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外源dsrna抗甘蔗花叶病毒干扰调控研究

外源dsRNA抗甘蔗花叶病毒干扰调控研究

作者：张姣安徽农业大学

学位级别：硕士

玉米（ZeamaysL.）是重要的粮食作物与饲料作物，也是现代蔬菜、食品、医药与化学工业的重要原料。然而，玉米病害尤其是玉米矮花叶病成了限制我国玉米产量与质量的重要因素。传统的育种方法由于抗性资源的匮乏及物种间的遗传隔离，使... 详细信息

玉米（ZeamaysL.）是重要的粮食作物与饲料作物，也是现代蔬菜、食品、医药与化学工业的重要原料。然而，玉米病害尤其是玉米矮花叶病成了限制我国玉米产量与质量的重要因素。传统的育种方法由于抗性资源的匮乏及物种间的遗传隔离，使抗病育种工作受到了极大的限制。利用基因工程技术对玉米进行遗传改良，以增强玉米抗病虫与耐逆境能力，提高产量，改善品质，这成为玉米遗传育种的一个新方向。植物抗病毒基因工程的策略有多种，研究表明利用RNAi原理介导的抗病性特异性强，比较容易获得高抗甚至免疫的转基因植株，为作物抗病毒基因工程提供了更有效的途径。本文利用RT-PCR扩增甘蔗花叶病毒cp基因特异性干涉片段，构建原核表达载体LMCP，利用IPTG诱导表达，并对诱导条件进行优化，利用细菌表达的dsrna提取液处理玉米植株，分析外源dsrna抗SCMV的效果。结果表明： 1、根据甘蔗花叶病毒cp基因序列设计特异性引物，RT-PCR扩增甘蔗花叶病毒cp基因上游及下游147bp和140bp的干涉片段。 2、利用pUCCRNAi克隆载体构建甘蔗花叶病毒cp基因反向重复序列克隆载体pUCCRNAi+2F，再插入到原核表达载体L4440中，构建原核表达载体LMCP，转化大肠杆菌HT115。 3、利用IPTG诱导并对诱导条件进行优化，结果表明，LMCP在大肠杆菌HT115（DE3）菌株中可表达产生预期大小的dsrna片段。而且当IPTG浓度为0.4~0.6mmol/L，诱导4h左右时表达量最高。 4、利用不同细菌表达的dsrna提取液喷洒4叶期玉米植株，结果发现，LMCP1dsrna及LMCP2dsrna对甘蔗花叶病毒的干涉效果明显，而且LMCP1dsrna的处理效果较LMCP2的好。 5、通过对dsrna的处理浓度、接种病毒的时间（持效期）、渗透性等参数进行优化。结果表明，外源dsrna提取液对甘蔗花叶病毒具有免疫作用，当dsrna稀释1/5以内时，对病毒侵染的干涉作用明显，当超过1/15时，处理效果大大下降。dsrna喷洒后3d之内接种病毒，抗病效果明显，超过7d则不明显。另外，添加一定浓度的渗透剂有利于提高外源dsrna的抗病效果。综上所述，本实验成功构建了表达载体LMCP，优化了诱导表达条件，并且建立了外源dsrna调控甘蔗花叶病毒的技术体系，为玉米及其它植物病毒病的防治提供了依据。

关键词：甘蔗花叶病毒 RNAi干涉 dsrna IPTG诱导

重组腺相关病毒载体dsrna天然免疫反应的检测

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重组腺相关病毒载体dsRNA天然免疫反应的检测

作者：马婵华侨大学

学位级别：硕士

背景与目的:重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)是具有前景的基因治疗载体之一,但rAAV的免疫毒性限制了其在这个领域的应用潜力。最近的研究表明在rAAV载体转导后的晚期,由rAAV基因组反向末端重复序列(Inverted t... 详细信息

