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利用果蝇筛选影响线粒体功能的新基因

利用果蝇筛选影响线粒体功能的新基因

作者：庞舒南京大学

学位级别：硕士

线粒体是真核细胞中普遍存在的细胞器,它参与了许多重要的生理过程。线粒体不仅通过氧化磷酸化为细胞提供大量能量,还调节细胞凋亡过程;此外线粒体也会影响钙离子的稳态和机体衰老过程。结构决定功能,线粒体形态结构的完整性也与它的功... 详细信息

线粒体是真核细胞中普遍存在的细胞器,它参与了许多重要的生理过程。线粒体不仅通过氧化磷酸化为细胞提供大量能量,还调节细胞凋亡过程;此外线粒体也会影响钙离子的稳态和机体衰老过程。结构决定功能,线粒体形态结构的完整性也与它的功能密切相关。线粒体是一个动态的细胞器,它的融合和解聚有利于及时清除损伤的线粒体,避免对细胞产生毒性效应。线粒体功能异常可以导致许多疾病,比如线粒体DNA发生突变可以导致线粒体呼吸链疾病;线粒体蛋白运输机制出现障碍也会导致相关疾病。此外在神经退行性疾病如帕金森病的病人中发现线粒体功能和结构都受到破坏。线粒体的微小结构对它的体内研究造成障碍,但是线粒体通常会在需要能量供给的组织中大量积累比如肌肉组织,因此我们把肌肉组织作为研究线粒体结构功能的载体。果蝇作为一种模式生物,它的生活周期比较短,突变表型也很丰富,比较容易用遗传学、分子生物学和细胞生物学的手段进行操作。果蝇的肌肉组织和哺乳动物的骨骼肌在形态和生理方面有高度的相似性,尤其果蝇胸部的间接飞行肌不仅与哺乳类的骨骼肌在形态类似,而且间接飞行肌中间还有大量管状的线粒体结构,这为研究线粒体形态变化和功能异常提供理想的体内研究模型。本研究中我们把果蝇的运动能力作为筛选线粒体功能异常的首要标准。我们利用肌肉组织特异性表达的Mef2-Gal4果蝇对6972个RNAi果蝇的运动能力进行筛查,初步得到了 141个RNAi品系,与之对应的是139个基因。对初步筛选结果我们在Flybase中进行基因功能分析后挑选出62个RNAi品系进行二次筛选,这次是以果蝇间接飞行肌中肌原纤维间的Mito-GFP变化为主要筛选标准;此外在第二次筛选中,我们把IFMs中肌原纤维形态的变化作为次要筛选标准。综合这两次的筛选结果,我们最终选择表型很明显的CG2508,CG3356去研究它们对线粒体的影响。CG2508,CG3356是e3连接酶,参与蛋白的泛素化过程。蛋白的泛素化是一个酶催化的过程,将泛素链加到相应的靶蛋白上,最终带上泛素标签的靶蛋白可以通过蛋白酶体或溶酶体进而降解。我们从不同的方面分析CG2508,CG3356对线粒体的影响,在线粒体形态方面,在肌肉组织特异性地敲降CG2508,CG3356会引起线粒体形态的改变。在组织学方面,Mef2-Gal4>CG2508RNAi和Mef2-Gal4>CG3356RNAi果蝇IFMs的形态发生了轻微的损伤,而且Mef2-Gal4>CG2508RNAi果蝇的IFMs的损伤是随着年龄的增加而加剧。在ATP水平的检测中,CG2508RNAi、CG3356RNAi的ATP水平都有下降,CG2508RNAi的ATP水平的降低更明显,而且它的ATP水平的降低是是随着年龄的增加而加剧。综上所述,RNAi介导的果蝇筛选的确可以筛选到一些影响线粒体功能的新基因,而这些新基因会影响线粒体形态和功能。但是它们影响线粒体的具体的分子机制可能需要从这些新基因的结构域以及可能与其他一些信号分子的相互作用去研究。

关键词：果蝇筛选线粒体 Mito-GFP ATP 间接飞行肌线粒体 e3连接酶

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BRCA1对黄体酮受体表达的调节

BRCA1对黄体酮受体表达的调节

作者：郭银霞南方医科大学

学位级别：硕士

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。西方发达国家乳腺癌发病率高,我国女性乳腺癌的发病率也呈快速上升趋势,而且发病年龄越来越年轻化。乳腺癌的城市发病率高于农村,发病率随着年龄的增长而增高。晚期乳腺癌可以向远端转移,是乳腺癌致死的... 详细信息

