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Botryosphaeria dothidea病毒dsrna的多样性研究

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Botryosphaeria dothidea病毒dsRNA的多样性研究

作者：赵迎彤山东农业大学

学位级别：硕士

Botryosphaeria dothidea是林果溃疡类病害的重要病原菌,分布广泛,严重影响林果的健康,致使林果树势衰弱,品质下降。目前生产上主要通过综合运用植物检疫,抗病品种选育,营林措施和化学防治等管理措施控制病害,但防控效果亟待加强,找寻... 详细信息

Botryosphaeria dothidea是林果溃疡类病害的重要病原菌,分布广泛,严重影响林果的健康,致使林果树势衰弱,品质下降。目前生产上主要通过综合运用植物检疫,抗病品种选育,营林措施和化学防治等管理措施控制病害,但防控效果亟待加强,找寻新的病害控制策略和方法是目前病害科学防控的重要议题。生物防治方法因其持效和环境安全,显示出广阔的应用前景并日益受到人们的关注。从病原真菌中发现真菌病毒弱毒株系进而抑制病原真菌致病力发挥从而开发应用必将为林果溃疡类病害生物防治提供新思路和新方法。dsrna病毒是真菌生物防治中应用最为广泛的一类真菌病毒。从Bdothidea真菌中发现和分离dsrna病毒,寻找新的真菌病毒弱毒株系并应用于Bdothidea林果溃疡类病害的防控,具有十分重要的价值和意义。本研究在dsrna病毒分离体系建立的基础上,对来自中国环渤海湾地区的34株***菌株中dsrna病毒的分布和多样性,带毒菌株与非带毒菌株在菌落形态、生长速度及菌株内的遗传稳定性方面进行了研究,研究结果如下：1.初步建立了B. dothidea dsrna病毒分离方法以sdaull-119和sdaul2-60为供试菌株,分别用水饱和酚和Tris-饱和酚作为抽提剂提取dsrna。从操作的方便性和dsrna提取量两个指标综合考虑,Tris-饱和酚法是提取B. dothidea dsrna病毒首选的分离方法。2.明确了B. dothidea病毒dsrna的多样性通过对供试的34个菌株进行dsrna的提取,检测到7个菌株存在真菌病毒,其存在率为20.59%,说明dsrna病毒在所分离的B. dothidea菌株中存在不普遍;通过琼脂糖凝胶电泳发现,7个菌株内的dsrna病毒存在多样性,说明这7个菌株内存在的dsrna病毒属于不同类型的病毒。在sdaul2-60内获得了两条病毒序列,通过同源性比较分析,鉴定为双分体病毒BdPV1;sdaull-119菌株内获得1条病毒序列,通过同源性比较分析,鉴定为整体病毒,命名为B. dothidea victorivirus1(BdVV1)。这也是首次在B. dothidea不同菌株中发现双分体病毒和整体病毒。3.测定了B. dothidea带毒菌株菌与非带毒菌株培养学生长特性和致病力通过对7个带毒菌株与27个非带毒菌株在菌落特征、生长速度以及致病力等方面的观察测定,结果表明带毒菌株和非带毒菌株的培养学特征、生长速度差异、致病力强弱因菌株而异,与不同***菌株内病毒的存在相关性不明显。4.探究了B. dothidea病毒dsrna的遗传稳定性对sdau12-60和sdau11-119菌株进行菌尖分离继代培养5代后,检测第5代菌株内病毒dsrna的存在情况,结果说明B. dothidea病毒dsrna能够稳定遗传,在真菌中存在很稳定。

关键词：葡萄座腔菌真菌病毒 dsrna 多样性双分体病毒整体病毒

应用dsrna对旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能的初步研究

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应用dsRNA对旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能的初步研究

作者：于鹏成东北农业大学

学位级别：硕士

旋毛虫病是世界范围内一种重要的食源性寄生虫病。旋毛虫分泌的丝氨酸蛋白酶抑制剂在幼虫发育过程中发挥着关键的作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂也是早期宿主免疫反应的靶分子抗原,可以作为新的抗原用于旋毛虫感染的早期诊断。本研究应用dsRN... 详细信息

