检索结果-南通市图书馆

作者：赵颖颖浙江工业大学

学位级别：硕士

肝素是一种重要的多糖类抗凝血药物,临床上被广泛用于血栓栓塞、心肌梗塞、血液透析等。目前市场上的肝素主要从猪小肠中提取,但是动物源肝素易受污染,所以需要寻求一种更加安全可靠的肝素制备方法。Heparosan是一类天然酸性多糖,在***... 详细信息

肝素是一种重要的多糖类抗凝血药物,临床上被广泛用于血栓栓塞、心肌梗塞、血液透析等。目前市场上的肝素主要从猪小肠中提取,但是动物源肝素易受污染,所以需要寻求一种更加安全可靠的肝素制备方法。Heparosan是一类天然酸性多糖,在***5里以荚膜多糖的形式合成,其与肝素和硫酸乙酰肝素有类似多糖骨架,因此可以通过生物工程技术从heparosan出发制备肝素。本课题以提高***5生物量和heparosan产量为目的,对培养基和发酵补料方式进行了优化并应用Red同源重组技术敲除了rpoS基因以期减少乙酸的产生。同时为能更便捷的定量*** k5发酵产物中的heparosan,在Heparin lyase Ⅲ法的基础上进行了优化使之能直接应用于发酵上清液的检测。通过单因素试验,在葡萄糖合成培养基的基础上对碳源、氮源、磷酸盐和接种量进行优选。对不同的补料方式进行了比较研究,结果表明用氨水调pH的拟指数流加发酵方式的效果最好,*** k5生物量和heparosan产量达到5.4 g/L和1.3 g/L,比批次发酵分别提高了138%和 798%。Heparin lyase Ⅲ法是利用Heparin lyase Ⅲ能特异性解聚heparosan的特性定量检测heparosan的酶学方法,但原方法只适用于heparosan粗品。所以在原方法的基础上对检测条件进行了优化,使其能直接检测发酵上清液中的heparosan含量。利用λ-Red重组系统成功敲除了***5的rpoS基因,通过摇瓶培养比较了野生株和突变株在葡萄糖合成培养基中的生长状况,发现突变株产酸明显减少,但生物量和heparosan产量没有提高。

关键词： e.coli k5 heparosan 培养基优化补料流加基因敲除 rpoS

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*** k5 △pta菌株构建及荚膜多糖分析

*** K5 △pta菌株构建及荚膜多糖分析

作者：李帅浙江工业大学

学位级别：硕士

肝素是目前临床应用最广泛的抗凝血类药物,而且还具有降血脂,抗过敏,抗炎症,抗肿瘤,抗病毒等功效。*** k5的荚膜多糖heparosan具有与肝素类似的糖链骨架结构,且可以通过化学法修饰或酶法修饰制备肝素。因此,可利用*** k5大量制备heparos... 详细信息

肝素是目前临床应用最广泛的抗凝血类药物,而且还具有降血脂,抗过敏,抗炎症,抗肿瘤,抗病毒等功效。*** k5的荚膜多糖heparosan具有与肝素类似的糖链骨架结构,且可以通过化学法修饰或酶法修饰制备肝素。因此,可利用*** k5大量制备heparosan,进一步制备生物工程肝素,以满足市场肝素的需求。本研究在对*** k5的生长参数进行探究后发现,菌体在以葡萄糖为碳源的生长过程中会积累乙酸,乙酸的大量积累会严重抑制细胞的生长,不利于heparosan的合成。因此,本研究在分析*** k5基因组乙酸代谢途径后,发现pta基因编码的磷酸转乙酰基酶(phosphotransacetylase)可以将乙酰CoA催化为乙酰磷酸,进而转化生成乙酸,是乙酸代谢过程中的关键基因。因此,通过构建CRISPR/Cas9双质粒敲除系统对该基因进行敲除,得到突变株*** k5Δpta,该pta基因缺失株在葡萄糖培养基中培养24 h后其乙酸含量仅为0.132g/L,而野生菌株相同条件培养后乙酸含量为2.86 g/L,说明pta基因的敲除成功阻断了乙酸的生成和积累。然而进一步比较突变株*** k5Δpta和野生菌株*** k5在葡萄糖合成培养基中生长状况发现,虽然阻断了乙酸的积累,但突变菌株的生长并没有优于野生菌株,生物量也未明显增加,且发酵液的pH值依然在5-6之间,与野生菌株无显著性差异。我们推测可能是因为乙酸代谢途径被阻断后,碳源流向了其他有机酸生成,从而抑制了菌体的生长。对两菌株发酵生成的荚膜多糖进行了表征,发现突变株与野生株生成的heparosan成分和产量基本一致,说明pta基因的敲除没有影响heparosan的生成,但没有提高其产量。虽然heparosan的产量没有提高,不过通过GPC以及多糖凝胶电泳实验发现,突变株生成的heparosan的平均分子质量远低于野生菌株,而低分子质量的heparosan更有利于肝素的制备。