背景与目的:重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)是具有前景的基因治疗载体之一,但rAAV的免疫毒性限制了其在这个领域的应用潜力。最近的研究表明在rAAV载体转导后的晚期,由rAAV基因组反向末端重复序列(Inverted terminal repeats,ITR)3,端启动子活性转录的负链RNA可与正链RNA退火形成双链RNA(Double-stranded RNA,dsrna),可能是造成转基因难以长期表达,且引起免疫反应的诱因。但目前研究还未有直接证据证明在rAAV转导晚期,确实存在载体相关dsrna,也未见dsrna先天免疫通路分子机制的研究。因此本研究的目的是通过锁式探针-滚环扩增(Pad Lock Probe-Rolling Circle Amplification,PLP-RCA)等技术,确认rAAV载体在转导后可以形成dsrna,并激活dsrna先天免疫反应,同时对dsrna免疫反应的分子机制进行了初步探讨。方法与结果:1.通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)验证了rAAV转导后可以转录形成负链RNA。2.鉴于负链RNA的产生量很少,且因细胞的异质性,PCR检测无法进行单细胞水平的分析,本研究继而比较基于荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)的RNAScope技术和PLP-RCA技术的特异性和灵敏度,结果表明PLP-RCA和RNAScope技术均具有较强的特异性,PLP-RCA的灵敏度较RNAScope更优。使用PLP-RCA技术连续检测携带增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)的rAAV转导Hela细胞后正负链RNA的表达,发现转基因mRNA在转导后1-4d的转录水平很高,从第5 d开始下降,与EGFP表达的趋势一致,mRNA的荧光信号主要分布在细胞核周围。而负链RNA在转导第1 d即可大量检出,在转导第7 d仍能检测到。这一结果支持正负链RNA退火产生dsrna的推测。3.通过免疫荧光法和酶联免疫法证明在rAAV转导的晚期,确实存在rAAV相关dsrna的表达。并使用PLP-RCA检测dsrna免疫传感器黑色素瘤分化相关基因5(Melanoma Differentiation Associated Gene 5,MDA5)和视黄酸诱导基因蛋白I(Retinoic Acid-inducible Gene I,RIG-Ⅰ)以及dsrna免疫反应产物干扰素β(IFNβ)的表达变化,探索dsrna激活的分子通路。发现在转导8 h时MDA5的表达增加,在第6 d达到峰值,而在相应的时间点基本没有检测到RIG-Ⅰ表达增加,IFNβ的表达也在转导第4 d开始被检测到。提示rAAV相关dsrna的表达,可以激活MDA5先天性免疫反应。最后采用PLP-RCA同时检测rAAV转导晚期正负转录本,以及dsrna先天性免疫相关分子MDA5、RIG-Ⅰ和IFNβ。能够清晰观察到mRNA、负链RNA、MDA5和IFNβ的荧光信号,而RIG-Ⅰ信号未被检测到,进一步说明rAAV相关dsrna的表达,可以激活MDA5先天性免疫反应。结论:1.提供了rAAV转导后可以形成dsrna的实验证据。2.对rAAV相关dsrna诱导的先天性免疫反应分子机制进行了分析,初步认为MDA5参与了该先天性免疫反应的激活。

关键词：正负链RNA dsrna MDA5 RIG-Ⅰ PLP-RCA

金针菇病毒dsrna快速检测和脱毒方法的研究

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金针菇病毒dsRNA快速检测和脱毒方法的研究

作者：张俊玲南京农业大学

学位级别：硕士

金针菇(Flammunlinavelutipes)是一种栽培范围广、栽培量大的食用菌。病害防控是金针菇栽培生产过程中重要的技术难点,病毒病是众多病害的一种,具有潜伏期长、病症不稳定和不明显等特点,一旦发生将造成巨大的经济损失。因此,对金针菇病... 详细信息

