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系统代谢工程改造大肠杆菌产丙酮酸的研究

系统代谢工程改造大肠杆菌产丙酮酸的研究

作者：陈若楠北京化工大学

学位级别：硕士

丙酮酸广泛应用于制药、日化和食品行业,近年来国内市场的需求逐步增加。生物技术法生产丙酮酸的研究较多,已经初步构建了一些丙酮酸合成菌株。然而,目前微生物发酵产丙酮酸仍存在一些问题,如后期添加维生素、胞内NADH/NAD+不平衡等。... 详细信息

丙酮酸广泛应用于制药、日化和食品行业,近年来国内市场的需求逐步增加。生物技术法生产丙酮酸的研究较多,已经初步构建了一些丙酮酸合成菌株。然而,目前微生物发酵产丙酮酸仍存在一些问题,如后期添加维生素、胞内NADH/NAD+不平衡等。本论文利用系统代谢工程的方法对大肠杆菌进行定向改造,进一步强化丙酮酸生产能力。本论文利用的出发菌株***211已删除了多条丙酮酸代谢路径。通过转录组分析,研究了出发菌株与野生型大肠杆菌的转录组水平差异,发现丙酮酸代谢的途径减弱、三羧酸循环上调,大量的NADH积累,这将抑制糖酵解,不利于丙酮酸合成。为了降低胞内NADH/NAD+水平,利用高拷贝质粒表达来自***的外源NADH氧化酶NoxE,构建菌株YP301。发酵结果显示,较YP211菌体生长提高42.6%,丙酮酸产量提高17.4%,得率提高不明显。接着,研究不同还原态碳源的NADH/NAD+水平调控对丙酮酸合成的影响,发现以葡萄糖酸钠为碳源时较以葡萄糖为碳源的丙酮酸产量提高了 22.9%。转录组分析结果显示,葡萄糖酸盐在胞内代谢激活了ed途径,使得形成丙酮酸的碳代谢流向反应步骤更少、产生NADH更少的ed途径。然而,葡萄萄酸钠成本过高,不适宜作发酵底物,因此通过大肠杆菌中心碳代谢的改造,激活葡萄糖为碳源情况下的ed途径,将进一步降低发酵成本。首先删除pfkA(弱化EMP途径),高拷贝质粒表达eddeda(强化ed途径)构建了菌株YP203。与YP211相比,产量提高39.7%,生产速率提高67.4%。为了保持菌株稳定性,利用合成生物学方法设计ed途径关键基因edd的核糖体结合位点RBS强化ed途径,将翻译起始速度提高了 100倍,构建菌株YP501。与YP211相比,产量提高35.7%,生产速率提高34.8%。与仅通过高拷贝质粒过表达edd的菌株YP401相比,产量提高了 17.3%,生产速率提高了 47.6%。

关键词：丙酮酸转录组分析 NADH/NAD+水平 ed途径系统代谢工程

胡萝卜软腐果胶杆菌致病关键基因eda的功能研究

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胡萝卜软腐果胶杆菌致病关键基因eda的功能研究

作者：张鹏飞南京农业大学

学位级别：硕士

胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum ***,Pcc)是重要的植物病原菌。Pcc的主要致病因子为果胶酶,蛋白酶,纤维素酶等细胞壁降解酶,其中果胶酶尤为重要。在世界范围内,该病原菌可以侵染多种植物,造成严重经济损失,深入其致病... 详细信息

胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum ***,Pcc)是重要的植物病原菌。Pcc的主要致病因子为果胶酶,蛋白酶,纤维素酶等细胞壁降解酶,其中果胶酶尤为重要。在世界范围内,该病原菌可以侵染多种植物,造成严重经济损失,深入其致病机制研究,有助于制定有效防控对策。本实验室前期研究发现当Pcc与黄花马蹄莲(Zanteschia elliotiana)活体互作时 6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose-6-phosphate l-dehydrogenase,Zwf,PC1832)会上调表达。与野生型菌株PccSl相比,zwf基因插入(同源单交换)突变体的致病力显著降低,而zwf基因缺失(同源双交换)突变体的致病力与野生型一致,其下游基因eda缺失突变体致病力显著降低,果胶酶外泌降低,果胶酶基因转录水平下调,同时不能利用二碳作为唯一碳源。eda基因(PC1833)编码蛋白eda(2-酮-3-脱氧-6-磷葡萄糖酸醛缩酶2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase)。在细菌中,eda 是胞内果胶降解途径以及ed(Entner-Doudoroff)碳代谢途径的关键酶之一。本研究主要为了探究zwf与eda的关系以及eda与Pcc致病力的相关性。通过实验发现,PccS1的zwf单交换突变体中eda的表达量明显下调,同时eda回补zwf单交换突变体致病力可以恢复,表明zwf单交换突变体的致病力下降是由于载体插入影响了 e而基因的表达。2-酮-3-脱氧葡萄糖酸激酶(2-dehydro-3-deoxygluconokinase,KdgK,PC1086)与 eda 均为胞内果胶代谢的关键酶,代谢途径中KdgK在eda上游,然而对基因kdgK缺失突变后对致病性并没有明显影响,说明△eda致病性的降低与果胶代谢途径无关。乙醛酸循环是利用乙酸为唯一碳源所必须的途径,其中包括三个关键酶,异柠檬酸脱氢酶激酶(Isocitrate dehydrogenase kinase,AceK,PC 1777),异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,AceA,PC1778),苹果酸合酶A(malatesynthaseA,AceB,PC1779),其中aceA和aceB直接参与乙醛酸循。aceK,aceA和aceB的缺失突变体均不能利用乙酸钠为唯一碳源,eda突变体的乙醛酸途径的三个关键酶表达量均明显下调,表明突变体△eda是通过影响乙醛酸循环的关键酶的表达而影响对二碳的利用。然而致病性方面aceA和aceB均不影响致病性,只有aceK影响,说明△eda是通过影响aceK的表达来影响致病性。通过比较PccS 1与近缘种菌胡萝卜软腐果胶杆菌黑胫亚种(Pectobcterium atrosepticum,Pba)全基因组,发现PccS 1中缺乏ed途径中另一个关键酶edd。将Pba的eda基因互补到△eda中发现可以恢复其致病性,说明二者的具有较高的同源性。同时将Pba的edd基因克隆到PccS1中,可以实现ed代谢途径功能的恢复,而对其致病性没有影响,说明ed途径在软腐果胶杆菌中参与了碳代谢而与致病性没有直接关联。通过Co-IP筛选eda的互作蛋白、酵母双杂验证表明,eda可以自身发生互作,说明eda可能通过形成聚合体发挥其功能。此外,致病力测定结果表明:PccS1的eda缺失,在有氧条件下致病力丧失,而无氧条件下对不影响PccS1的致病力,其机制有待进一步研究。综上所述,Pcc中eda与zwf共转录,zwf的插入突变体通过影响了 eda的表达从而影响致病性。而eda则通过影响乙醛酸循环的关键酶影响对二碳的利用,并且通过影响aceK的表达影响了致病性。eda的突变体在无氧条件下可以正常发病,同时eda蛋白自身可以互作形成聚合体。另外,我们证明ed途径和致病性并没有直接的关系,而eda本身与致病相关。

关键词：胡萝卜软腐果胶杆菌 eda 致病性互作蛋白 ed途径乙醛酸循环

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类球红细菌中葡萄糖跨膜转运与代谢的研究

类球红细菌中葡萄糖跨膜转运与代谢的研究

作者：高丹天津科技大学

学位级别：硕士

糖类物质作为一种碳水化合物,为生物体提供重要的营养和能量。葡萄糖作为一种单糖,在工业生产中应用最为广泛。细胞对葡萄糖的转运和代谢制约着菌体生长和目的产物得率,从而影响工业生产的成本和效率。类球红细菌富含多种营养药用成分,... 详细信息

