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农业生物技术学报 2014年第11期22卷 1380-1387页

作者：吴松青刘昭霞苏伟超王官栋陈慧成吴志卯关雄张灵玲福建农林大学林学院福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室

mapk-like是一种信号转导相关促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因,与线虫(Caenorhabditis elegans)中参与抵御Cry毒素的p38 MAPK含有类似的模序,其是否参与埃及伊蚊(Aedes aegypti)抵御苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)过程有待... 详细信息

mapk-like是一种信号转导相关促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因,与线虫(Caenorhabditis elegans)中参与抵御Cry毒素的p38 MAPK含有类似的模序,其是否参与埃及伊蚊(Aedes aegypti)抵御苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)过程有待验证。为简便并大量获得RNAi验证所需的ds RNA,本研究利用RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌(Escherichia coli)HT115高效和廉价的优点,根据已测序的促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因mapk-like基因序列,设计特异性引物,PCR扩增大小为361 bp的目的片段mapk-like(Gen Bank登录号:AAEL003728-RA),将其连接到克隆载体p MD18-T上,利用限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ将其插入到原核表达载体p Litmus28i的2个T7启动子之间,成功构建可诱导形成目的双链RNA(ds RNA)的原核表达重组载体p Litmus28i-mapk-like,并转化大肠杆菌HT115,经IPTG诱导,1 m L菌液的ds RNA产量可达1.18μg,电泳检测条带清晰,质量良好。此外,利用壳聚糖包裹ds RNA形成纳米微粒,上清经电泳检测表明,壳聚糖的聚沉效率良好,纳米微球可有效防止ds RNA从饲料琼脂块中游离出来,提高ds RNA的稳定性。埃及伊蚊幼虫摄取mapk-like基因的ds RNA后,相对转录表达水平为65.55%,表达量明显下调,饲喂效果良好。研究结果将有利于进一步筛选获得相关抵御基因,为建立一个基于RNA沉默防治蚊媒病的研究体系提供了基础资料。

关键词： pLitmus28i RNaseⅢ缺失菌株 dsrna

香蕉枯萎病菌myosin-1基因的功能分析及外施dsrna介导的抗性评估

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植物病理学报 2022年第3期52卷 321-333页

作者：曾凡云刘远征王艳玮漆艳香张欣谢艺贤彭军中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室海口571101 中国热带农业科学院海口实验站海口571101

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum ***,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。SMART在线软件分析myosin-1基因具有肌球蛋白马达蛋白(myosin motor domain,MM... 详细信息

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum ***,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。SMART在线软件分析myosin-1基因具有肌球蛋白马达蛋白(myosin motor domain,MMD),肌动蛋白尾结构TH1(myosin tail)和Src家族同源结构域SH3(src homology domain 3),与禾谷镰刀菌中氰烯菌酯靶标基因myosin-5具高度的蛋白同源性,相似性高达83%。利用Split-marker基因重组技术获得Foc4的myosin-1基因敲除突变体,Δmyosin-1突变株丧失了对氰烯菌酯的敏感性,菌丝生长缓慢,产孢量减少且孢子畸形,对香蕉致病力严重下降,证实myosin-1是氰烯菌酯在Foc4中的作用靶标基因。外施靶向myosin-1体外转录的dsrna,能抑制菌丝的生长,降低菌丝活性;菌丝膨胀扭曲分枝增多,出现典型的球状结构,与氰烯菌酯处理后的表型一致。在盆栽活体人工接种实验中,体外施用dsrna可以明显抑制枯萎病外部症状的发展,推迟发病时间,赋予寄主抗性,结果说明体外施用dsrna可以作为新型杀菌剂防治香蕉枯萎病。综上,myosin-1基因作为氰烯菌酯在Foc4中的靶标基因具有高度的序列保守,在调控菌丝生长发育,产孢以及致病力等方面发挥重要作用,而外施dsrna具有防治香蕉枯萎菌的巨大潜力。

