCs的成骨分化:构建可以稳定敲低和过表达TAZ的细胞株,q-PCR及Western blot验证敲低和过表达TAZ时eid3和成骨相关基因及蛋白的表达差异;过表达TAZ加入BMS进行诱导上调eid3的表达,验证成骨相关基因及蛋白的表达差异。实验结果:1、通过组织块贴壁法成功获取hPDLSDs原代细胞,阳性表达间充质干细胞表面标志物,且具有成骨及成脂多向分化和克隆形成的潜能,表明成功获并培养了hPDLSCs。2、筛选出sieid3-416序列干扰效果最佳,敲低和过表达eid3慢病毒最佳感染条件为MOI=20。q-PCR及Western blot从基因和蛋白水平检测了我们成功构建了敲低和过表达eid3稳定的细胞株。3、敲低eid3后,EdU标记增殖细胞多于对照组,流式细胞术显示处于G2/M期的细胞增多,克隆形成实验显示敲低eid3后形成的细胞集落更多,增殖相关的蛋白水平上调。同时,流式细胞术显示早期凋亡比例下降,凋亡有关的基因及蛋白水平降低。进行成骨诱导后成骨有关的基因及蛋白水平上调,碱性磷酸酶和茜素红染色呈阳性表达,碱性磷酸酶活性明显增加。4、过表达eid3后,EdU标记增殖细胞低于对照组,流式细胞术显示处于G2/M期的细胞降低,克隆形成实验显示过表达eid3后形成的细胞集落减少,增殖有关的蛋白水平下调。流式细胞术显示早期凋亡比例升高,凋亡有关的基因及蛋白水平升高。成骨有关的基因及蛋白水平降低,碱性磷酸酶和茜素红染色呈阴性表达,碱性磷酸酶活性显著降低。5、BMS可以上调hPDLSCs中eid3基因及蛋白水平的含量且具有时间依赖性和剂量依赖性。6、敲低TAZ时,eid3基因及蛋白水平升高,过表达TAZ时,eid3基因及蛋白水平降低;各组成骨分化诱导后,q-PCR及Western blot显示shTAZ组成骨相关基因及蛋白水平降低,而eid3含量升高;oeTAZ组成骨相关基因及蛋白水平升高,而eid3含量下降。过表达TAZ同时加入BMS上调eid3,结果显示BMS可以抑制因过表达TAZ导致的成骨上调,证明eid3调控hPDLSCs成骨变化可能通过Hippo/TAZ信号通路。实验结论:eid3对hPDLSCs的增殖、凋亡和成骨分化发挥负向调控作用,并且对成骨分化的调控是通过Hippo/TAZ介导完成的。

关键词：人牙周膜干细胞 eid3 成骨分化具有PDZ结合基序的转录共激活因子 Hippo/TAZ信号通路

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eid3基因在大肠癌传代细胞mRNA的表达及其克隆

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中国癌症防治杂志 2012年第1期4卷 38-42页

作者：王钦富李志牟红梅徐娜张雪梅韩慧大连大学免疫学研究所大连116622 大连中心医院检验科

目的研究新的大肠癌相关性抗原eid3基因的克隆及其诊断价值。方法用SEREX技术筛选睾丸组织cDNA噬菌体表达文库,发现了一类似于肿瘤抑制基因(E1A基因)的eid3基因(NM_001008394.1),构建原核表达载体pET32k-eid3,IPTG诱导重组eid3蛋白质的... 详细信息

