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e3连接酶Hrd1对核心钟蛋白BMAL1的降解调控

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E3连接酶Hrd1对核心钟蛋白BMAL1的降解调控

作者：朱尧苏州大学

学位级别：硕士

目的:检测e3连接酶Hrd1对核心钟蛋白BMAL1降解的调控,进而在此基础上探究细胞内固有节律的变化。方法:分别在小鼠神经元细胞系(N2a)细胞系及人胚肾细胞系HeK 293中过表达或干扰Hrd1基因的表达,进而通过免疫印迹方法检测细胞内BMAL1蛋白... 详细信息

目的:检测e3连接酶Hrd1对核心钟蛋白BMAL1降解的调控,进而在此基础上探究细胞内固有节律的变化。方法:分别在小鼠神经元细胞系(N2a)细胞系及人胚肾细胞系HeK 293中过表达或干扰Hrd1基因的表达,进而通过免疫印迹方法检测细胞内BMAL1蛋白水平的变化;在HeK 293细胞内过表达Hrd1后,用蛋白合成抑制剂CHX处理细胞,进而分别在Oh、2 h、4h、8 h四个不同的时间点收集细胞并通过免疫印迹的方式检测BMAL1的半衰期是否发生改变;为了探究Hrd1究竟是通过怎样的方式影响了BMAL1的蛋白水平,在N2a细胞系或HeK 293细胞系内共转FLAG-Hrd1及GFP-N3-BMAL1,在转染48 h后用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,12 h后收集细胞并进行免疫共沉淀实验,通过免疫印迹方法检测Hrd1与BMAL1之间是否存在结合,以及在Hrd1的影响下,BMAL1的泛素化水平是否发生改变,进一步的,在HeK 293 细胞系中分别共转 FLAG-Hrd1、GFP-BMAL1 及 HA-Ub(WT)、HA-Ub(K48R)或HA-Ub(K63),在转染48h后用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,12 h后收集细胞并进行免疫共沉淀实验,通过免疫印迹的方法寻找在Hrd1的影响,BMAL1蛋白通过泛素化降解的位点;为了检测BMAL1蛋白水平的变化是否对下游受其调控的基因产生了影响,在N2a细胞系内过表达Hrd1,24 h后收集细胞,使用实时荧光定量PCR(q-PCR)方法检测受BMAL1调控的Per1、Dbp等基因的mRNA水平的改变;在N2a细胞系内过表达Hrd1,24h后含有马血清的培养基处理细胞,使细胞时钟节律同步化,进而每隔4 h收集一组细胞,共收集了 8组样品(含有一个完整的振荡周期),通过q-PCR的方式检测在Hrd1的影响下,细胞内的时钟节律是否发生改变。结果:与对照组相比,过表达Hrd1后BMAL1的蛋白水平明显下调,而在敲减了 Hrd1后,BMAL1蛋白上调;在CHX取点实验中,过表达Hrd1的实验组,BMAL1的降解速率明显快于对照组的情况;免疫共沉淀实验表明,无论是外源性还是内源性的结果,Hrd1均可与BMAL1被共沉淀下来,此外,免疫印迹的结果显示,过表达Hrd1后,BMAL1的泛素化水平明显提高;在共转了 GFP-N3-BMAL1及HA-Ub(K48R)的体系内,无论是对照组还是实验组,BMAL1的泛素化水平明显下调且两者无显著差别,而在共转了 GFP-N3-BMAL1与HA-Ub(WT)或HA-Ub(K63R)的体系中,与对照组相比,过表达Hrd1后BMAL1的蛋白水平均明显上调;同对照组相比,过表达Hrd1以后Per1,Dbp的mRNA水平均明显下调,BMAL1的nmRNA水平则无明显差异;而在用马血清处理使细胞同步化的试验中,同对照组相比,过表达Hrd1后,Per1基因在整个振荡周期各个时间点的振幅都明显减弱,振荡周期也有所延伸。结论:e3连接酶Hrd1可以将核心钟蛋白作为其特异性底物与之结合,进而通过促进其泛素化水平的方式使之通过泛素-蛋白酶体系统被降解,并通过对BMAL1蛋白降解的调控来影响细胞内时钟节律地震荡过程。