金针菇(Flammunlinavelutipes)是一种栽培范围广、栽培量大的食用菌。病害防控是金针菇栽培生产过程中重要的技术难点,病毒病是众多病害的一种,具有潜伏期长、病症不稳定和不明显等特点,一旦发生将造成巨大的经济损失。因此,对金针菇病毒快速检测,对带病毒菌株进行脱毒处理,为研究和生产提供无病毒优质菌种,对优化市场种质资源、育种选材、栽培生产等具有重要意义。本研究以39个金针菇品种为研究对象,其中21个国内市场上主栽品种,利用dsrna技术、透射电镜、反转录PCR(RT-PCR)等分子生物学和病毒学技术对病毒进行检测和鉴定。比较试剂盒和Redzol这两种dsrna检测方法,以及研究不同处理对dsrna提取的影响,从而建立病毒快速检测方法和体系。采用菌丝尖端分离、组织分离(原基、小菇体、菌褶)、原生质体再生、原生质体单核化、有性生殖和核迁移法共6种对带毒菌株进行脱毒研究,对不同脱毒处理菌株的菌丝生长速度、生物量、单瓶产量等生物学和栽培性状进行测定,结果显示如下:1.39个金针菇品种中只在市场主栽品种F-4889、F-4891中提取到dsrna,大小约2.0kb,透射电镜观察到病毒粒子直径大小约25nm,与已报道FvBV相似,NCBI序列比对部分基因组与FvBV相似性均达99%,证明该病毒为FvBV。2.比较两种dsrna提取方法,发现Redzol法是一种成本低、速度快、易操作的dsrna检测方法,尤其其检测成本是试剂盒法的1/10倍,适于普通实验室和食用菌生产企业使用;优化dsrna提取方法—Redzol法,从而建立病毒快速检测体系。3.对6种脱毒方法的脱毒效果进行比较,结果表明:组织分离法、原生质体再生法均未能获得脱毒菌株,而菌丝尖端分离、原生质体单核化、有性生殖和核迁移法均可得到脱毒菌株,脱毒率分别为25.0%、7.5%、57.5%、100%;以上脱毒菌株的获得推测FvBV存在细胞质中,而非细胞核内;携带FvBV菌株可将病毒垂直传播给担孢子;在杂交过程中,携带FvBV菌株细胞内的病毒未能随着寄主细胞核的迁移水平传播给无毒菌丝。4.不同脱毒处理菌株菌丝生长速度、生物量、漆酶活力等测定结果表明:TIPS、PMH、NM脱毒菌株与原菌株、未脱毒菌株相比均有所增加,PMH、NM脱毒菌株达到显著差异水平,但TIPS未达到显著水平;栽培实验表明:TIPS、PMH、NM脱毒菌株发菌时间、形成原基时间和子实体发育期均短于带毒菌株,且单瓶产量、菌柄直径大于带毒菌株,也达到显著性差异,而脱毒菌株之间无显著差异,推测FvBV的存在对金针菇生长发育有一定抑制作用;有性生殖法和核迁移法脱毒应用分别获得了 8株、107株脱毒菌株,并从中选出7株无毒优良株系。综上所述,在国内主栽金针菇菌种中检测到FvBV,为了尽早避免潜在的危害,可利用Redzol法对市场上的品种进行大规模的病毒检测,及时剔除携带病毒的生产用种,针对带病毒但菌种性状优良的菌种根据不同的目的、用途采用不同的脱毒方法,为栽培生产提供无毒优质菌种,促进我国金针菇产业健康稳定发展。

关键词：金针菇 dsrna FvBV 脱毒核迁移

原核表达的dsrna抗番木瓜环斑病毒的研究

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原核表达的dsRNA抗番木瓜环斑病毒的研究

作者：陈瑶海南大学

学位级别：硕士

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)引起的病毒病是制约番木瓜产业发展的重要限制因素。目前,在栽培技术上无法通过化学方法予以防治。国内外研究人员利用基因工程技术将PRSV的外壳蛋白、复制酶等基因转入番木瓜植株,培育了一... 详细信息