目的研究新的大肠癌相关性抗原eid3基因的克隆及其诊断价值。方法用SEREX技术筛选睾丸组织cDNA噬菌体表达文库,发现了一类似于肿瘤抑制基因(E1A基因)的eid3基因(NM_001008394.1),构建原核表达载体pET32k-eid3,IPTG诱导重组eid3蛋白质的表达,并利用Ni NTA His Bind树脂纯化该重组蛋白质。用RT-PCR技术研究eid3mRNA在正常组织和大肠癌传代细胞的表达。结果经PCR扩增成功获得1002bp的人eid3基因,测序正确。在大肠杆菌中目的蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的10%,SDS-PAGE及Western blot分析显示,其相对分子质量为39000KD,纯化后的6xHiseid3纯度可达92%。通过RT-PCR分析发现,eid3基因在43例大肠癌传代细胞株中有39例阳性,阳性率为90.7%。在正常组织中,除睾丸组织不表达或有极低水平转录外,余均不表达。结论 eid3基因克隆、表达及纯化的成功,为其今后的肿瘤诊断和肿瘤多肽疫苗治疗研究奠定了基础。eid3m RNA表达检测用于诊断大肠癌,可能具有高特异性和高敏感性的特点。eid3蛋白在大肠癌患者中能够诱导机体的抗体免疫应答,可能成为一个新的大肠癌相关性抗原分子,其用于诊断大肠癌的可行性,有待进一步深入研究。

关键词：大肠癌 eid3 克隆 mRNA

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SEREX技术筛选eid3及其表达的实验研究

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大连大学学报 2006年第6期27卷 62-66页

作者：王钦富佟凤芝刘希龙唐玲蒋革河上裕大连大学生物工程学院辽宁大连116622 大连大学附属新华医院辽宁大连116021 日本庆应大学先端医学研究所

[目的]新的大肠癌相关性抗原eid3的基因克隆及其诊断价值研究.[方法]利用大肠癌病人体内血清中所含的对肿瘤抗原产生的特异性抗体筛选睾丸组织cDNA噬菌体表达文库和大肠癌组织cDNA噬菌体表达文库(SEREX),并用RT-PCR技术研究eid3 mRNA在... 详细信息

[目的]新的大肠癌相关性抗原eid3的基因克隆及其诊断价值研究.[方法]利用大肠癌病人体内血清中所含的对肿瘤抗原产生的特异性抗体筛选睾丸组织cDNA噬菌体表达文库和大肠癌组织cDNA噬菌体表达文库(SEREX),并用RT-PCR技术研究eid3 mRNA在正常组织和大肠癌传代细胞表达.[结果]睾丸组织cDNA噬菌体表达文库筛选得到了可以诱导大肠癌病人抗体免疫应答的新抗原eid3基因(Gen-bank NM_001008394.1).它们定位于染色体19q13.2,eid3含1个外显子.通过RT-PCR分析发现,eid3基因在43例大肠癌传代细胞株中,39例阳性,阳性率为90.7%.在正常组织中,除睾丸组织外不表达或有极低水平转录.[结论]eid3 mRNA表达检测用于诊断大肠癌,可能具有高特异性和高敏感性的特点.eid3蛋白被首次发现在大肠癌病人中能够诱导机体的抗体免疫应答,为一个新的大肠癌相关性抗原分子.其功能可能与抑制细胞的恶性增殖相关,并可进一步研究其用于治疗和诊断大肠癌的可行性.

关键词：大肠癌 eid3 SEKEX 基因克隆与表达

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利用Tet-on诱导基因表达系统构建eid3基因真核表达载体及稳定转染细胞株的建立

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广东医学 2018年第18期39卷 2737-2740页

作者：王燕王宇暄刘亚敏张桂强苏文洲郭奇峰华南理工大学附属第二医院鹤洞分院骨科广东广州510380

目的构建类E1A细胞分化抑制因子3(eid3)真核表达载体,并转染人乳腺癌细胞(MCF-7),建立Tet-on诱导表达的目的基因eid3的稳定转染细胞系。方法应用PCR技术,得到目的基因eid3的c DNA,通过双酶切、胶回收方法纯化目的片段eid3。DNA重组技术... 详细信息

目的构建类E1A细胞分化抑制因子3(eid3)真核表达载体,并转染人乳腺癌细胞(MCF-7),建立Tet-on诱导表达的目的基因eid3的稳定转染细胞系。方法应用PCR技术,得到目的基因eid3的c DNA,通过双酶切、胶回收方法纯化目的片段eid3。DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体p LVuTight-Puro,经菌落酶切、电泳以及测序鉴定。将真核表达质粒p LVu-Tight-Puro-eid3和p LVX-Tet-On Advanced Vector转染MCF-7细胞,分别通过G418和嘌呤霉素选择培养,建立由四环素(doxycycline,DOX)诱导表达的稳定转染细胞系,RT-PCR、Western Blot分别检测目的基因eid3在DOX诱导下mRNA以及蛋白的表达。结果成功构建了p LVu-Tight-Puro-eid3表达质粒,并建立了由DOX诱导表达的稳定转染细胞系,可在DOX诱导下稳定表达eid3基因的mRNA及蛋白。结论人eid3稳定表达细胞系为研究eid3基因在肿瘤辐射敏感性及药物敏感性的作用提供实验基础。