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。西方发达国家乳腺癌发病率高,我国女性乳腺癌的发病率也呈快速上升趋势,而且发病年龄越来越年轻化。乳腺癌的城市发病率高于农村,发病率随着年龄的增长而增高。晚期乳腺癌可以向远端转移,是乳腺癌致死的主要原因,因此,乳腺肿瘤的早期诊断和治疗变得尤为重要。乳腺癌发生是多因素的,研究乳腺癌的发病机制可为乳腺癌的早期诊断和预防提供理论依据。BRCA1是一种肿瘤抑制基因,它的突变与遗传性乳腺癌密切相关。在遗传性乳腺癌家族中BRCA1的突变率大约为45%;而在乳腺癌卵巢癌的家族中,BRCA1的突变率高达80%。在散发性乳腺癌中,BRCA1的表达也有降低。BRCA1可以调节乳腺癌细胞的增殖和分化,还通过直接或间接的途径参与很多细胞生理学过程。BRCA1不仅控制细胞G2-M的转变,还能调节中心粒的复制。BRCA1的表达降低可以使中心粒在细胞周期的不适当时间异常增多,引起细胞异常分裂,出现非整倍体细胞。染色体数目的异常也正是肿瘤细胞的特点。BRCA1通过同源染色体的重组(homologous recombination,HR)和DNA的末端连接(end-joining,eJ)两条途经参与DNA的损伤修复。BRCA1通过与DNA修复相关蛋白的相互作用或调节DNA修复途经中的基因表达而参与DNA损伤修复。DNA修复的准确性和高效率对于遗传信息的稳定遗传有重要意义,如果DNA损伤不能得到及时的修复,在细胞的不断分裂、分化过程中就有可能引起癌细胞的发生。BRCA1具有调节基因表达的功能。BRCA1的C端有一个转录激活域,它可以与靶基因的特定序列结合引起目的基因的转录。BRCA1还可以募集其他的转录调节因子和RNA polymeraseⅡ使基因转录。BRCA1与BARD1结合形成具有e3活性的异二聚体,使蛋白底物被泛素化而降解。泛素-蛋白酶复合体在细胞各种蛋白的调控中扮演重要角色。有3组酶参与了泛素-蛋白酶体系统介导的蛋白水解反应。泛素激活酶(e1)催化泛素活化,使之携带高能磷酸键。泛素结合酶(e2)负责将活化的泛素传递给连接酶(e3)。连接酶(e3)催化活化的泛素与特异性的底物结合,使底物被蛋白酶体识别并降解。对甾体类激素受体的研究发现,BRCA1可以调节雌激素受体和雄激素受体介导的转录激活性,而且BRCA1可以使与配体结合的雌激素受体泛素化而失活。这说明BRCA1对甾体类激素有调节作用。但是目前关于BRCA1对于黄体酮受体的调节的报道还很少。近年来随着对乳腺癌研究的深入,人们发现黄体酮及其受体对乳腺癌的发生也起到不容忽视的作用。临床调查显示在进行激素替代治疗的女性乳腺癌发病率增高;而且,联合应用黄体酮和雌二醇的女性,其乳腺癌的发病率高于单独使用雌二醇的女性;同时,肿瘤的体积大、恶性程度更高。在卵巢切除的小鼠动物模型中,联合应用雌二醇和黄体酮比单独使用雌二醇的小鼠乳腺组织有更多的分枝和腺泡。黄体酮受体(progesterone receptor,PR)是核受体的一个亚群。PR有两个亚型:PRA(progesterone receptor A,PRA)和PRB(progesterone receptor B,PRB)。与PRA相比,PRB的N端多了164个氨基酸。它们是黄体酮受体基因使用不同的启动子和转录激活部位而产生的两种不同产物。它们受不同的启动子控制,表达调控也不同。黄体酮受体是一种配体诱导型转录因子。PRA和PRB在胞浆和配体结合后,转移到核内与多种靶基因启动子的黄体酮反应元件结合,引起一系列的生物学反应。一些体外实验表明这两种亚型有不同的功能特点,PRB的转录活性比PRA强,但是这种差异具有细胞特异性。而且PRA可以抑制PRB和eR的功能。因此细胞内PRA和PRB的相对水平决定其对黄体酮的反应性。在正常乳腺组织中,PRA和PRB的表达是均衡的;在乳腺癌组织中,PRA的表达增高,而PRB的表达降低。在过表达PRA的转基因小鼠中,发现乳腺组织的分枝增多,导管增生现象明显,而且细胞与细胞之间的粘附能力减弱㈣;在过表达PRB的转基因小鼠中,其乳腺组织的腺泡发育异常。这说明黄体酮及其受体与乳腺癌也密切相关,PRA和PRB的均衡表达对于乳腺组织的正常发育非常重要。虽然BRCA1突变与黄体酮受体表达的变化相关联,但目前关于BRCA1是否可以调节黄体酮受体的表达却很少有直接证据。研究BRCA1和黄体酮受体之间的关系,对于深入了解乳腺癌的发生、发展及预防有重要意义。本研究中我们以乳腺癌细胞MCF—7为研究对象,利用转染技术,过表达和敲低BRCA1研究BRCA1和PRA和PRB表达之间的关系。本课题的主要的实验结果和结论如下:1.在乳腺癌细胞MCF—7中过表达BRCA1,当