关键词： e.coli k5 heparosan pta 基因敲除

*** k5合成Heparosan关键酶基因kfiD的克隆与表达及Heparosan硫酸化修饰

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*** K5合成Heparosan关键酶基因kfiD的克隆与表达及Heparosan硫酸...

作者：王畅浙江工业大学

学位级别：硕士

肝素和硫酸乙酰肝素是被广泛应用于临床中的抗凝血药物多糖,同时研究发现其可能在抗癌、抗病毒具有一定的作用。医药级别的肝素从家畜肠粘膜分离得到,然而从动物组织制备的肝素存在潜在的污染隐患。因而,微生物来源的heparosan合成肝素... 详细信息

肝素和硫酸乙酰肝素是被广泛应用于临床中的抗凝血药物多糖,同时研究发现其可能在抗癌、抗病毒具有一定的作用。医药级别的肝素从家畜肠粘膜分离得到,然而从动物组织制备的肝素存在潜在的污染隐患。因而,微生物来源的heparosan合成肝素及其衍生物成为研究热点。本文进行了大肠杆菌k5中尿苷二磷酸葡糖脱氢酶基因(kfiD)的克隆表达及heparosan硫酸化修饰。首先克隆得到e. coli k5产Heparosan关键酶基因kfiD,经测序和BLAST比对后,发现克隆得到的kfiD基因片段与NCBI上已报道的escherichia coli Nissle1917, escherichia coli ABU83972的同源性均为100%。同时经Bioedit软件分析发现kfiD基因片段编码392个氨基酸,kfiD蛋白大小约为44kDa。在成功克隆得到kfiD的基础上,构建重组表达质粒peT28b-kfiD,并将其转入***21(De3)中,实现了kfiD在***21(De3)中的表达,得到kfiD融合蛋白的分子量大小为47kDa。对kfiD在e. coli BL21(De3)中表达的诱导条件进行优化,确定最适诱导条件：IPTG诱导剂量为0.4mmol/L、诱导时间为4h。此钱,利用DeAe琼脂糖凝胶Fast Flow对heparosan粗品进行纯化,heparosan纯化的平均得率为12.7%。利用浓硫酸法制备heparosan硫酸化衍生物,发现反应时间为30min时,heparosan硫酸化产物的硫含量最高,为3.34%,硫取代度为0.189。其后对商品化的肝素钠进行硫含量测定,发现其含硫量为18.25%,硫取代度为2.2。由此可知,若要达到商品化肝素衍生物的硫酸基取代度,需对heparosan进行进一步硫酸化修饰。分别对纯化后的heparosan, heparosan硫酸化衍生物,肝素钠进行1H NMR分析,得到heparosan硫酸化衍生物在GlcNAc (H1)位置的确有硫酸基的取代,GlcNAc (CH3)位置无硫酸基取代,而GlcA (HI)位置、GlcNAc (H2, H3, H4, H5, H6)位置或GlcA(H2,H3,H4,H5,H6)位置,有取代,但无法确定具体的取代位置。同时由heparosan硫酸化衍生物的1H-NMR可知采用浓硫酸法不会破坏heparosan双糖结构。

关键词： e.coli k5 heparosan kfiD 克隆表达硫酸化修饰

*** k5合成Heparosan关键酶基因kfic的克隆与表达及Heparosan解聚

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*** K5合成Heparosan关键酶基因kfic的克隆与表达及Heparosan解聚

作者：严子琴浙江工业大学

学位级别：硕士

肝素作为抗凝血药物在临床医药上具有广泛的应用。Heparosan是某些病原菌荚膜中多糖骨架的二糖重复单位，是肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前体。另一方面，由于普通肝素在实际应用中出现了一些不良的副作用，相较之下低分子量肝素具有... 详细信息