关键词：香蕉枯萎病菌 myosin-1基因基因敲除氰烯菌酯 dsrna

纳米材料结合的dsrna对烟草花叶病毒侵染的抑制

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中国生物防治学报 2018年第5期34卷 715-721页

作者：王嘉琪刘勇张松柏朱春晖孙书娥张德咏湖南农业大学植物保护学院长沙410128 湖南省农业科学院植物保护研究所长沙410125

基于病毒基因的外源双链RNA(dsrna)可以在植物体内诱导RNAi,但dsrna易降解、作用时间有限,限制了这项技术的应用。本研究以TMV衣壳蛋白(CP)基因为目的片段,体外合成dsrna,分别与2种纳米材料壳聚糖(chitosan,CS)和层状双氢氧化物(layered... 详细信息

基于病毒基因的外源双链RNA(dsrna)可以在植物体内诱导RNAi,但dsrna易降解、作用时间有限,限制了这项技术的应用。本研究以TMV衣壳蛋白(CP)基因为目的片段,体外合成dsrna,分别与2种纳米材料壳聚糖(chitosan,CS)和层状双氢氧化物(layered double hydroxide,LDH)融合,合成CS-dsrna和LDH-dsrna 2种制剂。测试了2种制剂的稳定性及其对TMV的预防和治疗效果。结果表明,在4、25和37℃,30 d的稳定性测定试验中,dsrna的量较初始值分别减少了80.01%、58.89%和59.76%,降解比较明显,dsrna在4℃的降解速率略高于在25和37℃的降解速率;CS-dsrna制剂中dsrna的量较初始值分别增加了65.98%、103.82%和157%,LDH-dsrna制剂中dsrna的量较初始值分别增加了54.30%、58.4%和66.42%,dsrna被CS与LDH 2种纳米材料包裹后降解率明显下降,而且随着温度的升高dsrna的量有所增加,说明纳米材料融合的dsrna有缓释效应。半叶法试验表明,dsrna、CS-dsrna和LDH-dsrna对TMV的预防效果分别为60.12%、57.79%和55.18%,治疗效果分别为65.01%、58.40%和59.08%。本研究表明,纳米材料CS与LDH对dsrna起到了良好的保护、缓释及提高稳定性的作用,在利用RNA干扰防治植物病毒病害中具有良好的应用前景。

关键词：壳聚糖层状双氢氧化物 dsrna 烟草花叶病毒防治

栗疫菌低毒力dsrna与真菌病毒dsrna的序列同源性

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病毒学报 1995年第1期11卷 72-77页

作者：梁平彦全勇周淑敏中国科学院微生物所

以我国栗疫菌［Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ（＝Ｅｎｄｏｔｈｉａ）ｐａｒａｓｉｔｉｃａ］低毒力菌株ＥｐＣ１４０（广西）的［γ─￣３２Ｐ］ＡＴＰ末端标记ｄｓＲＮＡ作探针，与５种真菌病毒ｄｓＲＮＡ进行分子杂交。探针可与紫孢侧... 详细信息

以我国栗疫菌［Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ（＝Ｅｎｄｏｔｈｉａ）ｐａｒａｓｉｔｉｃａ］低毒力菌株ＥｐＣ１４０（广西）的［γ─￣３２Ｐ］ＡＴＰ末端标记ｄｓＲＮＡ作探针，与５种真菌病毒ｄｓＲＮＡ进行分子杂交。探针可与紫孢侧耳病毒（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｓｅｐｉｄｕｓｖｉｕｓ）和小麦全蚀菌病毒（Ｇａｅｕｍａｎ─ｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ·ｖｉｒｕｓ）的ｄｓＲＮＡ杂交，但不能与黑曲霉病毒（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒｖｉｒｕｓ）、产黄青霉病毒（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｖｉｒｕｓ）和稻瘟菌病毒（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａｏｒｙｚａｅｖｉｒｕｓ）的ｄｓＲＮＡ杂交。当以低毒力菌株ＥｐＣ３２（云南）作探针时，结果相同。

关键词：同源序列 dsrna 栗疫菌真菌噬菌体

Different Delivery Ways of dsrna Expressed by Bacteria have Different Abilities to Protect Tobacco from Co-Infection with PVY and TMV

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Different Delivery Ways of dsRNA Expressed by Bacteria have ...