旋毛虫病是世界范围内一种重要的食源性寄生虫病。旋毛虫分泌的丝氨酸蛋白酶抑制剂在幼虫发育过程中发挥着关键的作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂也是早期宿主免疫反应的靶分子抗原,可以作为新的抗原用于旋毛虫感染的早期诊断。本研究应用dsrna干扰技术沉默旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的表达,进一步从体外存活、侵入肠上皮细胞情况、体内发育情况、雌虫生殖力以及对宿主免疫的影响几个方面进行分析,从而为研究Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能奠定基础。本研究通过浸泡和电转两种方法将特异性dsrna-TsKaSPI导入旋毛虫肌幼虫和成虫体内,而后应用实时荧光定量PCR检测肌幼虫和成虫TsKaSPI基因转录水平,Western-blot检测肌幼虫TsKaSPI基因蛋白水平。结果表明,肌幼虫和成虫该基因转录水平与对照组相比,浸泡法降低了59.36%、67.80%(Pdsrna-TsKaSPI最优干扰浓度为30μg/ml。同时设计一条Tsp03044基因实时荧光引物,用来验证dsrna干扰的特异性。结果表明,TsKaSPI基因转录水平与对照基因Tsp03044相比明显降低,即dsrna-TsKaSPI只能引起与它同源基因的沉默。随后研究dsrna-TsKaSPI经浸泡和电转两种方法处理后,体外连续培养6d观察每1d转录水平的变化。结果表明,浸泡法在培养第1d转录水平有所降低,随后在第3d转录水平与对照组相比显著降低了63.21%(P0.05),电转法存活率为96%、91%、82%、67%、61%、52%(P>0.05),与对照组相比无显著性差异,推测,TsKaSPI基因对旋毛虫体外存活方面未产生影响。体外侵染肠上皮细胞结果表明,TsKaSPI处理组与对照组相比,作用5h时浸泡法与电转法侵入率分别为41%、43%,明显低于对照组,同时随着培养时间增加,侵入肌幼虫的数量逐渐增多,在第5h时入侵率达到最佳。推测,TsKaSPI基因沉默后对肌幼虫体外侵入肠上皮细胞有一定的抑制作用。将dsrna导入后的肌幼虫经口接种小鼠,观察TsKaSPI基因沉默对肌幼虫体内发育的影响。结果表明,6d肠道成虫和35d肌幼虫的减虫率与对照组相比分别为36.22%和31.87%,同时发现雌虫PBS组、e GFP对照组和TsKaSPI的处理组新生幼虫量分别为49.20±5.93、49.40±4.62、50.80±4.32(P>0.05),处理组与对照组相比雌虫新生幼虫数没有明显的差异,推测,TsKaSPI基因与肌幼虫在宿主体内发育方面有重要的影响,而与雌虫生殖力关系不大。本研究通过检测小鼠脾淋巴细胞CD4CD8细胞数以及血清中抗体水平,进一步分析了TsKaSPI基因沉默后对宿主免疫方面的影响。流式细胞术(FCM)检测结果显示,TsKaSPI处理组CD3+CD4、CD3+CD8细胞数与PBS对照组相比明显增加,CD4/CD8比值也明显上升。同时,ELISA检测结果显示,TsKaSPI处理组IgG1、IgG2a、IgM抗体水平与对照组相比明显降低,IgG1/IgG2a比值也显著降低。因此,我们初步认为TsKaSPI基因的沉默诱导宿主Th1型细胞免疫反应增强,引起Th2型体液免疫减弱。综上所述,本研究证实dsrna可明显抑制Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的转录和表达、肌幼虫对肠上皮细胞的侵入及幼虫在小鼠体内发育,同时促进Th1型细胞免疫应答,使Th2型体液免疫效应减弱。说明Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂不仅在旋毛虫侵入宿主肠粘膜及发育过程中起着非常重要的作用,而且在与宿主免疫的相互作用中也发挥着非常重要的作用,为进一步研究旋毛虫基因功能打下了坚实基础。

关键词：旋毛虫 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂 dsrna

V-ATPaseA、AK2和HR3基因dsrna原核表达及其对舞毒蛾生长发育影响

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V-ATPaseA、AK2和HR3基因dsRNA原核表达及其对舞毒蛾生长发育影响

作者：王晓琪东北林业大学

学位级别：硕士

舞毒蛾(Lymantria dispar)是世界性食叶害虫,具有食性杂、生命力强和危害范围广泛等特点,严重危害植物的生长,对我国经济和生态造成巨大的损失。液泡型H-ATP酶(Vacuolar-type proton ATPase)是一种转运真核细胞阳离子的ATP酶,在原生质... 详细信息