关键词：钟蛋白 BMAL1 泛素-蛋白酶体系统 e3连接酶 Hrd1

植物SIZ1 SUMO e3连接酶的研究进展

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植物生理学报 2014年第4期50卷 365-372页

作者：张耸李晓东孟庆伟山东农业大学生命科学学院、作物生物学国家重点实验室山东泰安271018

SUMO化修饰是一种重要的翻译后修饰,对蛋白的翻译后调控起到重要作用。植物SIZ1是一种SUMO e3连接酶,在SUMO化的过程中起着关键作用。本文概述了SIZ1的基本结构和功能,阐述了其在植物响应非生物胁迫如高温、低温、干旱、盐和离子胁迫时... 详细信息

SUMO化修饰是一种重要的翻译后修饰,对蛋白的翻译后调控起到重要作用。植物SIZ1是一种SUMO e3连接酶,在SUMO化的过程中起着关键作用。本文概述了SIZ1的基本结构和功能,阐述了其在植物响应非生物胁迫如高温、低温、干旱、盐和离子胁迫时所发挥的调节功能,并展望了植物SIZ1研究中有待解决的问题。

关键词： SUMO化 SIZ1 SUMO e3连接酶非生物胁迫

SUMO e3连接酶在植物生长发育中的功能研究进展

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植物学报 2018年第2期53卷 175-184页

作者：韩丹璐赖建彬阳成伟华南师范大学生命科学学院广东省植物发育生物工程重点实验室广州510631

SUMO化是真核生物中一种重要的蛋白质翻译后修饰。SUMO e3连接酶具有对底物特异的识别功能,可以促进SUMO化反应,是SUMO化修饰过程中的重要组成部分。目前,在植物中已经鉴定出多种SUMO e3连接酶,它们参与植物重要器官的发育调控。该文对... 详细信息

SUMO化是真核生物中一种重要的蛋白质翻译后修饰。SUMO e3连接酶具有对底物特异的识别功能,可以促进SUMO化反应,是SUMO化修饰过程中的重要组成部分。目前,在植物中已经鉴定出多种SUMO e3连接酶,它们参与植物重要器官的发育调控。该文对植物SUMO e3连接酶在根系发育、开花途径、配子发育和光形态建成中的作用及其调节机制进行综述。

关键词： MMS21 植物生长发育 SIZ1 SUMO e3连接酶 SUMO化

紫外线及黄芪甲苷对人皮肤成纤维细胞e3连接酶Hrd1表达的影响

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临床皮肤科杂志 2014年第4期43卷 201-205页

作者：钱雯陈斌蒋辉莉苏东明南京医科大学第一附属医院皮肤性病科江苏南京210029 南京医科大学代谢疾病研究中心江苏南京210029

目的:探讨紫外线(UV)对人皮肤成纤维细胞中e3连接酶Hrd1表达的影响及黄芪甲苷的干预作用。方法:分离培养人原代成纤维细胞,分别以10J/cm^2UVA和30mJ/cm^2 UVB进行照射,黄芪甲苷进行干预处理。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓... 详细信息

目的:探讨紫外线(UV)对人皮肤成纤维细胞中e3连接酶Hrd1表达的影响及黄芪甲苷的干预作用。方法:分离培养人原代成纤维细胞,分别以10J/cm^2UVA和30mJ/cm^2 UVB进行照射,黄芪甲苷进行干预处理。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度的黄芪甲苷对成纤维细胞增殖活性的影响;荧光定量PCR法检测成纤维细胞中Hrd1的mRNA表达;免疫组化法观察成纤维细胞Hrd1的蛋白表达。结果:MTT结果示:在适宜浓度下,黄芪甲苷对体外培养的成纤维细胞有显著的促增殖作用,药物浓度为10、20、30mg/L时最为明显(Pe3连接酶Hrd1的表达,而黄芪甲苷对这一现象具有逆转作用。

关键词：紫外线人皮肤成纤维细胞 e3连接酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白1 黄芪甲苷

SUMO e3连接酶在植物适应非生物胁迫中的作用研究进展

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生物技术通报 2020年第2期36卷 169-177页

作者：汪永平任伟王润娟邵坤仲高慧娟张金林兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室草地农业教育部工程研究中心草地农业科技学院

SUMO化(Sumoylation)作为一种广泛存在于真核生物的重要翻译后修饰,在调控植物生长、发育和逆境应答等方面发挥着重要作用。SUMO e3连接酶具有底物识别和选择的作用,直接促进SUMO蛋白与靶蛋白的结合。目前,在植物中已经鉴定出多种SUMO e... 详细信息

