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不同表达系统对AMP脱氨酶表达的影响

不同表达系统对AMP脱氨酶表达的影响

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作者：崔妍妍广西大学

学位级别：硕士

AMP 脱氨酶（AMP deaminase;AMPD;eC 3.***.4.6）是一种氨基水解酶,可高效催化腺苷一磷酸（AMP）转变为NH3和肌苷酸（IMP）,被广泛应用于食品及医药等行业。针对微生物直接发酵合成AMP脱氨酶遇到的成本高、酶活低且酶活不稳定、提取纯化... 详细信息

AMP 脱氨酶（AMP deaminase;AMPD;eC 3.***.4.6）是一种氨基水解酶,可高效催化腺苷一磷酸（AMP）转变为NH3和肌苷酸（IMP）,被广泛应用于食品及医药等行业。针对微生物直接发酵合成AMP脱氨酶遇到的成本高、酶活低且酶活不稳定、提取纯化困难等关键问题,通过分子生物学手段扩增来源于米曲霉的AMP脱氨酶基因,从而实现AMP脱氨酶在大肠杆菌、毕赤酵母及枯草芽孢杆菌中的高效表达,为实现其在食品工业中的规模化生产提供一定的理论指导和技术支持。首先,本研究以米曲霉基因组为模板,通过引物设计进行PCR扩增获得AMP脱氨酶的基因序列。该基因ORF为2964bp,编码987个氨基酸,预测蛋白分子量111.25266 KDa,理论等电点5.94。系统发育树分析表明该基因与Aspergillus oryzaeRIB40DNA对应的序列的同源性达99%。同时,为实现其高产的表达,分别设计引物构建重组表达载体peT30a-AMP、pPIC9K-AMP及pMA5-AMP并转化至*** Transetta De3、*** GS115 及subtilis WB600,成功构建相应的重组菌株。对相应的重组菌株进行表达验证并优化诱导表达条件。结果表明重组大肠杆菌在对数生长中期（OD600=0.5～0.8）,添加诱导剂IPTG终浓度0.5mM,持续诱导14 h可获得最大酶活1933 U/mL。重组毕赤酵母最佳诱导表达条件为:在菌体OD600为2～5进行高密度发酵转接,添加诱导剂甲醇终浓度1%,持续诱导96 h。在该条件下,重组AMP脱氨酶酶活1257U/mL。重组枯草芽孢杆菌不需添加诱导剂即可发酵产酶,在发酵8～14h时AMP脱氨酶酶活相对较高,最高酶活可达2450 U/mL,高于重组大肠杆菌及重组毕赤酵母表达的酶活。综合比较三种表达系统对AMP脱氨酶酶活及表达量的影响,选取枯草芽孢杆菌表达宿主作为后续研究对象。通过镍亲和层析柱对AMP脱氨酶进行分离纯化。结果表明180mM、220mM及260mM咪唑缓冲液可洗脱目的蛋白,经超滤浓缩及SDS-PAGe检测为单一条带,达到电泳纯。在此基础上,对重组酶酶学性质进行研究。结果发现:该重组酶最适反应温度55℃,35℃处理30 min时,该酶可保持80.2%的活性。而温度高于40℃时,该酶的热稳定性变差。最适pH6.0,在pH6.0～8.0中活性较稳定。Zn2+、Fe3+和A13+可显著增强酶活。其中,Fe3+的增强效果最为显著,10mM离子浓度下,酶活可提高236%。不同浓度的CO2+和K+均可显著抑制酶活,最大酶活损失约50%～60%。低浓度的Mrn2+、Cu2+和Ca2+对重组酶的酶活几乎没有影响,但高浓度的Mn2+、Cu2+和Ca2+则对酶活有显著的抑制作用。

关键词： AMP deaminase e.coli transettade3 P.pastoris GS115 B.subtilis WB600 重组表达酶学性质

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