检索结果-南通市图书馆

作者：谷嵩中国农业科学院

学位级别：硕士

随着石化能源等不可再生资源的日益枯竭，人们试图寻找可以代替石化燃料的新型能源。利用纤维素酶将纤维素降解为简单糖，进而发酵生产乙醇，为新能源的开发提供了一个新方法。本研究针对福寿螺(Ampullaria crossean)内源性多功能纤维... 详细信息

随着石化能源等不可再生资源的日益枯竭，人们试图寻找可以代替石化燃料的新型能源。利用纤维素酶将纤维素降解为简单糖，进而发酵生产乙醇，为新能源的开发提供了一个新方法。本研究针对福寿螺(Ampullaria crossean)内源性多功能纤维素酶基因egx(Gene Bank Accession ***285999)，以蛋白质二级结构α螺旋和β折叠为单位进行末端缺失，利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达末端缺失蛋白片段，研究蛋白N端及C端α螺旋和β折叠的缺失对内切-β-1,4-葡萄糖苷酶(E.C.3.***.1.4)、外切-β-1,4-葡萄糖苷酶(E.C.3.***.9.11)、内切-β-1,4-木聚糖酶(E.C.3.***.1.8)活力的影响，研究其作用机理，为酶分子的蛋白质工程改造提供理论依据。根据egx cDNA全长序列，设计了7对引物5-1、5-2、5-3、5-4、5-5、3-1、3-2，用于PCR扩增末端缺失的基因片段。以egx基因cDNA全长序列为模版，分别得到1132bp、1089bp、1056bp、891bp、828bp、1044bp、921bp片段，插入载体pPIC9K，转化巴斯德毕赤酵母GS115，甲醇诱导表达获得7种末端缺失蛋白：5-1(N端缺失一个α螺旋)、5-2(N端缺失α螺旋-β折叠)、5-3(N端缺失α螺旋-β折叠-α螺旋)、5-4(N端缺失α螺旋-β折叠-α螺旋-β折叠)、5-5(N端缺失α螺旋-β折叠-α螺旋-β折叠-α螺旋)、3-1(C端缺失4个β折叠)、3-2(C端缺失4个β折叠-2个α螺旋)。完成了7种蛋白的内切-β-1,4-葡萄糖苷酶、内切-β-1,4-木聚糖酶、外切-β-1,4-葡萄糖苷酶活性测定。研究结果表明，5-1的内切-β-1,4-葡萄糖苷酶、内切-β-1,4-木聚糖酶、外切-β-1,4-葡萄糖苷酶活性与egx全长蛋白近似。5-2的内切-β-1,4-木聚糖酶活性与egx全长蛋白近似，内切-β-1,4-葡萄糖苷酶、纤外切-β-1,4-葡萄糖苷酶活性与egx全长蛋白相比活性下降很多。5-3、5-4、5-5、3-1、3-2的外切-β-1,4-葡萄糖苷酶、内切-β-1,4-木聚糖酶、外切-β-1,4-葡萄糖苷酶活性很微弱。 N末端第一个β折叠到C端之间序列的完整性对内切-β-1,4-葡萄糖苷酶、外切-β-1,4-葡萄糖苷酶活性是重要的。N端第二个α螺旋至C段之间序列的完整性对内切-β-1,4-木聚糖酶活性也是非常必要的。在研究过程中，得到了3段EST序列，它们的蛋白序列分别含有vWFAubfaminlyCM，Peptidase41，FN3结构域。

关键词：纤维素酶 egx 末端缺失

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纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C的构建、表达与活性研究

纤维素酶嵌合体EGX-Gluc1C的构建、表达与活性研究

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作者：陈玲玲武汉大学

学位级别：硕士

植物中的木质纤维素类物质含有大量能量,而且这些生物质是地球上最丰富的碳源,纤维素转化可能提供一种新的并且可选择的能源获取方式。由于纤维素分子本身的复杂性和商业化纤维素酶的限制,目前这部分资源尚未得到充分的开发利用。木质... 详细信息