肝素作为抗凝血药物在临床医药上具有广泛的应用。Heparosan是某些病原菌荚膜中多糖骨架的二糖重复单位，是肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前体。另一方面，由于普通肝素在实际应用中出现了一些不良的副作用，相较之下低分子量肝素具有副作用低、更可预见的药理作用、半衰期长和更好的生物利用率等优点。因此，低分子量肝素是普通肝素的最佳替代物。本文进行了e. coli k5中合成heparosan关键酶基因kfic克隆和表达，为构建产heparosan工程菌提供参考。同时进行了几种解聚heparosan方法的比较和优化，为将来用于从低分子量的heparosan合成低分子量肝素打下基础。首先，利用PCR技术成功地从e. coli k5克隆到了产heparosan关键酶基因kfic，并将测序结果于NCBI上进行BLAST比对，获得的kfiC基因与escherichia coli Genomic Island II, strain Nissle1917的同源性为100%。在成功克隆目的基因kfic的基础上，本文成功构建重组表达质粒peT28b-kfic，并将其转入到e. coli BL21（De3）宿主菌中，实现少量的表达但是表达不稳定。考察了分离胶浓度和heparosan上样量对多糖PAGe效果的影响，当分离胶浓度为10%时多糖的分离效果最好;Heparosan粗品的上样量1.5mg， heparosan纯品的上样量1mg以及商品化肝素钠的上样量0.06mg为宜。考察了生物解聚法、化学解聚法和物理解聚法中各因素对heparosan解聚结果的影响。结果表明，肝素酶Ⅱ（HepⅡ）能有效地解聚heparosan，最佳的酶解缓冲液为酶解缓冲液B即100mM乙酸钠、0.01%BSA和10mM乙酸钙，pH7.0;最佳酶用量为19U/mL;最佳酶解反应时间是1.5h。H2O2对heparosan的解聚效果明显，解聚反应的最佳乙酸浓度为4.5%、H2O2浓度为6%、反应温度为55℃和反应时间为5h。超声波法也能解聚heparosan，随着时间的增加，产物的相对分子量逐渐降低;加入NaNO2的超声波解聚较普通超声波解聚效率高，即NaNO2在超声波解聚heparosan的过程中能起到加速heparosan解聚的作用。

关键词： e.coli k5 kfiC 基因克隆 Heparosan 解聚 PAGe

*** k5及其Δ waaR菌株荚膜多糖发酵制备及分子量分析

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*** K5及其Δ waaR菌株荚膜多糖发酵制备及分子量分析

作者：刘晓波浙江工业大学

学位级别：硕士

肝素是一种高度硫酸化的氨基聚糖,呈酸性,临床上被广泛用作抗凝血剂。硫酸乙酰肝素的硫酸化程度较肝素低,也有抗凝血活性,但弱于肝素的作用。escherichia coli k5的荚膜heparosan的多糖链由葡萄糖酸及乙酰葡萄糖胺的重复二糖单位组成,... 详细信息

肝素是一种高度硫酸化的氨基聚糖,呈酸性,临床上被广泛用作抗凝血剂。硫酸乙酰肝素的硫酸化程度较肝素低,也有抗凝血活性,但弱于肝素的作用。escherichia coli k5的荚膜heparosan的多糖链由葡萄糖酸及乙酰葡萄糖胺的重复二糖单位组成,其糖链骨架结构与肝素及硫酸乙酰肝素的糖链相似,heparosan可以经酶化学修饰制备肝素或硫酸乙酰肝素。因而,escherichia coli k5可用于大量制备heparosan,以满足人工非动物源肝素或硫酸乙酰肝素生产所需。为了实现大量发酵制备纯度较高的*** k5荚膜多糖,首先考察了发酵培养基组成对*** k5产荚膜多糖的影响,发现培养基中添加葡萄糖对*** k5产荚膜多糖有利,有机氮源对*** k5发酵产荚膜多糖也有一定的影响。在确定较佳发酵培养基组成基础上,考察了几种流加补料策略对*** k5在5L发酵罐中发酵的作用效果,发现溶解氧水平是影响*** k5在5 L发酵罐中生长和产heparosan的重要因素,用于pH控制的NH·HO也会对菌体的生长产生影响。本文考察了分离纯化工艺及条件对获得多糖样品纯度的影响,比较确定了较经济,适用于*** k5荚膜多糖初级分离的硫酸铵沉淀法。同时对waaR基因(编码α-1,2-糖基转移酶,该基因的缺失会影响荚膜多糖的稳定性)敲除突变株*** k5ΔwaaR发酵制备heparosan样品及其分子量分布情况进行分析。凝胶渗透色谱分析及多糖凝胶电泳结果均显示突变株*** k5?waaR及野生菌株*** k5的荚膜多糖分子量的差异,突变株的heparosan平均分子量较低,提示了突变株发酵制备的heparosan可用于制备低分子量肝素。

