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细菌表达的赤拟谷盗防控基因dsrna的筛选及其非靶标效应评价

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细菌表达的赤拟谷盗防控基因dsRNA的筛选及其非靶标效应评价

作者：钟馥骏浙江大学

学位级别：硕士

近年来,昆虫RNA干扰(RNAi)技术的研究取得了空前的发展,基于RNAi的害虫防治方法受到广泛关注。目前制约dsrna在害虫防治中的应用的主要因素是高效低成本的dsrna合成方法和dsrna的安全性风险。基于此,本论文首先利用CiteSpace软件分析总... 详细信息

近年来,昆虫RNA干扰(RNAi)技术的研究取得了空前的发展,基于RNAi的害虫防治方法受到广泛关注。目前制约dsrna在害虫防治中的应用的主要因素是高效低成本的dsrna合成方法和dsrna的安全性风险。基于此,本论文首先利用CiteSpace软件分析总结了全球昆虫RNAi的研究热点,确定了以赤拟谷盗作为研究对象,建立了大肠杆菌表达dsrna饲喂赤拟谷盗的方法,筛选到对赤拟谷盗具有防控效果的dsrna片段,并评价了其非靶标效应,以期为为赤拟谷盗RNAi的非靶标效应评价提供一定的数据基础,为dsrna在害虫防治中的安全应用提供理论依据。本论文主要结果如下:1.细菌表达的赤拟谷盗防控基因dsrna的筛选对赤拟谷盗四个候选基因dsrna构建了重组表达载体,并成功地使靶标基因的dsrna在大肠杆菌HT115(DE3)中表达。以大肠杆菌RNA粗提液混合饲料饲喂赤拟谷盗幼虫,发现dsTcCht10和dsTc VATP-C对赤拟谷盗幼虫的存活率和基因转录水平均有显著影响。对dsTcCht10进行了浓度梯度测试,其致死中浓度LC为105.5 ng/mg,该dsrna片段在赤拟谷盗防控中具有一定的应用价值。***10饲喂后赤拟谷盗转录组的分析通过转录组测序的方法,分析了赤拟谷盗dsTcCht10饲喂后其基因表达的情况。结果表明,有效沉默TcCht10后,除了TcCht10表达量明显下降,与表皮相关的其余52个基因表达量也显著变化。此外,dsTcCht10也可能会对赤拟谷盗其他非靶标基因的转录水平造成影响,今后可以结合降解组等测序方式并基于全基因组进行深入分析和验证,以更好了解dsrna或者siRNA的脱靶效应。***10对两种非靶标生物影响的评价将不同浓度的dsTcCht10饲喂两种非靶标生物丽蝇蛹集金小蜂和麦蛾柔茧蜂,以非靶标生物同源基因的dsrna作为阴性对照。结果表明,dsTcCht10饲喂对这两种非靶标生物的存活率都无显著影响,但是1000 ng/μL的dsTcCht10对丽蝇蛹集金小蜂Cht10基因转录水平有显著影响,这可能与dsTcCht10片段与丽蝇蛹集金小蜂同源基因的序列相似性有关,赤拟谷盗dsTcCht10与丽蝇蛹集金小蜂同源基因的相似性为66.75%,且存在连续19-23nt核苷酸的匹配个数。

关键词： RNAi 赤拟谷盗 dsrna 非靶标效应安全性评价

果蝇Cullin1基因dsrna设计及RNAi效率检测

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黑龙江畜牧兽医 2017年第6期 235-238页

作者：白广栋王红岩王梦竹杨雪李明月何倩毓黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

为了便于研究果蝇中Cullin1基因的功能,试验采用PCR和体外转录的方法针对Cullin1基因5'UTR和CDS区域分别合成对应的dsrna,并利用RNA干扰(RNAi)以及Real-time PCR等方法,检测了5'UTR和CDS区域的RNAi效率。结果表明:针对Cullin1基因5'UTR... 详细信息

为了便于研究果蝇中Cullin1基因的功能,试验采用PCR和体外转录的方法针对Cullin1基因5'UTR和CDS区域分别合成对应的dsrna,并利用RNA干扰(RNAi)以及Real-time PCR等方法,检测了5'UTR和CDS区域的RNAi效率。结果表明:针对Cullin1基因5'UTR和CDS区域设计的dsrna均有效果,且二者间差异不显著(P>0.05)。