舞毒蛾(Lymantria dispar)是世界性食叶害虫,具有食性杂、生命力强和危害范围广泛等特点,严重危害植物的生长,对我国经济和生态造成巨大的损失。液泡型H-ATP酶(Vacuolar-type proton ATPase)是一种转运真核细胞阳离子的ATP酶,在原生质膜和细胞器内膜系统中广泛存在,对昆虫的蜕皮、生殖、生长发育等生理活动产生影响;腺苷酸激酶2(Adenylate Kinase 2,AK2)在线粒体膜间空间的腺嘌呤核苷酸代谢中起着关键作用,影响昆虫的生长发育和细胞增殖;蜕皮激素接受子(Hormone Receptor 3,HR3)作为一种蜕皮转录因子,调控昆虫的蜕皮、表皮形成和卵巢形成等生理活动。本研究以舞毒蛾为研究对象,克隆获得V-ATPaseA、AK2和HR3基因c DNA全长,采用实时荧光定量RT-PCR技术分析V-ATPaseA、AK2和HR3基因时空表达模式,成功构建dsrna原核表达载体,转入大肠杆菌HT115(DE3),并利用IPTG成功诱导dsrna表达,通过饲喂含有V-ATPaseA、AK2和HR3基因dsrna表达大肠杆菌饲料,探究基因沉默对舞毒蛾幼虫生长发育以及变态发育的影响。主要研究结果如下:1、克隆获得LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因序列,开放阅读框(ORF)分别为1851 bp、1473 bp和729 bp,分别编码616、490和242个氨基酸;蛋白分子量分别为68.04 kDa、26.91 kDa和55.23 kDa;理论等电点(p I)分别为5.24、8.64和6.98;LdV-ATPaseA和LdHR3为碱性蛋白,LdAK2为酸性蛋白;三种蛋白均无信号肽和跨膜结构域。2、采用实时荧光定量RT-PCR分析LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因在不同发育阶段和组织中的表达。结果显示,LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因各个发育阶段均有表达,且均在雌蛹期的表达量较高,分别为对照卵的1.81倍、6.63倍和19.25倍,推测LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因可能参与舞毒蛾生殖功能。LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因各个组织表达量具有特异性,LdV-ATPase和LdAK2在精巢的表达量较高,分别为对照脂肪体的30.80倍和13.68倍;LdHR3在表皮的表达量最高,为对照脂肪体的22.98倍,三个基因在肠道和表皮中表达量相对较高,推测可能影响舞毒蛾取食和蜕皮。3、成功构建LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因原核表达载体,转入大肠杆菌HT115(DE3),通过IPTG诱导表达出相应的dsrna。在舞毒蛾2龄和3龄幼虫期分别饲喂三个基因的dsrna,并检测三个基因的沉默效果。研究结果表明,2龄幼虫期LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因沉默效率分别为96.24%～98.35%,27.06%～85.73%和62.15%～95.64%;3龄幼虫期LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因沉默效率分别为39.71%～63.97%,33.63%～91.45%和61.81%～95.63%。以上结果表明舞毒蛾2龄和3龄幼虫饲喂dsrna靶基因m RNA表达水平均显著低于对照,说明饲喂原核表达dsrna能够有效沉默LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因。4、LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因沉默影响舞毒蛾生长发育。饲喂含有LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因dsrna饲料的幼虫取食量、体重以及体重累计增长率均显著降低。2龄幼虫期和3龄幼虫期起始饲喂3个基因dsrna均可以有效降低雌蛹重;饲喂dsLdAK2和dsLdHR3饲料可导致舞毒蛾雄蛹重显著低于对照。舞毒蛾2龄和3龄幼虫期起始饲喂dsLdV-ATPaseA、dsLdAK2和dsLdHR3死亡率显著升高。2龄幼虫期沉默LdV-ATPaseA、LdAK2和LdHR3基因导致蛹期畸形率显著升高;3龄幼虫起始饲喂dsLdHR3引起蛹期畸形率显著升高,均出现蜕皮缺陷。2龄起始饲喂dsLdV-ATPaseA和dsLdHR3的舞毒蛾化蛹率均显著降低,3龄幼虫期起始沉默LdAK2基因导致化蛹率显著降低。2龄和3龄幼虫期起始基因沉默均致使雌成虫产卵量显著降低。2龄起始LdV-ATPaseA基因沉默导致6龄幼虫期和2龄～6龄幼虫期总发育时间和蛹期发育时间显著延长,饲喂dsLdAK2和dsLdHR3引起6龄幼虫期和2龄～6龄幼虫期总发育历期显著延长;3龄起始饲喂dsLdAK2导致4龄幼虫期和蛹期发育时间显著延长,饲喂dsLdHR3导致蛹期发育时间显著延长。综上所述,通过舞毒蛾2龄和3龄幼虫期起始饲喂LdV-ATPas