糖类物质作为一种碳水化合物,为生物体提供重要的营养和能量。葡萄糖作为一种单糖,在工业生产中应用最为广泛。细胞对葡萄糖的转运和代谢制约着菌体生长和目的产物得率,从而影响工业生产的成本和效率。类球红细菌富含多种营养药用成分,在食品、医药领域具有较高的应用潜力,但该菌在葡萄糖基质中生长缓慢。目前,对于类球红细菌的葡萄糖代谢已有相关研究,但其转运机制尚不清楚。本论文以类球红细菌2.4.1(Rhodobacter sphaeroies 2.4.1)为研究对象,旨在阐明葡萄糖跨膜转运机制,提高葡萄糖代谢速率。主要研究结果如下:(1)葡萄糖跨膜转运相关基因的检索及功能预测。通过检索NCBI中类球红细菌2.4.1全基因组序列,发现与葡萄糖跨膜转运相关的两个基因:glk和fruA,分别编码非磷酸转移系统(non-PTS)的葡萄糖激酶(Glk)和磷酸转移系统(PTS)的蛋白EIIBC。(2)glk和fruA基因功能的研究。通过对Δglk、ΔfruA、ΔglkΔfruA与野生型的表型及摇瓶发酵结果分析:在以葡萄糖为唯一碳源的SMM平板上,突变株ΔfruA长势和野生型没有明显差异,Δglk和ΔglkΔfruA长势较弱。摇瓶发酵结果表明,在对数生长期前期,野生型生长较快;在对数生长期中后期,ΔfruA生长最快,Δglk和ΔglkΔfruA生长明显受到抑制。现象表明,类球红细菌葡萄糖跨膜转运需要依赖PTS和non-PTS系统的共同作用,其中Glk对跨膜转运作用关键。(3)葡萄糖其它跨膜转运途径的探索。突变株ΔglkΔfruA仍能在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中缓慢生长,推测存在其它跨膜转运途径。经生物信息学分析,葡萄糖进入类球红细菌2.4.1周质空间后,可能经葡萄糖脱氢酶(Rsp-2673编码)作用生成葡萄糖酸进入细胞内。实验通过无痕敲除,获得突变株ΔRsp-2673,ΔfruAΔRsp-2673,ΔglkΔfruAΔRsp-2673和ΔglkΔRsp-2673,与野生型进行表型和摇瓶发酵分析发现,该途径对类球红细菌葡萄糖跨膜转运影响微弱,其中ΔfruAΔRsp-2673生物量最大。(4)葡萄糖跨膜转运与代谢的强化。实验以ΔfruAΔRsp-2673为出发菌株,分别构建了glk、edd、***和***基因的过表达菌株。结果表明:强化non-PTS系统,过表达glk的菌株生长明显受到抑制;强化ed途径,过表达edd的菌株葡萄糖代谢速率有所提高,但前期生长较慢;强化跨膜转运,过表达galPEcoli的菌株葡萄糖代谢速率极大提高,并且获得较大生物量。最终,本论文对ΔfruAΔRsp-2673-GalP/OP进行摇瓶发酵分析,其生物量较野生型提高70%,耗糖速率提高65%。

关键词：葡萄糖激酶 PTS系统葡萄糖脱氢酶 ed途径半乳糖转运蛋白类球红细菌

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果胶杆菌中eda酶参与致病调控的机制研究

果胶杆菌中Eda酶参与致病调控的机制研究

作者：聂韦华南京农业大学

学位级别：硕士

果胶杆菌是重要的植物病原细菌,其能够侵染多种经济作物及园艺作物,在世界各国都有严重发生与流行的报道。该病原菌在种植和贮藏过程中会导致植物组织和器官腐烂,严重威胁产量和采后品质,造成了巨大经济损失。这类病原菌多属于肠杆菌科... 详细信息