SUMO化(Sumoylation)作为一种广泛存在于真核生物的重要翻译后修饰,在调控植物生长、发育和逆境应答等方面发挥着重要作用。SUMO e3连接酶具有底物识别和选择的作用,直接促进SUMO蛋白与靶蛋白的结合。目前,在植物中已经鉴定出多种SUMO e3连接酶。综述了SUMO e3连接酶在植物适应干旱、盐害、高/低温、营养元素匮缺和重金属毒害等非生物胁迫过程中的作用,并展望了未来植物SUMO化研究的方向,以期为今后植物SUMO化方面的研究提供参考。

关键词： SUMO化 e3连接酶翻译后修饰逆境适应

山核桃COP1 e3连接酶的全长克隆及表达分析

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浙江农林大学学报 2014年第6期31卷 831-837页

作者：沈辰裘佳妮黄坚钦浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地浙江临安311300

COP1 e3连接酶是一个光形态建成的抑制子和光调控植物发育的分子开关。对山核桃Carya cathayensis花芽454测序获得Cc COP1 e3连接酶的片段,通过c DNA末端快速扩增技术(RACe),分别获得该基因的全长,大小为2 331 bp,它由2个特殊的结构域... 详细信息

COP1 e3连接酶是一个光形态建成的抑制子和光调控植物发育的分子开关。对山核桃Carya cathayensis花芽454测序获得Cc COP1 e3连接酶的片段,通过c DNA末端快速扩增技术(RACe),分别获得该基因的全长,大小为2 331 bp,它由2个特殊的结构域组成即环形锌指结合域和WD-40重复序列,其编码的蛋白质有较强的亲水性,在氨基端主要是亲水性氨基酸,而羧基端主要是疏水性氨基酸。Cc COP1 e3连接酶与毛果杨Populus trichocarpa等的COP1 e3连接酶同源基因相似度较高,总体高达77.80%。实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)结果显示:Cc COP1 e3连接酶的表达贯穿于在山核桃雌雄花的发育过程,Cc COP1 e3连接酶在山核桃的茎、叶、果实、花芽中均有表达,但在花芽中表达量最高,3月中旬表达量最高,在5月中旬雄花表达量相对较高。Cc COP1 e3连接酶与山核桃雌雄花分化有关。

关键词：经济林学山核桃 CcCOP1 e3连接酶 RACe 序列分析表达分析

泛素e3连接酶在DNA损伤修复途径里的大规模筛选及其功能研究

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泛素E3连接酶在DNA损伤修复途径里的大规模筛选及其功能研究

作者：苏蓓浙江大学

学位级别：硕士

细胞基因组时刻遭受着来自内外因素的损伤威胁,如果这些损伤无法得到及时、准确的修复,将会导致基因组的不稳定,甚至是细胞死亡与肿瘤发生。为了应对各种不同的DNA损伤,机体演化出了一系列精细的应对机制,包括细胞周期阻遏、损伤修复,... 详细信息

细胞基因组时刻遭受着来自内外因素的损伤威胁,如果这些损伤无法得到及时、准确的修复,将会导致基因组的不稳定,甚至是细胞死亡与肿瘤发生。为了应对各种不同的DNA损伤,机体演化出了一系列精细的应对机制,包括细胞周期阻遏、损伤修复,以及其他细胞信号通路。参与这一系列应对机制的蛋白功能的发挥往往依赖于蛋白翻译后修饰信号的调控,如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、苏素化等。泛素化修饰是很多参与DNA损伤修复蛋白发挥功能的重要调控手段之一。蛋白泛素化修饰信号通过e1激活酶、e2结合酶和e3连接酶的信号传递和层叠而完成。目前在人类中,已有大约500余种的泛素连接酶被定义。为了发现更多未知的蛋白,我们克隆了300余种e3连接酶的cDNA。以53BP1在电离辐射损伤诱导下的foci作为检测标志物,利用免疫荧光实验手段,筛选可能影响53BP1招募的e3连接酶。在此次筛选中,我们找到了许多已经报道的参与到DNA损伤修复通路的e3连接酶(如RNF4、RNF8、RNF168、PSO4等),说明此筛选方法具有可行性,也暗示着很有可能存在未报道过的e3。最后我们筛选到了几个可能参与DNA损伤修复信号通路的蛋白,并对其进行了初步的验证与分析。

关键词： DNA损伤应答 DNA修复蛋白泛素化修饰 e3连接酶

紫外线对人皮肤成纤维细胞e3连接酶Hrd1表达的影响及黄芪甲苷的干预作用

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紫外线对人皮肤成纤维细胞E3连接酶Hrd1表达的影响及黄芪甲苷的干...