关键词：舞毒蛾功能基因生长发育原核表达 dsrna

金针菇病毒dsrna快速检测和脱毒方法的研究

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金针菇病毒dsRNA快速检测和脱毒方法的研究

作者：张俊玲南京农业大学

学位级别：硕士

金针菇(Flammunlinavelutipes)是一种栽培范围广、栽培量大的食用菌。病害防控是金针菇栽培生产过程中重要的技术难点,病毒病是众多病害的一种,具有潜伏期长、病症不稳定和不明显等特点,一旦发生将造成巨大的经济损失。因此,对金针菇病... 详细信息

金针菇(Flammunlinavelutipes)是一种栽培范围广、栽培量大的食用菌。病害防控是金针菇栽培生产过程中重要的技术难点,病毒病是众多病害的一种,具有潜伏期长、病症不稳定和不明显等特点,一旦发生将造成巨大的经济损失。因此,对金针菇病毒快速检测,对带病毒菌株进行脱毒处理,为研究和生产提供无病毒优质菌种,对优化市场种质资源、育种选材、栽培生产等具有重要意义。本研究以39个金针菇品种为研究对象,其中21个国内市场上主栽品种,利用dsrna技术、透射电镜、反转录PCR(RT-PCR)等分子生物学和病毒学技术对病毒进行检测和鉴定。比较试剂盒和Redzol这两种dsrna检测方法,以及研究不同处理对dsrna提取的影响,从而建立病毒快速检测方法和体系。采用菌丝尖端分离、组织分离(原基、小菇体、菌褶)、原生质体再生、原生质体单核化、有性生殖和核迁移法共6种对带毒菌株进行脱毒研究,对不同脱毒处理菌株的菌丝生长速度、生物量、单瓶产量等生物学和栽培性状进行测定,结果显示如下:1.39个金针菇品种中只在市场主栽品种F-4889、F-4891中提取到dsrna,大小约2.0kb,透射电镜观察到病毒粒子直径大小约25nm,与已报道FvBV相似,NCBI序列比对部分基因组与FvBV相似性均达99%,证明该病毒为FvBV。2.比较两种dsrna提取方法,发现Redzol法是一种成本低、速度快、易操作的dsrna检测方法,尤其其检测成本是试剂盒法的1/10倍,适于普通实验室和食用菌生产企业使用;优化dsrna提取方法—Redzol法,从而建立病毒快速检测体系。3.对6种脱毒方法的脱毒效果进行比较,结果表明:组织分离法、原生质体再生法均未能获得脱毒菌株,而菌丝尖端分离、原生质体单核化、有性生殖和核迁移法均可得到脱毒菌株,脱毒率分别为25.0%、7.5%、57.5%、100%;以上脱毒菌株的获得推测FvBV存在细胞质中,而非细胞核内;携带FvBV菌株可将病毒垂直传播给担孢子;在杂交过程中,携带FvBV菌株细胞内的病毒未能随着寄主细胞核的迁移水平传播给无毒菌丝。4.不同脱毒处理菌株菌丝生长速度、生物量、漆酶活力等测定结果表明:TIPS、PMH、NM脱毒菌株与原菌株、未脱毒菌株相比均有所增加,PMH、NM脱毒菌株达到显著差异水平,但TIPS未达到显著水平;栽培实验表明:TIPS、PMH、NM脱毒菌株发菌时间、形成原基时间和子实体发育期均短于带毒菌株,且单瓶产量、菌柄直径大于带毒菌株,也达到显著性差异,而脱毒菌株之间无显著差异,推测FvBV的存在对金针菇生长发育有一定抑制作用;有性生殖法和核迁移法脱毒应用分别获得了 8株、107株脱毒菌株,并从中选出7株无毒优良株系。综上所述,在国内主栽金针菇菌种中检测到FvBV,为了尽早避免潜在的危害,可利用Redzol法对市场上的品种进行大规模的病毒检测,及时剔除携带病毒的生产用种,针对带病毒但菌种性状优良的菌种根据不同的目的、用途采用不同的脱毒方法,为栽培生产提供无毒优质菌种,促进我国金针菇产业健康稳定发展。

关键词：金针菇 dsrna FvBV 脱毒核迁移

马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）腺苷高半胱氨酸水解酶基因dsrna应用研究

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马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）腺苷高半胱氨酸水解酶...