关键词：乳腺癌 BRCA1 黄体酮受体 e3连接酶

水稻AP2/eReBP转录因子基因OsASIe1抗逆功能分析

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水稻AP2/EREBP转录因子基因OsASIE1抗逆功能分析

作者：吴慧敏中国农业科学院

学位级别：硕士

非生物胁迫是限制农作物产量增加的主要因素之一，发掘参与植物胁迫应答反应相关的基因，对于揭示植物的胁迫反应机理和利用基因工程方法培育新的作物抗逆品种具有重要意义。在长期进化过程中，植物在分子、细胞、生理和生物化学水平上... 详细信息

非生物胁迫是限制农作物产量增加的主要因素之一，发掘参与植物胁迫应答反应相关的基因，对于揭示植物的胁迫反应机理和利用基因工程方法培育新的作物抗逆品种具有重要意义。在长期进化过程中，植物在分子、细胞、生理和生物化学水平上发展出多种机制应对逆境胁迫，其中转录因子作为上游调控基因在植物的胁迫应答途径中扮演重要的角色。作为植物转录因子大家族之一，AP2/eReBP转录因子家族在植物发育、激素、病原反应及非生物胁迫如干旱、高盐、低温应答方面起重要作用。同时，泛素化在多种生物过程中也具有重要作用，研究表明泛素化在植物非生物胁迫应答中发挥作用。为了鉴定与水稻中与非生物胁迫抗性相关的AP2/eReBP转录因子和e3连接酶基因，本研究对本实验室非生物胁迫下的表达谱芯片数据筛选到的胁迫诱导表达的AP2/eReBP转录因子基因和e3连接酶基因进行进一步的功能验证。1.利用Real-time PCR分析了芯片分析筛选出的旱胁迫下8个表达上调的AP2/eReBP转录因子基因在典型抗逆水稻中非生物胁迫前后的表达情况。结果表明大部分AP2/eReBP转录因子基因在典型抗逆水稻品种中的表达模式与胁迫敏感水稻日本晴基本相同，而且在胁迫前后的表达量和日本晴相比差异也不太显著。但是有些基因经胁迫处理后在日本晴中的表达量下降，在抗逆水稻品种中的表达量反而上升，如Os03g08470和Os07g42510经干旱处理后在日本晴中的表达量稍下降，而在抗旱品种IRAT109中表达量上升，这些基因有可能参与抗逆水稻品种特有的胁迫应答反应途径。OsASIe1经干旱、高盐、冷胁迫处理后无论是在叶片中还是在根系中表达量都增加，OsASIe1在低温、高盐和PeG胁迫下的表达量变化谱分析表明OsASIe1在干旱和高盐胁迫后表达量迅速增高且维持在较高水平，这表明OsASIe1很有可能参与水稻胁迫反应的早期应答。2.利用凝胶迁移率实验(electrophoresis mobility shift assay，eMSA)分析了三个AP2/eReBP转录因子(Os03g08460、Os03g08470和OsASIe1)的AP2保守域能否结合干旱应答顺式作用元件DRe（dehydration-responsive element）和乙烯应答元件GCC box (ethylene Response element），进而推断它们的功能。结果表明OsASIe1转录因子的AP2结构域能够结合DRe和GCC box序列。3.构建了三个AP2/eReBP转录因子基因(Os03g08460、Os03g08470和OsASIe1)和四个e3连接酶基因(Os07g47590、Os04g44820、Os04g01490和Os10g40490)的超表达载体以及两个AP2/eReBP转录因子基因(Os03g08460、Os03g08470)和两个e3连接酶基因(Os04g44820、Os10g40490)RNA干扰载体，并进行遗传转化，得到所有载体的水稻转基因植株。超表达转基因植株的表型鉴定表明在水稻中超表达OsASIe1能够改善水稻耐盐胁迫的能力。本研究通过一系列的实验证明AP2/eReBP转录因子OsASIe1参与水稻的高盐胁迫应答反应。推测在高盐胁迫的前期，OsASIe1的表达量迅速升高，进而通过调节下游功能基因的表达参与水稻的胁迫应答反应。OsASIe1参与水稻的非生物胁迫反应的具体分子机制还需进一步的研究。