作者：钱雯南京医科大学

学位级别：硕士

研究背景:皮肤是人体最大的器官,也是机体的一道天然保护屏障。皮肤长期暴露于外界环境,是紫外线照射后最易受损的器官。日光中的中波紫外线(UVB)和长波紫外线(UVA)辐射可引起皮肤的急性损伤(如日晒伤)和慢性累积性损伤(如皮肤光老化、... 详细信息

研究背景:皮肤是人体最大的器官,也是机体的一道天然保护屏障。皮肤长期暴露于外界环境,是紫外线照射后最易受损的器官。日光中的中波紫外线(UVB)和长波紫外线(UVA)辐射可引起皮肤的急性损伤(如日晒伤)和慢性累积性损伤(如皮肤光老化、皮肤癌),对人类健康构成潜在危害。UVB部分可达真皮浅层,UVA主要作用于真皮,其深度可达真皮中部,成纤维细胞是其作用的主要靶位。紫外线引起的皮肤过早衰老严重影响人类皮肤健康,探索如何延缓皮肤衰老也一直是国内外学者研究的热点。皮肤老化是一个复杂的生物学现象,包括两方面因素:一是内源性自然老化(主要为遗传因素引起);另一个是受环境因素影响(紫外线、烟尘、气候等)的外源性老化,其中紫外线(UV)的影响尤为主要,被更普遍地定义为光老化。光老化(photoaging)指皮肤衰老过程中紫外线损害的积累,是自然老化和紫外线辐射共同作用的结果。皮肤光老化在组织学上主要表现为胶原成分减少和弹性纤维变性沉积等皮肤基质构成的改变,从而产生皱纹和皮肤弹性减小的临床表现。内质网(endoplasmic reticulum,eR)是真核细胞中蛋白质翻译合成的场所,细胞在一些理化刺激或炎性状态下出现新生蛋白质未折叠或错误折叠现象,这些无功能蛋白质堆积,使内质网内环境失调,导致内质网功能紊乱,造成细胞凋亡,称之为内质网应激(endoplasmic reticulum stress,eRS)。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白1(HmgCoAreductase degradation 1,Hrd1)是内质网应激过程中e3连接酶的重要一员,它能通过内质网相关降解(eR Associated Degradation,eRAD)途径分解内质网内聚积的错误折叠或未折叠蛋白,保护细胞免于内质网应激,从而减少细胞凋亡,Hrd1作为eRAD途径中重要的连接酶e3的核心部分,它的表达变化将影响e3连接酶对错误蛋白的识别和逆转运能力。而紫外线辐射对皮肤细胞Hrd1表达的影响目前尚无文献报道。探索一种高效且安全性好,能够保护人体皮肤拮抗紫外线损伤的天然产品对人类皮肤健康具有重要意义。传统中药对皮肤的光保护作用已逐渐为人所知。黄芪甲苷(又名黄芪甲甙,Astragaloside,AST)为黄芪皂甙类单体成分,是从黄芪中分离而得到的一种皂甙类植物单体成分,是黄芪的主要有效成分,具有抗氧化损伤、清除自由基、抗炎、抗病毒、抗衰老、调节免疫功能等多方面的作用。数十年来,对黄芪甲苷的药代动力学、药理作用和机制的研究取得了很大进展,已被有效应用于心、脑、肝、血管疾病等许多疾病的治疗。大量研究表明,AST具有清除体内活性氧簇(ROS)和抗氧化应激的作用。近年来,一些研究还发现AST具有抗皮肤老化和抗紫外线的作用。但黄芪甲苷对皮肤成纤维细胞中e3连接酶Hrd1的影响亦尚无报道。因此,本实验以原代培养的人皮肤成纤维细胞为模型,在细胞水平探讨紫外线对人皮肤成纤维细胞e3连接酶Hrd1表达的影响及黄芪甲苷的干预作用。目的:通过UVA、UVB辐射联合黄芪甲苷处理人皮肤成纤维细胞,观察紫外线对人皮肤成纤维细胞中e3连接酶Hrd1表达的影响以及黄芪甲苷干预后Hrd1的表达变化。探讨e3连接酶Hrd1是否在紫外线所致皮肤光老化中起作用,以及黄芪甲苷是否通过调节Hrd1的表达起到抗光老化作用。方法:1.细胞培养:分离青年包皮环切术后皮肤成纤维细胞(FB),由江苏省人民医院泌尿外科提供。在37℃、5%CO2条件下培养于含10%胎牛血清的DMeM培养基,根据实验目的分别接种在24孔、96孔板及直径10cm的培养皿中。选用4～8代处于对数生长期的细胞进行实验。2.紫外线照射:根据实验设计定时定量进行紫外线照射,选择总剂量为10 J/cm2 UVA或30mJ/cm2 UVB照射处理后,选择合适浓度的黄芪甲苷加入培养基至相应时间点。3.实验分组:A组(正常对照组);B组(单纯低剂量AST干预组);C组(单纯高剂量AST干预组);D组(UVA照射组);e组(UVA照射+低剂量AST组);F组(UVA照射+高剂量AST组);G组(UVB照射组);H组(UVB照射+低剂量AST组);Ⅰ组(UVB照射+高剂量AST组)。4.倒置显微镜:观察成纤维细胞形态的变化。***法:检测AST对人皮肤成纤维细胞增殖活性的影响,选取无药物毒性的AST溶液最佳低、高浓度。***-PCR法:检测各组别成纤维细胞中Hrd1的mRNA表达。7.细胞免疫组化法:检测各组别成纤维细胞中Hrd1的蛋白表达。观察染色结果,并对图像进行半定量分析,比较每组图片平均光密度值。结果:1.不同浓度AST对FB增殖活性的影响在适宜浓度下,黄芪甲苷对体外培养的成纤维细胞有显著的促增殖作用,并呈剂量依赖性,药物浓度为10,20,3