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)引起的病毒病是制约番木瓜产业发展的重要限制因素。目前,在栽培技术上无法通过化学方法予以防治。国内外研究人员利用基因工程技术将PRSV的外壳蛋白、复制酶等基因转入番木瓜植株,培育了一些抗PRSV的转基因番木瓜品种,但转基因植物在推广和应用方面仍存在许多问题。因此急需寻找一种广谱、安全的抗PRSV的新策略。RNA沉默机制的揭示为对植物抗病毒病提供了新思路。研究证明,外源提供的双链RNA(double-strand RNA, dsrna)同样能使植物获得良好的抗病效果。本研究通过OZ-LIC法(One-step, zero-background ligation-independent cloning)分别以PRSV外壳蛋白CP的三段不同大小的基因片段(279bp、432bp和861bp)构建了dsrna原核表达载体,命名为pSP-CP861,pSP-CP432和pSP-CP279。将这三种原核表达载体分别转入三种RNaseⅢ缺陷性菌株HT115、M-Jm109LacY、M-HMS174中,经IPTG诱导,结果表明：这三种缺陷型菌株均能分别表达预期大小(279bp、432bp、861bp)的CP-dsrna,且M-Jm109LacY菌株dsrna的表达量远高于其他两种缺陷型菌株。随后,分别将原核表达的三种CP-dsrna与瞬时植物表达载体pCP-GFP(表达CP-GFP融合蛋白)共转化番木瓜叶片原生质体,对不同长度的CP-dsrna的沉默效果进行了初步分析,通过共聚焦显微镜观测GFP发光率和RT-PCR对CP-GFP mRNA表达量的研究结果表明：原核表达载体表达的三种CP-dsrna均能在番木瓜叶片原生质体中下调CP-GFP融合基因的表达。进一步的原核表达的dsrna抗PRSV研究中,分别用诱导表达了dsrna的pSP-CP861/M-Jm109LacY、pSP-CP432/M-Jm109LacY、 pSP-CP279/M-Jm109LacY菌株细胞破碎液直接喷施接种了PRSV的番木瓜植株,30天后通过病症观察,各处理组中发病率分别为45%、60%和75%。利用Real Time RT-PCR对各处理组番木瓜植株中PRSV-NIa-Pro基因mRNA在0d,3d,6d,9d,12d,15d,18d,21d,24d,27d,30d的相对表达量进行分析,以监测PRSV增殖的动态变化,结果显示：喷施了这三种菌体裂解液的各处理植株中的病毒信号均比对照组弱,表现出一定的抗病效果,其中喷施pSP-CP861/M-JM1091acY菌株裂解液的处理组中的PRSV增殖的趋势最慢,说明原核表达的861bp的CP-dsrna对PRSV增殖具有较好的抑制作用。本研究的结果证明直接喷施原核表达的CP-dsrna能使番木瓜植株获得对PRSV的抗性,在探索安全、广谱的抗PRSV新策略和抗病毒制剂的产业化生产方面具有重要的应用前景。

关键词：番木瓜环斑病毒病毒抗性 OZ-LIC RNA沉默 RNaseⅢ缺失体 dsrna 荧光定量PCR

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黄瓜花叶病毒dsrna的研究

黄瓜花叶病毒dsRNA的研究

作者：陈虹浙江大学

学位级别：硕士

Double stranded RNA(dsrna)是植物RNA病毒复制过程的中间产物，这些dsrna的大小对应于RNA病毒的基因组，而正常的植物组织不含有或仅产生小分子量的dsrna，因此可通过提取dsrna对该类病毒进行检测、鉴定等方面的研究。黄瓜花叶病毒(Cuc... 详细信息