关键词：果蝇 Cullinl基因 dsrna RNA干扰(RNAi) Real—time PCR

原核表达IBDV VP5基因同源dsrna方法的建立

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畜牧与兽医 2020年第8期52卷 85-88页

作者：季刚俞天奇张宜娜周继勇胡伯里南京农业大学动物医学院江苏南京210095 浙江大学动物医学系/农业部动物病毒学重点实验室浙江杭州310058

为了深入研究传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus IBDV)VP5基因的功能,本研究以RNA干扰载体L4440为骨架,将IBDV VP5基因连入载体中,并将重组载体转入大肠杆菌HT115(DE3),在异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)的诱导下,表达出VP5基因同源dsrna。与传统的方法相比,利用基因工程菌合成同源基因dsrna的方法高效迅速,为后续研究VP5的功能奠定基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒 VP5基因原核表达 dsrna

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我国栗疫病菌体中dsrna的初步研究

森林病虫通讯 1990年第1期9卷 23-25页

作者：陈开英梁平彦中国科学院微生物研究所

作者在西南、华东、华北的十多个地区共采集140株栗疫菌 Endothiaparasitiica,并对昆明、南京、北京等地的38株栗疫菌进行了dsrna的提取,发现13株含有1—2组分的dsrna。根据黑曲霉病毒Aspergillus niger virus dsrna分子量,推算出栗疫... 详细信息

作者在西南、华东、华北的十多个地区共采集140株栗疫菌 Endothiaparasitiica,并对昆明、南京、北京等地的38株栗疫菌进行了dsrna的提取,发现13株含有1—2组分的dsrna。根据黑曲霉病毒Aspergillus niger virus dsrna分子量,推算出栗疫菌核酸分子量为4.0—5.1×10~6道尔顿。对栗疫菌核酸性质进行鉴定,在高离子强度(2×SSC)下核酸抗RNase(20微克/毫升),但经106℃10分钟处理,变性后核酸对RNase敏感,结果表明栗疫菌核酸为dsrna。

关键词：栗疫病菌体 dsrna

一种简单快速的食用菌病毒dsrna提取方法

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实验技术与管理 2010年第12期27卷 51-53,57页

作者：郭灵芳张长青鲁红学周燚徐章逸章松柏长江大学工程技术学院湖北荆州434020 长江大学农学院湖北荆州434000 华中农业大学应用真菌研究所湖北武汉430070

食用菌病毒病一直是食用菌生产的重要问题,明显影响产量和质量。已发现的食用菌病毒很多为dsrna病毒,因此dsrna病毒的研究对于食用菌生产非常重要。发展一种简单快速的食用菌病毒dsrna的提取方法,该法优化了传统提取方法的步骤和对样品... 详细信息

食用菌病毒病一直是食用菌生产的重要问题,明显影响产量和质量。已发现的食用菌病毒很多为dsrna病毒,因此dsrna病毒的研究对于食用菌生产非常重要。发展一种简单快速的食用菌病毒dsrna的提取方法,该法优化了传统提取方法的步骤和对样品数量的要求,可以从0.5～1.0 g的食用菌组织中快速提取dsrna,提取效率较传统方法高,提取产物可以直接应用于进行dsrna的检测、分类以及相关基因的克隆。

关键词： dsrna RNA病毒香菇平菇

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中国东部栗疫病菌dsrna群体的多样性

生物多样性 2004年第3期12卷 370-376页

作者：徐陈贤刘福秀周晓云王克荣南京农业大学植物病理学系南京210095

采用生物学测定和凝胶电泳的方法,对中国东部栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的dsrna病毒进行了研究。根据电泳图谱,中国东部栗疫病菌的dsrna病毒可以分为5种类型,其中类型Ⅰ只具有一个12.7 kb的条带,占大多数;类型Ⅱ有两条带,一条 ... 详细信息

采用生物学测定和凝胶电泳的方法,对中国东部栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的dsrna病毒进行了研究。根据电泳图谱,中国东部栗疫病菌的dsrna病毒可以分为5种类型,其中类型Ⅰ只具有一个12.7 kb的条带,占大多数;类型Ⅱ有两条带,一条 12.7 kb,另一条 5.2 kb左右,只有一个菌株354;类型Ⅲ则除了12.7 kb的条带外,还有3条小于2 kb的小片段,有238和250两个菌株;dsrna属于类型Ⅳ的为269和344两个菌株,它只含有两个1.8-3.1 kb的小片段;dsrna类型V只有一个菌株 280,除了一条 12.7 kb分子外,还有 4条 2.6-3.3 kb的小片段。含有dsrna的菌株培养性状多样,根据菌落特征,栗疫病菌可以划分为5种培养类型,但菌株的培养类型与dsrna的类型间没有对应的关系。毒力测定表明含有dsrna病毒的供试菌株大多属于低毒力类型。