作者：李晓旭石河子大学

学位级别：硕士

马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata(Say)，又称科罗拉多甲虫或科罗拉多马铃薯叶甲，属于鞘翅目的叶甲科，是世界性检疫害虫之一。自20世纪90年代传入我国新疆地区以来，对我国的马铃薯生产构成了严重威胁。本试验通过测试表达马铃... 详细信息

马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata(Say)，又称科罗拉多甲虫或科罗拉多马铃薯叶甲，属于鞘翅目的叶甲科，是世界性检疫害虫之一。自20世纪90年代传入我国新疆地区以来，对我国的马铃薯生产构成了严重威胁。本试验通过测试表达马铃薯甲虫腺苷高半胱氨酸水解酶dsrna (dsSAHase)的大肠杆菌对马铃薯甲虫的干扰作用，研究储存条件对大肠杆菌菌液的影响，并初步探讨马铃薯甲虫体液对dsrna的降解作用以及稳定剂的开发。研究结果对利用RNA干扰技术开发高效、专一性强、对人畜安全、对环境无污染的新型杀虫剂具有一定意义。研究主要得出以下结论： 1、dsSAHase对马铃薯甲虫RNA干扰效应试验结果：通过饲喂法将不同剂量dsSAHase导入马铃薯甲虫体内，运用线性回归方法测算各龄期LC50;同时观测饲喂后成虫的产卵数，解剖观察雌成虫卵巢发育情况。dsSAHase对马铃薯甲虫各龄期幼虫的的LC50分别为：1龄2.341μg/ml，2龄2.552μg/ml，3龄3.450μg/ml，4龄4.968μg/ml。饲喂dsSAHase后，马铃薯甲虫成虫表现为产卵极少或不产卵，其雌成虫卵巢发育等级与产卵情况正相关。dsSAHase对马铃薯甲虫幼虫具有显著致死作用、拒食作用以及抑制生长发育作用，各龄期幼虫的毒力随龄期增长而降低，对马铃薯甲虫成虫的繁殖能力具有显著的抑制效果。 2、不同储存条件对dsSAHase生物活性的影响研究结果：将用超纯水悬浮的表达dsSAHase的大肠杆菌***菌体，分为灭活与不灭活两个处理，分别于-20℃、4℃、室温、37℃储存24h、48h、72h，将未脱培养基的表达dsSAHase的大肠杆菌发酵液不灭活，在-20℃和室温条件下储存24h、48h、72h;将各处理大肠杆菌饲喂马铃薯甲虫2龄幼虫，检测各因素对其活性的影响，明确其储存条件。大肠杆菌脱培养基后低温储存24h后生物活性优于新鲜菌，高温储存24h后仍有较高活性，储存48h后效果减弱;大肠杆菌是否脱培养基在低温下储存对dsrna活性影响不大，高温下储存影响较大;大肠杆菌脱培养基后储存则温度、是否灭活对活性影响不大。dsrna大肠杆菌菌体在-20℃、4℃、室温、37℃条件下可以在24h内储存。 3、马铃薯甲虫体液对dsrna的降解作用及聚乙烯亚胺（PEI）对dsrna的保护作用试验结果：马铃薯甲虫中肠液及淋巴液与dsSAHase在不同温度条件下体外孵育，观测其作用结果;构建聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)PEI-dsSAHase复合物，饲喂马铃薯甲虫2龄幼虫，观测PEI对dsSAHase的增效作用。马铃薯甲虫中肠液与淋巴液都降解dsSAHase，该降解作用受温度影响较小。单体dsSAHase菌液饲喂马铃薯甲虫2龄幼虫死亡率为55%，而PEI-dsSAHase复合物饲喂马铃薯甲虫2龄幼虫死亡率达到75%。dsrna会被马铃薯甲虫体液部分降解，而PEI与dsrna结合形成复合物，提高了dsrna的稳定性，抑制了dsrna在虫体内的降解。综上所述，马铃薯甲虫腺苷高半胱氨酸水解酶dsrna对马铃薯甲虫低龄幼虫毒力高于高龄幼虫，对雌成虫生殖能力具有一定的抑制作用。dsrna大肠杆菌菌体可在24h内保存。马铃薯甲虫体液对dsrna具有显著降解作用，PEI可保护dsrna，抑制dsrna在虫体内的降解。

关键词：马铃薯甲虫 RNAi dsrna 腺苷高半胱氨酸水解酶保幼激素

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葡萄座腔菌dsrna病毒鉴定及功能分析

葡萄座腔菌dsRNA病毒鉴定及功能分析

作者：于晓静山东农业大学

学位级别：硕士

葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)是危害林果病害的重要病原菌,危害严重。真菌病毒作为一类重要的生防因子,有望在该类病害病菌中发现和应用。本研究以19个***菌株为出发菌株,通过对其中13个菌株真菌病毒的提取、分离、鉴定及功能分... 详细信息

葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)是危害林果病害的重要病原菌,危害严重。真菌病毒作为一类重要的生防因子,有望在该类病害病菌中发现和应用。本研究以19个***菌株为出发菌株,通过对其中13个菌株真菌病毒的提取、分离、鉴定及功能分析,明确***真菌病毒的分类地位及功能,为明确***真菌病毒的系统演化及生物防控新的思路提供依据,主要研究结果如下:筛选出了dsrna病毒高效的分离方法以sdau11-122和sdau11-64为供试菌株,选用水饱和酚作为抽提剂和真菌RNA提取酶切法进行比较,以操作的方便性和dsrna的提取的质量两个指标为标准,筛选出真菌RNA提取酶切法是提取*** dsrna病毒是高效的方法,该方法的提取时间缩短了一半,提取的质量好。其他sdau11-65、sdau11-71等17个菌株按此方法进行了dsrna的提取,验证了方法的高效性且发现病毒具有多样性。明确***部分菌株dsrna病毒的分类地位通过全基因测序、BLAST比对,发现sdau11-122菌株的病毒的RdRp大小为1408 bp,CP基因大小为1562 bp,通过同源性对比,其与Botryosphaeria dothidea partitivirus 1的同源性达到了99%,属于双分体病毒科(Paritiviridae)双分体病毒属(Partitivirus),命名为BdPV2;sdau11-64菌株的病毒序列片段大小为5161 bp,经对比后发现其与Sphaeropsis sapinea RNA virus 1的同源性达到了99%,属于整体病毒科(Totiviridae)维多利亚病毒属(Victorivirus),将其命名为Botryosphaeria dothidea Victorivirus 2(BdVV2),这是首次在***中发现该种真菌病毒。明确了13个真菌病毒的功能通过对13个野生菌株采用原生质体制备、结合病毒唑得到脱毒菌株,提取病毒粒子并转染获得再生菌株,通过测定野生菌株、脱毒菌株和再生菌株在菌落颜色、菌落生长特性和人工刺伤接种方法,研究结果表明:脱毒菌株sdau11-119和sdau11-65与野生及再生菌株颜色差异表现较小其他菌株颜色均有一定差异;sdau11-122、sdau11-71、sdau12-60等菌株野生、脱毒及再生菌丝生长速率无差异,致病力测定野生菌株和再生菌株病斑较大,而脱毒后的菌株病斑的较小,说明病毒对病原菌具有促生作用;sdau11-64、sdau11-119、sdau11-86、sdau11-80、sdau12-40等菌株生长速率脱毒菌株高于野生及再生菌丝,致病力测定野生菌株和再生菌株病斑较小,而脱毒后菌株病斑较大,存在弱毒现象,致病力较弱,具有重要的生防价值。

关键词：葡萄座腔菌真菌病毒 dsrna 整体病毒双分体病毒功能分析

OGD诱导dsrna活化NLRP3信号通路及其相关炎性因子在脑损伤中的作用机制

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OGD诱导dsRNA活化NLRP3信号通路及其相关炎性因子在脑损伤中的作...

作者：王利第四军医大学

学位级别：硕士

缺血性脑损伤根本病理改变是神经元损害,是导致患者残死率高的核心原因之一[1]。而神经元损害除了细胞接受外源刺激导致蛋白表达和信号通路异常,细胞内源性转录产物表达改变也逐渐被发现是细胞损伤的关键因素[2]。近年来,研究发现双链RN... 详细信息