关键词：水稻非生物胁迫 AP2/eReBP转录因子 e3连接酶

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蛋白降解靶向嵌合体的研究进展

中国药物化学杂志 2023年第4期33卷 303-314页

作者：王美军杨翠慧张美慧董金华沈阳药科大学、基于靶点的药物设计与研究教育部重点实验室辽宁沈阳110016

蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)是一种依赖泛素-蛋白酶体系统(UPS)降解与目标疾病相关蛋白质的异质双功能小分子。近期针对传统雌激素受体和雄激素受体的PROTAC药物已进入临床试验阶段,使得PROTAC得到更加广泛的关注。本文介绍了PROTAC的... 详细信息

蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)是一种依赖泛素-蛋白酶体系统(UPS)降解与目标疾病相关蛋白质的异质双功能小分子。近期针对传统雌激素受体和雄激素受体的PROTAC药物已进入临床试验阶段,使得PROTAC得到更加广泛的关注。本文介绍了PROTAC的发展历程以及研究现状,总结了PROTAC分子靶向不可成药蛋白、克服药物靶标积累和耐药性等技术优势,并对如何寻找最佳的蛋白质降解靶点、寻找新的e3连接酶、扩大临床治疗范围等发展趋势进行综述。

关键词：靶向蛋白质降解蛋白降解靶向嵌合体 e3连接酶发展趋势

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泛素蛋白酶体系统在Wnt通路中的研究进展

川北医学院学报 2015年第2期30卷 255-259页

作者：朱剑军朱晓华黄平蒋辉邓世山川北医学院基础医学院人体解剖学教研室四川南充637000

Wnt信号传导通路是一个由多种分子参与、相互影响、相互制约和协同作用的复杂体系,与细胞信号转导、细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、细胞黏附和迁移以及干细胞的分化潜能等有关。泛素蛋白酶体系统通过调控蛋白活性、亚细胞定位以及蛋白... 详细信息

Wnt信号传导通路是一个由多种分子参与、相互影响、相互制约和协同作用的复杂体系,与细胞信号转导、细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、细胞黏附和迁移以及干细胞的分化潜能等有关。泛素蛋白酶体系统通过调控蛋白活性、亚细胞定位以及蛋白间相互作用等方式在细胞活动中发挥重要的作用。Wnt信号传导通路中β-catenin等关键分子受泛素蛋白酶体途径精密调控。本文就泛素蛋白酶体系统和Wnt通路信号传导相互之间的关系作一综述。

关键词：泛素蛋白酶 Writ e3连接酶 β-catenin

果蝇Cullin 3基因dsRNA设计及RNAi效率检测

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黑龙江动物繁殖 2016年第6期24卷 3-5,8页

作者：白广栋王梦竹王红岩杨雪李明月何倩毓黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

Cullin 3作为Cullin蛋白家族的一员对调控细胞内蛋白降解有着重要意义。为便于深入研究果蝇中Cullin 3基因的功能,本实验对Cullin 3基因进行dsRNA设计,并通过PCR、体外转录、RNA干扰以及Real-time PCR等方法,检测得到该dsRNA的RNAi效率... 详细信息

Cullin 3作为Cullin蛋白家族的一员对调控细胞内蛋白降解有着重要意义。为便于深入研究果蝇中Cullin 3基因的功能,本实验对Cullin 3基因进行dsRNA设计,并通过PCR、体外转录、RNA干扰以及Real-time PCR等方法,检测得到该dsRNA的RNAi效率。实验结果表明:Cullin 3基因的dsRNA具有RNA干扰效果。该实验将为今后研究果蝇Cullin 3基因的功能提供一定的技术支持。

关键词： Cullin3基因双链RNA(dsRNA) e3连接酶 RNA干扰 Real-timePCR

NeDD4-1在多发性骨髓瘤硼替佐米耐药中的作用及机制研究

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NEDD4-1在多发性骨髓瘤硼替佐米耐药中的作用及机制研究