关键词：电泳图谱 dsrna 培养性状毒力

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杭州地区玉米病毒病dsrna序列分析

科技通报 2011年第1期27卷 45-49页

作者：赵洪斌唐香山陈集双浙江理工大学生物工程研究所杭州310018

从杭州地区采集花叶症状的玉米,抽提双链RNA(double-stranded RNA,dsrna),用单引物扩增方法(Single primer amplification technique,SPAT)对dsrna进行RT-PCR扩增,获得了三条dsrna片段的cDNA克隆并测定全序列。核苷酸水平上,三条片段(长度分别为1801bp、2193bp和3164bp)分别与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)的第十(AF227205)、第七(AJ297428)和第五(AJ409147)号片段序列存在高达98%的同源性,与玉米粗缩病毒(Maize rough dwarffijivirus,MRDV)相应片段序列同源性最高为88%。在氨基酸水平上,推测的氨基酸序列也与RBSDV相似性较高,而与MRDV的相似性较低。序列同源性分析结果表明:三条片段来源于RBSDV。因此,该地区发生的玉米病毒病病原是水稻黑条矮缩病毒而不是玉米粗缩病毒。

关键词： dsrna 克隆序列分析水稻黑条矮缩病毒

IBDV基因组dsrna与宿主细胞RNA结合蛋白Staufen1互作调控IBDV复制及其机制

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IBDV基因组dsRNA与宿主细胞RNA结合蛋白Staufen1互作调控IBDV复制...

作者：于朝丽浙江农林大学

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IBDV属于双RNA病毒科,禽双RNA病毒属,是传染性法氏囊病(IBD)的病原体。IBD是一种急性、高度传染性疾病,可以导致青年鸡法氏囊出现炎症、萎缩,还会引起严重的免疫抑制。宿主细胞蛋白Staufen1(Stau1)属于双链RNA结合蛋白家族的一员,参与m... 详细信息

IBDV属于双RNA病毒科,禽双RNA病毒属,是传染性法氏囊病(IBD)的病原体。IBD是一种急性、高度传染性疾病,可以导致青年鸡法氏囊出现炎症、萎缩,还会引起严重的免疫抑制。宿主细胞蛋白Staufen1(Stau1)属于双链RNA结合蛋白家族的一员,参与mRNA的转运、翻译以及降解。除此之外,还参与某些RNA病毒的生命周期。本文研究了Stau1蛋白与非己的IBDV基因组dsrna相互作用调控IBDV的复制,并探究了其分子机制。为了研究鸡源Stau1蛋白与IBDV基因组dsrna之间的关系,本研究首先克隆了鸡Stau1基因,构建真核表达载体以及相关的原核表达载体。本文采用IBDV dsrna pull-down实验、凝胶迁移实验以及质谱鉴定来研究Stau1蛋白与IBDV基因组dsrna是否相互作用以及Stau1与dsrna结合的具体结构区域。利用间接免疫荧光反应探究了Stau1蛋白与IBDV基因组dsrna在细胞中的共定位情况。我们通过建立IBDV细胞感染模型,利用RNA干扰技术、蚀斑实验以及RT-PCR实验研究了Stau1蛋白对IBDV复制的影响。另外利用荧光素酶报告基因系统,研究了Stau1对IBDV基因组dsrna诱导产生IFN-β的影响。采用IBDV基因组dsrna pull-down实验,比较了VP3、MDA5、Stau1与IBDV基因组dsrna的亲和力。结果:(1)无论在体外还是在体内,鸡源Stau1蛋白都可以直接与IBDV基因组dsrna相互结合,并在细胞中发生共定位,且N-端1-468个氨基酸负责Stau1结合dsrna的功能;(2)下调Stau1蛋白的表达,可以抑制后期IBDV病毒复制,而Stau1上调表达则可以促进IBDV病毒复制;(3)下调Stau1表达会选择性的促进IBDV dsrna诱导产生的IFN-β的表达,而对IFN-α没有影响;(4)Stau1可以通过结合IBDV dsrna来抑制感染IBDV诱导的IFN-β的产生;(5)Stau1与MDA5竞争性结合IBDV dsrna,来抑制IBDV诱导产生的IFN-β,并且病毒蛋白VP3与鸡Stau1协同发挥抑制IFN-β产生的作用。结论:本研究首次发现鸡Stau1蛋白可以与IBDV dsrna相互作用,并可以通过与MDA5竞争结合dsrna,来抑制IBDV诱导产生的IFN-β,并且病毒蛋白VP3与鸡Stau1协同发挥抑制IFN-β产生的作用,从而达到促进IBDV复制的目的。本次研究促进我们对IBDV致病和免疫机制的认知,为防控IBD提供新的思路。