关键词：紫外线人皮肤成纤维细胞 e3连接酶 Hrd1 黄芪甲苷

梭梭SUMO e3连接酶基因HaSIZ1的克隆和功能分析

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梭梭SUMO E3连接酶基因HaSIZ1的克隆和功能分析

作者：汪永平兰州大学

学位级别：硕士

干旱、土壤盐渍化和极端温度是影响植物生长、限制农作物生产的重要非生物胁迫。SUMO(Small ubiquitin-like modifier)化作为一种重要的翻译后修饰,在调控植物生长、发育和逆境应答等方面发挥着重要作用。e3连接酶SIZ1可直接介导SUMO蛋... 详细信息

干旱、土壤盐渍化和极端温度是影响植物生长、限制农作物生产的重要非生物胁迫。SUMO(Small ubiquitin-like modifier)化作为一种重要的翻译后修饰,在调控植物生长、发育和逆境应答等方面发挥着重要作用。e3连接酶SIZ1可直接介导SUMO蛋白与靶蛋白的结合,直接影响植物在多种非生物胁迫下的SUMO化响应。目前对SIZ1介导的SUMO化的研究都集中在拟南芥和水稻等甜土植物,荒漠植物大都具有极强的抗复合逆境能力,它们的SUMO e3连接酶是否具有与甜土植物不一样的调控,目前还不清楚。本研究以我国西北荒漠地区优势物种梭梭为材料,分析了SUMO化在其应对渗透胁迫、高盐、高温和低温过程中的响应;并以其SUMO e3连接酶的编码基因HaSIZ1为重点,克隆了HaSIZ1的cDNA全长并进行了胁迫处理下的表达模式分析、亚细胞定位和拟南芥转化等,取得以下主要研究结果:(1)克隆到梭梭HaSUMO1基因,其cDNA全长为632 bp,ORF为291bp,共编码96个氨基酸;HaSUMO1分子量约10.9 kDa,与拟南芥AtSUMO1氨基酸同源性约86%,Anti-AtSUMO1抗体可用于梭梭SUMO化蛋白的检测。(2)50℃高温处理诱导梭梭幼苗SUMO化蛋白的迅速大量积累;-0.75 MPa渗透胁迫、350 mM NaCl处理和4℃低温处理诱导梭梭SUMO化蛋白的少量积累。(3)克隆到梭梭HaSIZ1基因,其cDNA全长为3148 bp,ORF为2598 bp;组织特异性分析表明HaSIZ1在梭梭幼苗整株都有表达;-0.75 MPa渗透胁迫、350 mM NaCl胁迫和4℃低温处理显著诱导HaSIZ1的表达,而50℃高温胁迫处理显著抑制HaSIZ1的表达。(4)分子进化树分析表明HaSIZ1属于SIZ1家族,具有SUMO e3连接酶常见的SAP、SP-RING ZINC FINGeR和PHD结构域,定位于细胞核;推测可能是梭梭SUMO e3连接酶。(5)构建了35S::HaSIZ1载体,并将其转化拟南芥WT和siz1-2突变体,得到了HaSIZ1高表达的纯合株系。以上研究结果初步表明,HaSIZ1在调控梭梭幼苗SUMO化和干旱、高盐、高温和低温响应过程中发挥着重要作用。

关键词：梭梭 SUMO化 e3连接酶 HaSIZ1 克隆功能分析