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集胞藻PCC6803中ecfσ因子在胁迫条件下的功能分析

集胞藻PCC6803中ECFσ因子在胁迫条件下的功能分析

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作者：丁清龙华南理工大学

学位级别：硕士

生物体具有环境适应性的分子机理是细胞感受环境胁迫(逆境),通过一系列信号传导机制将信号传递到胞内,使细胞在基因水平、蛋白水平和代谢水平响应,从而在环境胁迫中更好地生存。在细胞信号传导过程中,胞外功能性σ因子(Extra cytoplasmi... 详细信息

生物体具有环境适应性的分子机理是细胞感受环境胁迫(逆境),通过一系列信号传导机制将信号传递到胞内,使细胞在基因水平、蛋白水平和代谢水平响应,从而在环境胁迫中更好地生存。在细胞信号传导过程中,胞外功能性σ因子(Extra cytoplasmic functionσ,ecfσ因子)具有重要作用。ecfσ因子是一类参与跨膜信号传导的σ因子。细胞感应膜外胁迫信号后可以在细胞内释放被束缚的ecfσ因子,后者直接参与基因转录。集胞藻PCC6803是研究胁迫响应的模式生物,其基因组中含有3个ecfσ因子:sigG(slr1545)、sigH(sll0856)和sigI(sll0687),它们在胁迫响应中的功能未知。本文用不同的敲除策略构建了13株△sigI突变体,然后研究了△sigI突变体和△sigH突变体(前人构建)在特定胁迫条件下的表型,得出如下结论:(1)研究了△sigI突变体在1.5%(v/v)乙醇胁迫下的生理表型发现,与野生型相比,△sigI突变体对乙醇胁迫有更好的耐受性,说明sigI在集胞藻PCC6803耐受乙醇胁迫过程中有特殊作用。(2)通过高通量测序的方法对实验室从ATCC27184中分离的集胞藻PCC6803野生型藻株GT-G的基因组进行测序,发现了8个独特的突变位点,其中的5个非同义突变可能对其表型会产生影响。(3)通过研究葡萄糖混养△sigH突变体在不同光条件下的生理表型发现,在混养条件下△sigH突变体的生长速率和利用葡萄糖的速率比野生型慢,混养状态的△sigH突变体中的光合作用相关色素含量比野生型低。同时,在高光条件下,野生型的生长速率和利用葡萄糖的速率加快,而△sigH突变体的生长速率和利用葡萄糖的速率减慢。这些表型说明了sigH在集胞藻PCC6803的混养生长中起重要作用,且这种作用与光照强度有关系。(4)通过研究△sigH突变体在冷胁迫下的表型,发现△sigH突变体在高光条件的冷胁迫下生长会受到抑制,但在正常光下△sigH突变体的生长与野生型无差异,说明了sigH在集胞藻PCC6803耐受高光和低温的双胁迫中起重要作用。本研究为探索生物适应环境胁迫的分子机理和开发能够用于生物能源工业化生产的光合自养型基因工程菌奠定了基础。

关键词：集胞藻PCC6803 ecfσ因子乙醇耐受葡萄糖混养冷胁迫

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细菌ecfσ因子介导的转录起始分子机制

细菌ECFσ因子介导的转录起始分子机制

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中国生物化学与分子生物学会第十二届全国会员代表大会暨2...

作者：李玲婷方城力庄宁宁王甜甜张余中科院上海植物生理生态研究所

细菌基因的转录起始由RNA聚合酶和转录起始因子(σ因子)共同协作完成,二者形成复合物结合到基因的启动子DNA区域起始RNA合成。细菌RNA聚合酶通过结合不同的σ因子来实现基因的转录调控。ecfσ因子(ExtraCytoplasmic Functionσfactor)... 详细信息

细菌基因的转录起始由RNA聚合酶和转录起始因子(σ因子)共同协作完成,二者形成复合物结合到基因的启动子DNA区域起始RNA合成。细菌RNA聚合酶通过结合不同的σ因子来实现基因的转录调控。ecfσ因子(ExtraCytoplasmic Functionσfactor)是细菌中广泛存在且种类最为丰富的一类σ因子,然而其调控转录起始的结构基础和分子机制尚未阐明。我们解析了首个细菌RNA聚合酶核心酶与ecfσ因子的复合物晶体结构,以及首个包含细菌RNA聚合酶核心酶、ecfσ因子、启动子DNA、和RNA的转录起始复合物晶体结构。我们阐明了ecfσ因子与RNA聚合酶核心酶的组装机制,揭示了ecfσ因子介导的启动子DNA序列识别以及启动子DNA双链解链形成单链转录泡的分子机制。我们发现ecfσ因子与持家σ因子利用不同的方式实现启动子DNA的序列识别以及启动子DNA双链解链。这些独特的方式赋予了ecfσ因子极其严谨的基因表达调控专一性。