Double stranded RNA(dsrna)是植物RNA病毒复制过程的中间产物，这些dsrna的大小对应于RNA病毒的基因组，而正常的植物组织不含有或仅产生小分子量的dsrna，因此可通过提取dsrna对该类病毒进行检测、鉴定等方面的研究。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是一个典型的三分体正链RNA病毒，由于寄主范围广，危害大，并且易于接种，而一直被作为病毒模式种来研究。本文用CMV做为研究对象来探索dsrna提取的条件;利用dsrna技术分析该三分体病毒的各基因组在复制过程中的时序变化;同时用CMV卫星RNA的高拷贝特性，以获得高得足够的dsrna，用来制备dsrna抗体。研究分为三个部分。本文依据CMV在烟草等系统寄主上的快速复制和高拷贝特性探讨了不同条件对dsrna提取效果的影响，总结了提取dsrna的优化条件。结果显示：1)在17％乙醇浓度提取dsrna的效果最好;2)植物的生长状态影响dsrna的提取效果，幼嫩的植物组织提取dsrna的效果好，杂质少;3)比较接种后不同时间后提取dsrna的效果，以14天左右后提取的效果较好，此时提取5g的感病叶片可得到约2.5μg的卫星-dsrna;4)在1.5ml eppendorf管中多次离心代替纤维素柱层析的小量快速提取dsrna的方法也能收到较好的效果。 CMV的卫星RNA是一种依赖其辅助病毒CMV进行复制和扩散的亚病毒因子。本实验通过提取不同寄主(心叶烟、假酸浆、西葫芦)上，不同时间(接种后2d、4d、8d、16d、32d、48d、64d)CMV的dsrna，分析2个CMV毒株(不携带卫星RNA的CFq毒株和携带卫星RNA的CYi毒株)的基因组各组分dsrna含量随时间的变化以及卫星RNA对辅助病毒CMV复制的影响。结果表明：CMV基因组三组分的dsrna含量在第2～8天时比较接近，之后则RNA3-dsrna的含量一直较高，并在第16天时含量达到最高，而RNA2-dsrna与RNA1-dsrna的含量则下降，且两者比较接近;携带卫星RNA的CYi毒株其卫星-dsrna的相对含量始终高于各基因组dsrna的含量，卫星-dsrna与RNA3-dsrna的含量比值在不同寄主植物中则是西摘要葫芦>假酸浆>心叶烟，西葫芦上的比值显著高于其它两种寄主(第4～16天);RNA3与RNAI的dsrna含量比值在两个毒株间则是:C肠>CFq。以上现象说明卫星RNA与CMV基因组RNA存在寄主选择性，同时CMV基因组各组分也存在时序表达的差异。 CMV的卫星RNA有高拷贝、快速复制的特性，相应产生大量的dsrna，将纯化的卫星一dsrna与牛血清白蛋白交联制备成抗原，利用脂质体包裹，随后免疫动物，以获取针对dsrna的抗体，用来检测植物是否感染RNA病毒。凝胶电泳结果说明甲醛可使dsrna与牛血清蛋白交联。用免疫电泳初步检测，发现该抗血清除可与dsrna形成沉淀线外，还与质粒DNA及线状dsDNA发生交叉反应，说明dsrna抗体特异性不够强。

关键词：黄瓜花叶病毒 dsrna 分析方法时序变化寄主效应抗体制备

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平菇病毒dsrna的提取及脱除

北方园艺 2013年第12期 111-113页

作者：付月月杨洪一东北林业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150040

以平菇为试材,采用改进SDS法从平菇组织中提取病毒特异dsrna,并分别采用化学药剂-菌丝尖端处理和高温-菌丝尖端处理对平菇中的病毒进行了脱毒处理。结果表明:病毒dsrna特点显示其与国外报道的平菇病毒dsrna一致。其中高温-菌丝尖端脱除... 详细信息

以平菇为试材,采用改进SDS法从平菇组织中提取病毒特异dsrna,并分别采用化学药剂-菌丝尖端处理和高温-菌丝尖端处理对平菇中的病毒进行了脱毒处理。结果表明:病毒dsrna特点显示其与国外报道的平菇病毒dsrna一致。其中高温-菌丝尖端脱除处理的效果最好,可有效脱除平菇病毒;病毒唑、放线菌酮及病毒唑与盐酸吗啉胍联合菌丝尖端脱除处理,可使病毒dsrna条带减弱。该试验建立了从平菇组织中提取病毒dsrna的技术体系,可有效对平菇中的病毒进行鉴定。