关键词： eid3 MCF-7细胞 Tet-on系统

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达沙替尼对人牙周膜干细胞增殖、成骨能力的作用及机制探讨

达沙替尼对人牙周膜干细胞增殖、成骨能力的作用及机制探讨

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作者：张雅菲山东大学

学位级别：硕士

实验目的:本研究目的在于观测达沙替尼对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化能力的作用效果,并于分子水平探讨其可能存在的调控机制。实验方法:1、组织块贴壁法获取人牙周膜干细胞,流式细胞术检测其表面间充质干细胞标记物表达情况,结晶紫染... 详细信息

实验目的:本研究目的在于观测达沙替尼对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化能力的作用效果,并于分子水平探讨其可能存在的调控机制。实验方法:1、组织块贴壁法获取人牙周膜干细胞,流式细胞术检测其表面间充质干细胞标记物表达情况,结晶紫染色检测其克隆性增殖能力,综上判断其是否是间充质来源干细胞。2、茜素红染色检测细胞体外成骨诱导分化能力,油红O染色观察成脂诱导下脂滴形成情况,综上判断其是否具有多向分化潜能。3、CCK-8细胞活性检测技术检测梯度浓度达沙替尼对人牙周膜干细胞增殖活性的影响;细胞学显微镜下观察梯度浓度达沙替尼对人牙周膜干细胞细胞形态的影响;qRT-PCR及Western Blot技术检测增殖及凋亡相关因子(Erk、Akt、Bc12等)的表达变化情况。4、ALP染色和茜素红染色鉴定梯度浓度达沙替尼对人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响;Western Blot技术检测成骨相关指标(COL-1、RUNX2)以及eid3的表达变化情况。5、Western Blot技术检测成骨诱导前后eid3的表达变化情况。6、慢病毒转染构建特异性敲低eid3的人牙周膜干细胞模型,荧光显微镜下观察其转染情况,Western Blot技术检测其干扰效率。7、ALP染色和茜素红染色观察比较特异性敲低eid3对达沙替尼诱导下人牙周膜干细胞成骨向分化能力的影响;Western Blot技术检测成骨相关指标(COL-1、RUNX2)的表达变化情况。实验结果:1、所获得的细胞群是源于间充质的、具有优秀增殖活性和多向分化潜能的hPDLSCs,符合后续研究需求。2、达沙替尼对人牙周膜干细胞增殖活性的影响呈浓度依赖性和时间相关性,500nM以上浓度会严重损害人牙周膜干细胞的增殖能力。3、达沙替尼对人牙周膜干细胞成骨分化能力的作用效果与浓度呈负相关。1nM浓度达沙替尼表现为促进成骨分化现象,高于5nM浓度时转为抑制其早期成骨指标表达,以RUNX2较为明显。10nM浓度以上才会表现出碱性磷酸酶及钙盐沉积的明显减少。4、eid3参与人牙周膜干细胞的成骨分化进程,并于其中发挥负向调控作用。特异性干扰eid3后可观察到成骨指标的上调。5、eid3参与高浓度(10nM)达沙替尼调控的人牙周膜干细胞成骨分化改变,特异性干扰eid3后可观察到,10nM达沙替尼下的抑制成骨效果有所缓解。实验结论:达沙替尼对人牙周膜干细胞增殖与成骨分化能力的影响呈浓度依赖性。低浓度下的达沙替尼对人牙周膜干细胞的增殖活性及成骨分化有促进作用。eid3可负向调节人牙周膜干细胞的分化,且参与调控高浓度下达沙替尼对人牙周膜干细胞的成骨抑制。

关键词：达沙替尼 eid3 成骨分化人牙周膜干细胞

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