植物中的木质纤维素类物质含有大量能量,而且这些生物质是地球上最丰富的碳源,纤维素转化可能提供一种新的并且可选择的能源获取方式。由于纤维素分子本身的复杂性和商业化纤维素酶的限制,目前这部分资源尚未得到充分的开发利用。木质纤维素转化为生物酒精的过程中,鉴定并设计高效的纤维素酶一直是这项研究的重中之重,因为这涉及到降低纤维素酶应用的工业成本问题。Gluc1C是从棉铃虫肠道菌中分离得到的一种高效糖苷水解酶。β-糖苷水解酶由448个氨基酸组成,包含糖苷水解酶GH superfamily 1结构域。Gluc 1C能够水解超过五个糖单元支链的纤维糊精,对纤维二糖有目前报道的最强的水解活力。egx是从福寿螺中分离得到的一种多功能纤维素酶,它同时具有外切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-1,4-木聚糖酶活性。本研究设计和构建了一种由β-糖苷水解酶Gluc1C和多功能纤维素酶egx融合而成纤维素酶嵌合体 egx-Gluc1C。本研究构建了含有egx和Gluc1C的纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C基因,egx和Gluc1C通过柔性的多肽序列（G4S）3连接。将纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C基因、Gluc1C和egx分别插入表达载体pGEX-6P-1,构建了重组表达质粒 pGEX-6P-1-egx-Gluc1C、pGEX-6P-1-egx 和 pGEX-6P-1-Gluc1C。在大肠杆菌中分别表达了含有GST的纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C,以及Gluc1C、egx的重组融合蛋白。SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色结果显示三个蛋白大部分以包涵体的形式表达,但是上清中也有部分可溶蛋白表达。我们首先用Gluc1C的包涵体蛋白样品制备了抗Gluc1C的血清,经过Western验证,血清中的抗体对Gluc1C和嵌合体识别特异性很高。由于三个蛋白表达过程中可溶性不是很好,因此我们优化了蛋白的表达条件,降低了培养温度,降低了 IPTG的添加浓度。采用GST-Resin方法,纯化获得重组融合蛋白Gluc1C、egx、纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C。采用3,5-二硝基水杨酸法,测定了 egx和纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C的滤纸酶活性。egx的滤纸酶活性为12.4U/mg,纤维素酶嵌合体Gluc1C的滤纸酶活性为19.84U/mg。纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C的滤纸酶活性是egx的1.67倍。采用羧甲基纤维素（CMC）糖化力法,测定了 Gluc1C和纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C的CMC酶的活性。Gluc1C的β-糖苷水解酶活性为5.1 U/mg,纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C的β-糖苷水解酶活性为7.7 U/mg。纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C的β-糖苷水解酶活性是Gluc1C的1.5倍。纤维素的降解需要多种纤维素酶协同作用,如果能够使用一个表达系统同时表达纯化两种甚至多种纤维素酶,可以降低工业生产中酶的经济投入。本研究构建了纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C基因,表达了具有生物活性的纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C,其活性高于单一 egx的滤纸酶活性和Gluc1C的β-糖苷水解酶活性。该嵌合体的研究和应用能够有效提高生物质向生物能源的转化,为进一步研究新型的纤维素酶制剂提供了依据。

关键词：纤维素酶 egx Gluc1C 嵌合体egx-Gluc1C 滤纸酶活性 β-糖苷水解酶活性

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纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C的构建与表达

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安徽农业科学 2018年第1期46卷 102-104页

作者：陈玲玲徐进平武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室湖北武汉430072

[目的]设计和构建一种由β-糖苷水解酶Gluc1C和多功能纤维素酶egx融合而成的纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C。[方法]首先构建了嵌合体的质粒,采用GST标准纯化方法,分别获得重组蛋白Gluc1C、egx、纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C,并且制备了抗Gluc1... 详细信息

[目的]设计和构建一种由β-糖苷水解酶Gluc1C和多功能纤维素酶egx融合而成的纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C。[方法]首先构建了嵌合体的质粒,采用GST标准纯化方法,分别获得重组蛋白Gluc1C、egx、纤维素酶嵌合体egx-Gluc1C,并且制备了抗Gluc1C的血清。[结果]通过GST纯化的3个蛋白纯度达90%,可以进行后续的酶活检测;通过Western blot验证,发现抗Gluc1C的血清效价很高(稀释比例达1∶5 000)。[结论]该研究可为纤维素酶的工业化应用提供一定理论依据。

关键词：纤维素酶 egx GluclC 抗体纤维素酶嵌合体

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福寿螺 (Ampullaria crossean)内源性多功能纤维素酶基因的克隆(英文)

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生物化学与生物物理学报 2003年第10期35卷 941-946页

作者：王骥丁明李燕红陈清西许根俊赵辅昆中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室上海200031

迄今为止已克隆的动物纤维素酶基因都是编码内切 β 1,4 葡聚糖酶或β 葡萄糖苷酶的 ,还没有有关动物外切 β 1,4 葡聚糖酶基因的报道。并且 ,动物是否对植物细胞壁的另一主要成分木聚糖具有水解能力也依然是个疑问。已经由草食性软体... 详细信息

迄今为止已克隆的动物纤维素酶基因都是编码内切 β 1,4 葡聚糖酶或β 葡萄糖苷酶的 ,还没有有关动物外切 β 1,4 葡聚糖酶基因的报道。并且 ,动物是否对植物细胞壁的另一主要成分木聚糖具有水解能力也依然是个疑问。已经由草食性软体动物福寿螺的胃液中纯化得到一种纤维素酶 ,该酶同时具有外切 β 1,4 葡聚糖酶、内切 β 1,4 葡聚糖酶和内切 β 1,4 木聚糖酶等三种活性 ,是一种多功能纤维素酶 (命名为egx)。在此基础上 ,从福寿螺胃组织中克隆得到的egxcDNA开放阅读框全长为 1185bp ,共编码 395个氨基酸。由氨基酸顺序同源和活性部位的保守顺序的比较分析 ,egx可归属于糖苷水解酶第10家族。该多功能纤维素酶cDNA在毕赤酵母 (Pichiapastoris)中表达的产物具有水解外切 β 1,4 葡聚糖酶底物 (pNPC) ,羧甲基纤维素 (内切 β 1,4 葡聚糖酶的底物 )和木聚糖 (木聚糖酶的底物 )的活力。另外也从福寿螺卵巢组织中获得编码福寿螺多功能纤维素酶egx基因 ,长度为 4 892bp ,含有 9个外显子和 8个内含子。8个内含子分别位于开放阅读框的 74bp、12 2bp、2 80bp、336bp、4 73bp、6 4 6bp、75 3bp和 972bp处。以上结果证明了多功能纤维素酶egx是福寿螺自身产生的 ,同时也证明了福寿螺具有与微生物相似的纤维素?

关键词：多功能纤维素酶 egx 基因克隆福寿螺(Ampullaria crossean)

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