关键词：平菇 dsrna 脱毒

PGEM-T/TIMP-1重组质粒的构建及其在体外转录法合成dsrna中的作用

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哈尔滨医科大学学报 2005年第2期39卷 130-132页

作者：徐华锋邹海峰刘洋林平司云峰于洪伟于晓光哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室黑龙江哈尔滨150086 哈尔滨市红十字中心血站黑龙江哈尔滨150056

目的　构建大鼠PGEM -T/TIMP 1重组质粒,获得TIMP -1基因的dsrna。方法　RT PCR获得TIMP 1cDNA ,克隆于PGEM- T载体上,PCR鉴定并进行序列分析;以PGEM- T/TIMP- 1重组质粒为模板,PCR获得带有T7启动子的TIMP 1cDNA ;体外转录获得TIMP- 1ds... 详细信息

目的　构建大鼠PGEM -T/TIMP 1重组质粒,获得TIMP -1基因的dsrna。方法　RT PCR获得TIMP 1cDNA ,克隆于PGEM- T载体上,PCR鉴定并进行序列分析;以PGEM- T/TIMP- 1重组质粒为模板,PCR获得带有T7启动子的TIMP 1cDNA ;体外转录获得TIMP- 1dsrna。结果　RT- PCR及测序分析证明成功构建PGEM- T/TIMP 1重组质粒;并获得带有T7启动子的TIMP- 1cDNA以及TIMP- 1dsrna。结论　成功构建PGEM T/TIMP -1重组质粒,并获得TIMP -1dsrna ,为RNAi实验奠定了基础。

关键词： TIMP-1 T7启动子 RNAi dsrna

禽双RNA病毒蛋白VP2抑制dsrna降解的研究

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禽双RNA病毒蛋白VP2抑制dsRNA降解的研究

作者：季刚南京农业大学

学位级别：硕士

抑制宿主先天免疫是动物病毒复制周期的重要组成部分,因为其效率不仅决定病毒是否将开始复制,而且还决定着病毒成分以及子代病毒粒子在细胞内积累的水平。RNA沉默是一种真核生物监视机制,可检测并消除双链RNA(dsrna),从而防御病毒、转... 详细信息

抑制宿主先天免疫是动物病毒复制周期的重要组成部分,因为其效率不仅决定病毒是否将开始复制,而且还决定着病毒成分以及子代病毒粒子在细胞内积累的水平。RNA沉默是一种真核生物监视机制,可检测并消除双链RNA(dsrna),从而防御病毒、转座子和转基因等侵入性核酸。传染性法氏囊病病毒属于双RNA病毒科的禽双RNA病毒属代表成员,在病毒复制过程中会释放其基因组,然而病毒基因组在细胞内却并未被降解,进而成功组装形成成熟的病毒粒子,这说明病毒复制过程中存在某种因素能够抑制基因组的降解,促进病毒复制增殖。本研究首先验证出禽双RNA病毒蛋白VP2能够抑制基因组的降解。通过大量扩增病毒提取其基因组后,将其转染至宿主细胞后经过一定的时间检测其含量,荧光定量PCR结果表明VP2能够抑制dsrna降解,随后继续构建过表达病毒蛋白VP2的细胞系加以佐证,两者结果一致。同时,体外纯化VP2蛋白后发现其能够抑制RNA干扰通路中剪切蛋白Dicer对dsrna的剪切作用。体内体外实验结果均表明在病毒复制的过程中,VP2作为一个“保护因子”能够抑制基因组的降解。那么,既然VP2能够抑制dsrna的降解,那么其是否也具有RNA结合能力呢?于是,我们探究了 VP2与dsrna的结合能力。细胞内免疫共沉淀实验结果表明在病毒感染和真核表达VP2蛋白情况下,其均能与dsrna结合且不依赖于其他的病毒和宿主蛋白。Pull down实验结果发现VP2能够直接与dsrna结合。以上证据说明,禽双RNA病毒蛋白VP2是一个RNA结合蛋白。为了验证VP2蛋白与dsrna的结合是否具有特异性,进一步鉴定了 VP2与dsrna的结合区域。免疫共沉淀实验结果显示,VP2与dsrna的结合主要是在基因组的非编码区,VP2的双链RNA结合能力是具有核酸序列依赖性的。最后,通过比较VP2蛋白对不同基因序列dsrna的降解抑制作用表明基因组的非编码区在VP2抑制双链RNA降解中至关重要,即表明VP2蛋白与dsrna的结合对其功能的发挥不可或缺。本文首次发现禽双链RNA病毒的VP2是一种dsrna结合蛋白,在病毒的复制过程中具有抑制dsrna降解从而促进病毒复制的作用。作为细胞内重要的抗病毒机制,加强RNAi途径的活性或直接靶向dsrna的“保护因子”可能是开发新型抗病毒药物的有效途径。