关键词：传染性法氏囊病病毒 Stau1 dsrna 干扰素-β MDA5 VP3

橘小实蝇rpl19 dsrna对橘园非靶标昆虫干扰效应研究

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橘小实蝇rpl19 dsRNA对橘园非靶标昆虫干扰效应研究

作者：陈爱娥华中农业大学

学位级别：硕士

RNAi是由双链RNA所引起的特异性基因沉默。喂食dsrna达到RNAi效应在很多昆虫上取得成功,在害虫防治上表现出广泛的应用潜力,但是目前缺乏对于RNAi的安全性评价,因此评价RNAi包括对天敌和益虫等非靶标昆虫的干扰效应在内的环境安全性具... 详细信息

RNAi是由双链RNA所引起的特异性基因沉默。喂食dsrna达到RNAi效应在很多昆虫上取得成功,在害虫防治上表现出广泛的应用潜力,但是目前缺乏对于RNAi的安全性评价,因此评价RNAi包括对天敌和益虫等非靶标昆虫的干扰效应在内的环境安全性具有非常重要的意义。本研究选取橘小实蝇Bactrocera dorsalis作为靶标昆虫,rpl19基因作为靶标基因,选择近缘种柑橘大实蝇Bactrocera minax,天敌长尾潜蝇茧蜂Diachasmimorpha longicaudata,益虫意大利蜜蜂pis mellifera作为非靶标生物,同时喂食小实蝇rpl19基因不同片段的dsrna,利用Real-time PCR等分子生物学技术检测各个昆虫rpl19的表达情况,研究昆虫dsrna对非靶标昆虫的干扰效应,为RNAi用于害虫防治提供安全性评价的参考依据。主要研究结果如下：1.成功克隆了橘小实蝇、柑橘大实蝇、长尾潜蝇茧蜂和意大利蜜蜂rpl19基因cDNA全长。基因同源性分析结果显示橘小实蝇rpH9基因ORF区域核酸序列与柑橘大实蝇同源性高达93%,与长尾潜蝇茧蜂同源性达72%,与意大利蜜蜂有68%的同源性。用CLUSTAL X2.0将橘小实蝇rpl19氨基酸序列与柑橘大实蝇、长尾潜蝇茧蜂、意大利蜜蜂rpl19基因氨基酸序列同源性比对,结果显示橘小实蝇rpl19基因氨基酸序列与柑橘大实蝇、长尾潜蝇茧蜂、意大利蜜蜂同源性高达90%以上。2. Real-time PCR结果表明,喂食靶标昆虫自身rpl19基因dsrna可以在橘小实蝇、柑橘大实蝇、长尾潜蝇茧蜂和意大利蜜蜂中均产生RNAi效应,喂食Bdrpl19dsrna后橘小实蝇rpl19基因表达分别下调50%,喂食Bmrpl19dsrna后,柑橘大实蝇rpl19基因表达下调达90%以上,喂食Dlrpl19dsrna后长尾潜蝇茧蜂rpl19基因表达下调40%,而喂食Amrpl19dsrna后意大利蜜蜂rpl19基因表达下调了50%。3. dsrna对非靶标昆虫的干扰效应研究结果显示喂食橘小实蝇Bdrpl19CDS dsrna后,柑橘大实蝇rpl19基因表达水平下调了50-70%,长尾潜蝇茧蜂rpl19基因表达水平下调了40%,而意大利蜜蜂rpl19基因表达量没有变化,但喂食Bdrpl193'UTR dsrna对三种非靶标昆虫都没有干扰效应。而dsrna片段核酸序列的比对结果显示柑橘大实蝇和长尾潜蝇茧蜂rpl19基因序列与橘小实蝇rpl19序列存在19-23bp完全同源的片段,而意大利蜜蜂rpl19与橘小实蝇rpl19基因序列间没有大于19bp完全相同的片段,这个结果表明RNAi的种间效应与可能基因完全同源的片段的长短有关,当完全重合区域超过19bp就可能会产生种间干扰效应,这个结果反映了RNAi用于害虫防治可能存在的风险,相比于编码区,非编码区的安全性更高,本研究橘小实蝇非编码区dsrna对三种非靶标昆虫没有干扰效应。

关键词： RNA干扰 rpl19 喂食 dsrna 非靶标昆虫