缺血性脑损伤根本病理改变是神经元损害,是导致患者残死率高的核心原因之一[1]。而神经元损害除了细胞接受外源刺激导致蛋白表达和信号通路异常,细胞内源性转录产物表达改变也逐渐被发现是细胞损伤的关键因素[2]。近年来,研究发现双链RNA(double-stranded,ds RNA)可能是一种危险信号,通过细胞危险信号模式应答,引起细胞反应直至细胞凋亡[3]。但ds RNA是否作为一种内源性危险信号真正参与神经元损害,以及具体的调控机制尚不清楚,急需深入研究。因此,本实验的研究目标是探索ds RNA在缺血性脑损伤中的作用和调控机制。实验一OGD诱导HT22细胞产生B1 RNA形式的ds RNA目的:验证HT22细胞氧糖剥夺后产生内源性ds RNA,明确ds RNA的组成成分和序列。方法:1.培养建立HT22细胞的OGD(氧糖剥夺)模型,建立体外神经元细胞缺血性模型。光镜下观察细胞生长情况,神经元细胞成熟后OGD处理,光镜下观察细胞形态,检测LDH(乳酸脱氢酶)活性,评价损伤模型。2.免疫荧光标记ds RNA的表达。利用特异性结合ds RNA的J2抗体标记,DAPI染核,荧光显微镜下观察Merge图像。3.建立ds RNA的c DNA文库,与小鼠B1 RNA序列比对。通过IP,q RT-PCR,反转录PCR,T-A克隆,琼脂糖核酸凝胶电泳实验,测序分析。结果:1.光镜下观察OGD 6小时后的HT22,细胞核膜形态发生变化,细胞缩小,细胞体肿胀,核固缩,空泡样疏松化,粗面内质网囊泡和线粒体肿胀。细胞损伤加剧。HT22细胞在OGD处理后与对照组相比较,LDH活性明显升高。OGD模型建立成功。2.荧光显微镜下清晰可见与J2抗体结合的ds RNA,在OGD 24小时组较之空白对照组明显增加,主要分布在核周胞质内。3.测序分析发现,OGD后产生的ds RNA与小鼠B1 RNA序列是相似的,而OGD后产生的ds RNA主要是215bp的B1 RNA。与小鼠的B1以及B1 DNA序列是一致的。琼脂糖核酸凝胶电泳实验和q RT-PCR实验中ds RNA的主要成分为B1 RNA。结论:HT22细胞在OGD处理后,细胞内产生的ds RNA的主要组成为B1 RNA,其与小鼠B1序列一致。实验二B1 RNA和NLRP3在OGD作用以及MCAO模型小鼠原代神经元细胞中的表达目的:离体小鼠大脑皮层神经元OGD模型和在体小鼠MCAO(小鼠大脑中动脉栓塞)模型中确认B1 RNA的产生以及NLRP3炎性通路的激活。方法:1.小鼠原代神经元OGD模型和小鼠MCAO模型建立。光镜下观察OGD后神经元的形态,LDH活性测定,小鼠神经功能评分,TTC染色。2.q RT-PCR检测小鼠-神经元细胞B1 RNA和NLRP3的表达。Western blot检测NLRP3的表达。pc DNA3.1-B1转染小鼠大脑皮层原代神经元细胞,通过MTS实验,q RT-PCR,Western blot实验分别检测B1 RNA转录和NLRP3的表达。结果:1.与正常的原代神经元对比,OGD作用2h后可见神经元细胞损伤,轴突变短甚至消失。神经元细胞在OGD处理后与对照组相比较,LDH活性明显升高。神经功能评分显示MCAO小鼠神经功能异常,TTC染色显示MCAO小鼠大脑出现苍白色缺血区域,模型建立成功。2.免疫荧光显示MCAO小鼠神经元细胞中ds RNA和NLRP3表达显著。q RT-PCR和Western blot结果显示小鼠MCAO后B1和NLRP3表达升高。OGD组和pc DNA3.1-B1实验组,NLRP3蛋白表达量显著高于对照组。而pc DNA3.1-B1+si NLRP3实验组,NLRP3的蛋白表达量显著低于pc DNA3.1-B1实验组。同时,OGD+si NLRP3实验组,NLRP3的蛋白表达量显著低于OGD组。该结果提示,在我们的实验中成功干涉了OGD以及B1 RNA诱导的NLRP3表达。MTS实验显示OGD作用以及转染pc DNA3.1-B1,可显著抑制小鼠原代神经元细胞的生长,。干涉OGD和pc DNA3.1-B1组小鼠原代神经元细胞中NLRP3的表达可改善细胞的生长活性。结论:OGD模型以及小鼠MCAO模型中,小鼠大脑皮层原代神经元细胞B1 RNA和NLRP3在表达上调。B1RNA和NLRP3的增多可抑制小鼠大脑皮层原代神经元细胞的生长。实验三B1 RNA以及NLRP3通路调控的炎性因子在OGD模型HT22细胞中的表达及关系目的:研究B1与NLRP3通路调控的炎性因子在缺血性脑损伤中的表达。方法:通过Western blot,q RT-PCR,ELISA等实验检测OGD作用、转染pc DNA3.1-B1和pc DNA3.1-B1+si NLRP3后,HT22细胞中NLRP3,

关键词：缺血性脑损伤 dsrna NLRP3 氧糖剥夺 HT22细胞

利用dsrna诱导烟草抗黄瓜花叶病毒病的研究

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利用dsRNA诱导烟草抗黄瓜花叶病毒病的研究

作者：何明远湖南农业大学

学位级别：硕士

本研究以在植物体内转录出RNA沉默的高效诱导因子—双链RNA(dsrna)为目标，将黄瓜花叶病毒(CMV)移动蛋白基因(MP)以反向重复的方式与外壳蛋白基因(CP)相连，并定向插入到植物表达载体pBIN438上35S启动子下游;以农杆菌介导法转化烟草，获... 详细信息