关键词：传染性法氏囊病病毒 VP2 dsrna 原核表达

白蜡虫蜡酯合酶基因dsrna的合成及其在Sf9中的表达

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白蜡虫蜡酯合酶基因dsRNA的合成及其在Sf9中的表达

作者：亓倩中国林业科学研究院

学位级别：硕士

白蜡虫(Ericerus pela Chavannes)二龄雄虫分泌的白蜡,是重要的工业原料,广泛地应用于化工、食品、医药、化妆品等行业。蜡酯合酶(wax synthase,WS)在白蜡生物合成途径中催化长链脂肪醇和脂酰辅酶A生成酯,是蜡酯生物合成的关键酶。本研... 详细信息

白蜡虫(Ericerus pela Chavannes)二龄雄虫分泌的白蜡,是重要的工业原料,广泛地应用于化工、食品、医药、化妆品等行业。蜡酯合酶(wax synthase,WS)在白蜡生物合成途径中催化长链脂肪醇和脂酰辅酶A生成酯,是蜡酯生物合成的关键酶。本研究根据实验室前期获得的ws全长序列,扩增其cDNA全长,用试剂盒体外转录了ws基因的dsrna,注射于白蜡虫雌成虫体内,并用荧光定量PCR检测ws基因的干涉效果,为验证ws的生理功能奠定了基础;同时利用Bac-to-Bac表达系统构建了ws基因的pFastBacHT B表达载体,转化大肠杆菌DH10Bac,经抗性和蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid/EpelWS,转染Sf9(Spodoptera frugiperda)细胞,在Sf9细胞中初步进行表达,免疫荧光观测并用蛋白免疫印迹验证WS的表达。主要研究结果如下:(1)成功用试剂盒体外转录了ws基因的dsrna,检测结果表明,dsrna已成功合成。(2)荧光定量PCR结果表明,注射ws基因的dsrna一周后的试验组白蜡虫与经gfp基因的dsrna处理的对照组相比,试验组体内ws mRNA转录量明显下调,为后续功能的研究奠定了基础。(3)利用Bac-to-Bac表达系统成功构建了WS表达载体,PCR鉴定及测序结果表明,目的片段已插入载体中。获得了重组杆粒rBacmid/EpelWS,转染Sf9细胞后收获了P3病毒,蛋白免疫印迹表明:被P3病毒感染后的Sf9细胞总蛋白中,存在目的蛋白产生的杂交反应,WS被成功表达。本研究体外转录了白蜡虫ws基因的dsrna,并在昆虫细胞中成功表达了WS,为白蜡虫ws的生理功能及WS的生化特性的进一步研究奠定了重要基础。

关键词：白蜡虫蜡酯合酶 dsrna RNA干扰表达