关键词： e.coli k5 荚膜多糖 waaR 肝素前体大肠杆菌发酵

肝素酶Ⅰ、Ⅲ的表达和应用及*** k5 waaR基因的敲除

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肝素酶Ⅰ、Ⅲ的表达和应用及*** K5 waaR基因的敲除

作者：吕沈聪浙江工业大学

学位级别：硕士

低分子量肝素是一种广泛应用于临床治疗的抗凝血药物。Heparosan是一类天然酸性多糖,在e. coli k5里以荚膜多糖的形式合成,分子量为10-20kDa,是生产肝素和硫酸乙酰肝素的前体物质。通过生物途径法从heparosan出发制备heparin的研究至关... 详细信息

低分子量肝素是一种广泛应用于临床治疗的抗凝血药物。Heparosan是一类天然酸性多糖,在e. coli k5里以荚膜多糖的形式合成,分子量为10-20kDa,是生产肝素和硫酸乙酰肝素的前体物质。通过生物途径法从heparosan出发制备heparin的研究至关重要。本课题以制备低分子量肝素为目的,表达纯化了肝素酶Ⅰ和肝素酶Ⅲ,并将两种酶分别应用于heparin和heparosan的解聚。为了能够定量e. coli k5发酵产物中的heparosan,建立了一种基于肝素酶Ⅲ解聚heparosan的检测样本中heparosan含量的酶学方法。同时为了提高e. colik5的heparosan产量,应用Red同源重组技术敲除了合成e. coli k5脂多糖外核的关键基因waaR。用IPTG诱导携带HepA基因的工程菌成功表达了肝素酶Ⅰ,分子量为44.83kDa。通过低温培养以及分子伴侣的协助,获得部分可溶性蛋白。将可溶性蛋白经Ni-NTA亲和层析,纯化后的酶比活为10427.50U/mg,纯化了6.47倍。将肝素酶Ⅰ应用于heparin的解聚,发现解聚效果良好。同样诱导携带HepC基因的工程菌成功表达了肝素酶Ⅲ,分子量为73.07kDa,并对酶的生产条件进行了优化。将得到的粗酶同样过柱分离纯化,纯化后酶比活为5372U/mg,纯化了1.61倍。将肝素酶Ⅲ应用于heparosan的解聚,解聚效果良好。利用肝素酶Ⅲ特异性解聚heparosan的功能,建立了一种检测样本heparosan含量的酶学方法。该法反应温和,而且操作简捷,只需通过检测酶反应产物的吸光度,就可以从标准曲线公式中推算出待测液heparosan的浓度。以*** k5基因组为模板,利用PCR技术成功克隆了waaR基因。通过NCBI同源比对,发现其与e. coli strain F632waaR基因相似度为99%,有两个碱基不同。将pkD46导入e. colik5,使宿主能够表达λRed重组酶。再设计含有两端各56bp同源臂的敲除引物,以pkD4为模板,PCR扩增得到含有卡纳霉素抗性基因的打靶DNA。将打靶DNA电转化入宿主细胞,LB培养基复苏,发现复苏过夜比仅复苏2h能够得到更多具备卡那霉素抗性的转化子。转化子经PCR测序验证,重组框架全长1607bp,两端同源臂完整存在,而剩余的waaR基因序列已经被筛选基因所替换。透射电镜比较野生株和突变株的荚膜形态,发现野生株表面存在一层毛绒状的物质,应为荚膜多糖层,而突变株表面较为光滑,未见荚膜。

关键词： e.coli k5 heparosan 肝素酶解聚基因敲除 waaR