本研究以在植物体内转录出RNA沉默的高效诱导因子—双链RNA(dsrna)为目标，将黄瓜花叶病毒(CMV)移动蛋白基因(MP)以反向重复的方式与外壳蛋白基因(CP)相连，并定向插入到植物表达载体pBIN438上35S启动子下游;以农杆菌介导法转化烟草，获得34株转基因烟草，并对这转基因烟草进行了抗CMV的研究。根据分子克隆等方法构建得到具有反向重复MP基因的质粒P-M，用XbaI和BamhI双酶切，电泳割胶回收约2200bp大小的短片段，并与同样XbaI和BamhI双酶切后且已去磷酸化的pBIN438连接，鉴定筛选得到含有CMV MP基因的反向重复植物表达载体pBIN-CMV MP(i／r)。用三亲交配法将植物表达载体pBIN-CMV MP(i／r)转入根癌农杆菌EHA105菌株中，经鉴定的阳性转化子用于烟草转化。烟草转化采用农杆菌介导法，将含pBIN-CMV MP(i／r)基因的农杆菌与烟草叶盘共培养，经卡那霉素抗性筛选获得转基因再生植株34株，所有植株的PCR检测均为阳性。。用CMV病汁液接种30株转基因烟草，症状观察和ELISA检测表明，转基因烟草植株对CMV表现出一定的抗病性反应。

关键词：黄瓜花叶病毒移动蛋白基因 dsrna RNA沉默

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香菇dsrna病毒脱毒研究

香菇dsRNA病毒脱毒研究

作者：李京福建农林大学

学位级别：硕士

福建省最近几年大范围出现香菇烂菇、退菌及子实体畸形等现象,造成了严重的香菇减产。研究学者认为这些现象的发生可能与香菇病毒有关。还有的学者认为香菇烂筒可能与假石膏、假麸皮的使用及菇房温度激烈变化有关。本研究从福建省上杭... 详细信息

福建省最近几年大范围出现香菇烂菇、退菌及子实体畸形等现象,造成了严重的香菇减产。研究学者认为这些现象的发生可能与香菇病毒有关。还有的学者认为香菇烂筒可能与假石膏、假麸皮的使用及菇房温度激烈变化有关。本研究从福建省上杭县香菇烂筒中分离纯化了香菇菌株,经检测发现该菌株带有dsrna病毒。为了探讨香菇烂筒的原因,本实验设计了四因素三水平的正交实验,结果表明石膏好坏及菌株是否带毒对香菇菌丝生长有显著影响。出菇结果说明菌株带毒是子实体畸形的原因之一本研究探讨了两种香菇dsrna病毒的脱毒方法,菌丝尖端脱毒法和原生质体再生脱毒法。通过dsrna检测技术和dsrna RT-PCR检测技术的检测,发现,菌丝尖端脱毒法和原生质体脱毒法均能去除香菇dsrna病毒,但原生质体脱毒法脱毒效果更好,通过原生质体脱毒法获得了14株脱毒菌株。本研究还对不同脱毒处理的香菇菌株进行生理生化试验,试验结果表明：日平均生长速度比较中,L0183-Y03 (3.2592cm/d)、NX-J04-Y06(3.2600cm/d)、 N-J01-Y08(3.1816cm/d)和N-J12-Y03(3.1856cm/d)分别是其对应系列中菌丝生长速度最快菌株,CMC酶、漆酶和多酚氧化酶比较中,L0183-Y03(0.995、55.00、2.20)、NX-J04-Y06(0.905、50.10、2.00)和N-J12-Y03(0.905、50.04、2.00)分别是其对应系列中酶活最高菌株,而液体培养生物量和木聚糖酶差异显著性不明显。本研究对不同脱毒处理的香菇菌株与出发菌株进行了分子验证,试验结果表明：RAPD分子标记中共使用了7个引物进行多态性分析,发现香菇脱毒菌株与带毒菌株间没有特异性条带,说明脱毒菌株除了不携带病毒外,其他方面与出发菌株一致。最后,对脱毒菌株与出发菌株进行了出菇实验,除了子实体形态和污染率外,出菇产量和出菇时间差异不大。筛选出L0183-Y03满袋时间34d,转色时间26d,单朵重17g,柄长4.4cm,柄径1.0cm,盖径4.8cm,盖厚1.9cm,单产81g,带毒菌株在栽培过程中经常由于栽培条件的不适宜而引发病毒病,造成极大损失。无毒菌株的使用,可以避免病毒病的发生,有广泛的应用价值。

关键词：香菇 dsrna 烂筒脱毒生理生化出菇