果胶杆菌是重要的植物病原细菌,其能够侵染多种经济作物及园艺作物,在世界各国都有严重发生与流行的报道。该病原菌在种植和贮藏过程中会导致植物组织和器官腐烂,严重威胁产量和采后品质,造成了巨大经济损失。这类病原菌多属于肠杆菌科,故常被成为软腐肠杆菌(Soft Rot Enterobacteriaceae,SRE),其中,果胶杆菌属(Pectobacterium)和迪克氏菌属(Dickeya)最为常见。这些病原菌寄主范围广、分布于世界各地,尚缺乏有效的防治手段。果胶杆菌致病机理一直是国际植物病理学的研究热点,这方面的研究结果为防控对策研究提供了理论依据。实验室前期研究表明胡萝卜果胶杆菌(*** ***,Pcc)和黑胫果胶杆菌(***,Pba)中Entner-Doudoroff途径(ed途径)关键酶:2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase,eda)编码基因缺失突变后,与野生型相比,致病力显著降低;分别以果胶分解产物半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸和丙酮酸为碳源,Pcc和Pba的eda基因缺失突变株只有在丙酮酸为碳源时才能正常生长,表明eda决定了果胶杆菌对果胶的利用,进而对致病力产生影响,但是,eda如何影响对果胶的利用,是否通过其它途径对致病力产生影响尚不清楚,为此,本研究从果胶杆菌中eda的活性分析入手,比较其底物积累对果胶代谢相关基因表达的影响,同时,寻找eda的互作蛋白,挖掘可能存在的其它致病调控路径。为了分析eda酶活性与果胶杆菌致病力的相关性,本研究首先通过将编码的果胶杆菌片段外源表达在大肠杆菌BL21,获得纯化的eda酶;在建立丙酮酸含量测定标准曲线基础上,以2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(KDPG)为底物,分析反应体系中丙酮酸(Pyruvate)含量,表征eda的活性,并测定了eda酶的理化参数,包含最适反应温度与p H值,以及酶促反应的米氏常数Km值等;在丙酮酸培养体系中添加0.00774434mmol/L的KDPG,获得Pba野生菌株的致病力比对照菌株下降约10%,q RT-PCR分析结果表明Pba野生菌株的果胶代谢相关酶的编码基因在转录水平大部分下调表达,仅有peh A呈上调趋势;ΔPcc S1＿eda外源添加eda并不改变突变菌株致病性,可能是外源添加eda酶对胞内KDPG浓度未产生影响。表明KDPG对果胶代谢存在反馈抑制,可能是eda缺失后致病力下降的原因。为了寻找eda的互作蛋白,挖掘其可能参与的致病调控路径。CO-IP分析结果表明Sec B、Omp X、Fts Z、Kdg K、Ssb、Pfl B、Rpm A、Pps A、Rpl C、Pep D、Fab L、Glp K、Sfc A等蛋白可能与eda互作,从中选择互作可能性较大的蛋白进行细菌双杂交互作验证,发现eda与Fts Z、Kdg K、Pfl B、Rpm A、Ssb、Fab L、Glp K、Sfc A互作,但是,GST pull-down验证结果发现这些蛋白均与eda不直接互作,表明eda与致病关键因子的调控没有直接影响。综上所述,eda作为果胶代谢产物进入糖代谢途径的唯一中转枢纽,eda突变导致底物KDPG累积,KDPG反馈抑制果胶代谢相关酶的活性,进而抑制致病力。eda能否作为作用靶点,研发对靶抑制剂,有待进一步研究。

关键词：果胶杆菌 ed途径 eda酶致病性蛋白互作

野油菜黄单胞菌2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因的突变分析

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广西农业生物科学 2008年第4期27卷 349-353页

作者：谭旖宁彭方印安世琦陆光涛何勇强唐纪良广西大学生命科学与技术学院广西南宁530005 广西职业技术学院广西南宁530227 广西亚热带生物资源保护利用重点实验室广西南宁530005

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种是发酵工业生产黄原胶的菌种,通过对Xcc8004菌株全基因组序列进行搜索,发现该菌株拥有完整的ed、EMP、HMP等糖代谢途径。为评估ed途径对细胞功能的影响,选择基因组中编码ed途径的关键酶——2-酮-3-脱氧-6-... 详细信息

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种是发酵工业生产黄原胶的菌种,通过对Xcc8004菌株全基因组序列进行搜索,发现该菌株拥有完整的ed、EMP、HMP等糖代谢途径。为评估ed途径对细胞功能的影响,选择基因组中编码ed途径的关键酶——2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因eda进行诱变,构建非极性突变体。通过对突变体表型进行分析,发现eda基因的突变体在培养基中能够正常生长繁殖,但其胞外多糖产量则降低77.6%。用一段包含eda基因的DNA片段对突变体进行功能互补,能基本恢复胞外多糖产量。这表明eda基因对细胞合成胞外多糖有重要影响,也暗示ed途径对细胞生长是非必要的,而对细胞大量合成胞外多糖是必须的。

关键词：野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 ed途径 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶胞外多糖