中国植物病理学会2012年学术年会

作者： SUN Zhao-Nan XIE Xue-Ying SUN Run-Ze ZHU Chang-Xiang~* WEN Fu-Jiang (State Key Laboratory of Crop Biology,Shandong Agricultural University,Tai''an,Shandong 271018,China)

＜正＞RNA interference（RNAi） is a plant self-resistant reaction and regulatory mechanism that has achieved great progress in recent *** expression of dsrna can induce RNAi,conferring the plant resistance to *** were usually infected by various viruses in their grown *** this study,two hotspot sequences of Tobacco mosaic virus（TMV） and Potato virus Y（PVY） genomes were selected and six hpRNA vectors of single-viral or two-viral chimeric genes were *** target dsrna expressed by inducting, and then the resistant effect of the mixture dsrna A（derived from two kinds of single-viral genes） was compared to the effect of corresponding dsrna B（derived from one kind of two-viral chimeric gene ） in different delivery *** data showed that dsrna expressed by bacteria with two delivery ways could protect tobacco from co-infection with PVY and TMV,the resistant efficiency of the mixture dsrna A was stronger than the effect of corresponding dsrna B,the best resistant effect was 42.43%.Northern blot analysis of siRNA showed that the resistance was indeed an RNA-mediated virus resistance.

关键词： bacterially expression dsrna different delivery ways PVY TMV

来源： cnki会议评论

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草莓植株中病毒dsrna的分离和鉴定

中国农业科学 2006年第1期39卷 145-152页

作者：李贺代红艳张志宏高秀岩杜国栋张馨宇沈阳农业大学园艺学院沈阳农业大学园艺学院沈阳110161

目的病毒核酸分离是病毒基因组解析的基础,本研究旨在建立草莓病毒的dsrna分离方法,获得草莓主要病毒的部分基因组序列。方法采用改进的dsrna分离方法,对草莓病毒指示植物和栽培品种中的病毒dsrna进行分离,通过琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR... 详细信息

目的病毒核酸分离是病毒基因组解析的基础,本研究旨在建立草莓病毒的dsrna分离方法,获得草莓主要病毒的部分基因组序列。方法采用改进的dsrna分离方法,对草莓病毒指示植物和栽培品种中的病毒dsrna进行分离,通过琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR来鉴定。结果不同草莓品种中病毒dsrna的含量不同,试管苗叶片中dsrna含量高于露地苗幼叶,而露地苗幼叶中dsrna含量明显高于完全成熟叶。dsrna对DNaseⅠ具有很强的耐性;当酶解缓冲液中含0.5mol·L-1NaCl时,dsrna对RNaseA具有较强的耐性。利用DNA凝胶回收试剂盒,能够有效回收凝胶中的dsrna片段。应用RT-PCR技术,从凝胶回收的dsrna及DNaseⅠ/RNaseA两酶酶解处理后的dsrna中分别扩增出草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒的特异片段。结论建立了从草莓植株中分离和鉴定病毒dsrna的完整技术体系,为草莓病毒中国分离物的基因组解析奠定了重要基础。

关键词：草莓 dsrna 病毒分离 RT-PCR

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栗疫菌低毒力菌株dsrna的分离及转移

微生物学报 1992年第4期32卷 253-261页

作者：梁平彦陈开英周淑敏全勇刘宏迪中国科学院微生物研究所

自云南、广西、江苏、浙江、河北、京郊六个省市的板栗树(Castanea mollissima)溃疡斑上分离了栗疫菌(Endothia parasitica)160株,进行了 dsrna 的提取及其毒力测定,获得两株含 dsrna 的低毒力菌株(H),其毒力与带有起源于欧洲的 dsrna ... 详细信息