第十一届全国免疫学学术大会

作者：黄系张恩帆郭杏陈晶林轩儒陈青骁严海朦蔡真浙江大学附属第一医院骨髓移植中心

目的 :研究NeDD4-1在多发性骨髓瘤(MM)硼替佐米(Bor)耐药中的作用及机制研究。方法 :q RT-PCR、Western blot检测MM细胞株(H929,LP-1,RPMI8226,OPM-2,ARP-1)、MM病人骨髓样本中CD138阳性细胞的NeDD4-1 m RNA表达量和蛋白表达量。构建NeDD4-1 sh RNA敲减细胞株并检测细胞增殖速率以及对Bor耐药性的变化。CCK8及流式细胞术检测细胞增殖,凋亡以及周期变化。基因芯片(Gene array)检测敲减NeDD4-1后细胞内基因表达的变化。结果 :1.基因芯片结果显示NeDD4-1在Bor刺激下的MM细胞株中较亲本高表达;NeDD4-1在H929,ARP-1,LP-1中高表达,在RPMI8226和OPM-2中低表达;复发难治病人较初发病人低表达NeDD4-1;*** RNA敲减H929及ARP-1中的NeDD4-1后,q RT-PCR、Western blot验证NeDD4-1敲减效率。敲减NeDD4-1后细胞增殖能力与对照组无显著差异(P>0.05),但在敲除NeDD4-1后,MM细胞对Bor的耐药性增强(PeDD4-1后PTeN明显下调,而phospho-STAT3(ser727)及c-Myc表达明显增加。结论 :NeDD4-1的表达量与MM细胞对Bor的耐药性相关;敲减NeDD4-1后可增加MM细胞对Bor的耐药性,其机制可能与PTeN,c-Myc相关的JAK/STAT通路有关,提示NeDD4-1可能成为肿瘤治疗的新靶点,为MM的治疗提供更新更可靠的策略。

关键词：多发性骨髓瘤泛素 e3连接酶耐药

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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TRIM44蛋白在肿瘤中的研究进展

现代肿瘤医学 2019年第21期27卷 3898-3901页

作者：冯越殷鹤轩刘思佳张云艳哈尔滨医科大学附属肿瘤医院妇放科黑龙江哈尔滨150081 南方医科大学第五附属医院妇科广东广州510900

TRIM44(tripartite motif-containing 44)是TRIM家族成员,含有B-box、coiledcoil和锌指结构域(RING finger)。TRIM家族作为e3连接酶参与泛素化过程,该酶负责从e2结合酶上转移泛素到特定的靶点上。TRIM蛋白与很多生理学过程有关,包括细... 详细信息

TRIM44(tripartite motif-containing 44)是TRIM家族成员,含有B-box、coiledcoil和锌指结构域(RING finger)。TRIM家族作为e3连接酶参与泛素化过程,该酶负责从e2结合酶上转移泛素到特定的靶点上。TRIM蛋白与很多生理学过程有关,包括细胞增殖、DNA修复、信号转导和转录。已有研究证实TRIM蛋白参与肿瘤发生和发展,并且与肿瘤的不良预后有关,TRIM蛋白有望成为肿瘤治疗的新靶点。本文从TRIM44蛋白的基本信息、在肿瘤发生发展中的机制、TRIM44在肿瘤中的研究进展进行阐述。

关键词： TRIM TRIM44 肿瘤泛素化 e3连接酶

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泛素途径对植物种子大小的调控

济宁医学院学报 2017年第2期40卷 82-86,92页

作者：张萌韩爱忠济宁医学院协同创新中心济宁272067

种子大小是影响作物产量的关键因素,并且在植物进化适应过程中也起到至关重要的作用。植物种子包括胚、胚乳和种皮3种具有不同遗传特性的结构。因此,种子的大小是由胚、胚乳和母本组织的生长共同协调决定的。近年来研究发现拟南芥和水... 详细信息

种子大小是影响作物产量的关键因素,并且在植物进化适应过程中也起到至关重要的作用。植物种子包括胚、胚乳和种皮3种具有不同遗传特性的结构。因此,种子的大小是由胚、胚乳和母本组织的生长共同协调决定的。近年来研究发现拟南芥和水稻等模式植物中的泛素途径相关因子也参与种子大小的调控。泛素途径对种子大小调控的研究为深入了解植物种子大小调控机理提供重要思路,也将为作物高产育种提供理论基础。

关键词：泛素泛素受体 e3连接酶 26S蛋白酶体种子大小