关键词：细菌转录转录调控 RNA聚合酶 ecfσ因子

来源： cnki会议评论

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耐辐射异常球菌Sig1因子的鉴定及其在热激胁迫中的作用

耐辐射异常球菌Sig1因子的鉴定及其在热激胁迫中的作用

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作者：王文涛中国农业科学院

学位级别：硕士

原核生物对于外胞质逆境环境的胁迫应答通常由外胞质功能因子ecf进行调控，ecf是数量最大、种类最多的一类σ因子，归属于σ70家族3。该家族σ因子在保护细菌免受外界逆境环境冲击、调控致病菌分泌蛋白形成以及维持致病菌在巨噬细胞中... 详细信息

原核生物对于外胞质逆境环境的胁迫应答通常由外胞质功能因子ecf进行调控，ecf是数量最大、种类最多的一类σ因子，归属于σ70家族3。该家族σ因子在保护细菌免受外界逆境环境冲击、调控致病菌分泌蛋白形成以及维持致病菌在巨噬细胞中的存活上发挥重要作用。耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)具有逆境环境胁迫的超强适应性。该菌中仅含有3个σ因子：SigA(DR916)、Sig1(DR180)和Sig2(DR804)，其中Sig1是一个预测的ecf σ因子。作为基因转录的重要元件之一，其生理功能未知。本研究通过构建耐辐射异常球菌sig1基因缺失突变株和功能回补菌株，利用逆境胁迫冲击实验、荧光实时定量技术以及β-半乳糖苷酶活性分析，对该基因功能进行了深入研究，得到了以下研究结果： Sig1由位于I号染色体上的基因DR180编码，长度为690bp，编码229个氨基酸，蛋白分子量为25.89kDa。KEGG数据库显示Sig1属于ecf亚家族。氨基酸序列比对显示，Sig1蛋白与同属中的σ因子相似性高，序列一致性为77.15%，且ecf结构域在Deinococcus属中高度保守。另外，Sig1与结核分枝杆菌中的SigE相似性最高，为37%，二者的三级结构比对同样证实了这一点。利用融合PCR技术构建了sig1缺失突变株(Δsig1)和功能回补株。在正常条件下sig1基因的突变不影响该菌的生长。荧光实时定量PCR结果显示，该基因在菌株的对数生长初期和中期表达量较高。在热激(48℃)、100mM过氧化氢冲击、15%乙醇冲击以及酸冲击(pH4)下，突变株生长状况和野生型相比均发生显著下降。Biolog实验分析显示，sig1基因突变显著影响了菌株对α-D葡萄糖、D-核糖等10种碳源的利用能力。野生型菌株的sig1基因48℃热激后，在6小时内均上调表达，且在热激1h时表达量最高。sig1基因突变导致热激相关分子伴侣和抗性基因(dnaJ1、groEL、DR972等)显著下调，表明sig1基因能在高温环境中起到调控作用。除此以外，还发现sig1基因参与了氧化胁迫的应答调控。在100mM过氧化氢冲击下，sig1突变导致了氧化抗性相关基因(katE、sodC、pod、cat3)的下调。为了进一步探究sig1基因的热激胁迫调控机制，我们利用β-半乳糖苷酶活性实验，分别分析了部分热激相关基因(DR314、DR972、dnaJ1、pspA)的启动子活性。结果显示，热激(48℃)1h后，Δsig1突变株中DR972、dnaJ1、pspA的β-半乳糖苷酶活性较野生型相比有所下降，推测sig1基因可能参与了上述热激胁迫相关基因的转录。本研究基本鉴定了耐辐射异常球菌中外胞质功能σ因子Sig1在逆境胁迫条件下的功能，探索了该基因在热激和氧化胁迫中的调控作用。本研究还成功构建了Sig1蛋白表达菌株并得到了纯化蛋白，这为今后进行体外DNA结合试验、蛋白晶体结构研究奠定了基础。关于Sig1在逆境抗性调控网络中的作用机制目前尚不清楚，仍需进一步研究。

关键词：耐辐射异常球菌 ecfσ因子热激氧化胁迫

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