自云南、广西、江苏、浙江、河北、京郊六个省市的板栗树(Castanea mollissima)溃疡斑上分离了栗疫菌(Endothia parasitica)160株,进行了 dsrna 的提取及其毒力测定,获得两株含 dsrna 的低毒力菌株(H),其毒力与带有起源于欧洲的 dsrna 的低毒力菌株比较相近.比较国内菌株与欧洲低毒力菌株的 dsrna 电泳谱带,示有共同分子量为5×10~6或6.2×10~6的电泳带。与正常毒力菌株(V)混合接种能显著降低致病力。这是欧美大陆发现低毒力菌株后,亚洲地区的首次报告。以5株具有欧洲 dsrna 的低毒力菌株作为供体,与云南、江苏、浙江的10株毒力菌株配对,16%(8/50)的毒力菌株发生形态变化,dsrna 转入后毒力明显降低。结果表明,国内毒力菌株可以接受欧洲低毒力因子——dsrna 并转变为低毒力菌株。

关键词：栗疫菌低毒力 dsrna 基因转变

原核表达的PRSV HC-Pro基因同源dsrna诱导番木瓜抗性的研究

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园艺学报 2013年第7期40卷 1269-1277页

作者：杨国峰沈文涛言普黎小瑛周鹏海南大学农学院海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所分析测试中心海口571101 海南师范大学生命科学学院海口571158

利用番木瓜环斑病毒(PRSV)HC-Pro基因3′端824bp区段,通过OZ-LIC法构建了含有PDK内含子的发夹RNA编码结构,并选用pSP73和M-Jm109LacY分别作为宿主载体和宿主菌,构建了高效的同源dsrna原核表达工程菌M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-H824,经IPTG诱导表达的dsrna不被DNaseI和RNaseA降解,稳定性较好。采用喷洒dsrna粗制品的方式对番木瓜植株进行保护性处理和治疗性处理,症状观察及ELISA、Real-time RT-PCR分析结果表明,保护性处理能有效诱发对番木瓜环斑病毒的抗性(发病率低,发病时间晚);治疗性处理(植株已接种PRSV 25d)能在处理初期引起番木瓜环斑病毒积累量发生短暂降低。

关键词：番木瓜环斑病毒 HC-Pro dsrna 原核表达 RNA沉默

镰形扇头蜱Subolesin基因的长链dsrna电转化和干扰效果研究

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中国预防兽医学报 2015年第4期37卷 274-278页

作者：路鹏云龚海燕曹杰周勇志张厚双李国清周金林华南农业大学兽医学院广东广州510642 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为建立针对不同发育阶段蜱的长链dsrna电转化导入方法,本研究以我国优势流行的硬蜱镰形扇头蜱为对象,以蜱的保守基因Subolesin作为目标基因,将荧光标记的Subolesin-dsrna对卵、幼蜱以及若蜱3个发育阶段进行电转化监测dsrna的转化效果,... 详细信息

为建立针对不同发育阶段蜱的长链dsrna电转化导入方法,本研究以我国优势流行的硬蜱镰形扇头蜱为对象,以蜱的保守基因Subolesin作为目标基因,将荧光标记的Subolesin-dsrna对卵、幼蜱以及若蜱3个发育阶段进行电转化监测dsrna的转化效果,对电转化后不同时间以及不同dsrna电转化浓度进行优化,并接种小鼠观察电转化Subolesin-dsrna对幼蜱及若蜱吸血的影响。结果显示,电转化Cy3荧光染料标记dsrna后,卵、幼蜱及若蜱体内均有点状分布的荧光。若蜱于电转化后放置8h,Subolesin mRNA沉默效果较佳。此外,卵、幼蜱及若蜱分别在dsrna浓度为10μg/m L、5μg/m L^25μg/mL及10μg/m L^25μg/m L沉默效果较好。Subolesin-dsrna干扰后蜱的存活率和吸血能力均显著降低。本研究建立的针对各个发育阶段蜱的高效长链dsrna电转化方法为研究基因功能和沉默特定的基因提供了新的ds RNA导入方法。

关键词：电转化 RNA干扰 dsrna 荧光标记