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铁皮石斛DoGGPPS、DoFPPS克隆及功能验证

铁皮石斛DoGGPPS、DoFPPS克隆及功能验证

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作者：张传明安徽农业大学

学位级别：硕士

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimuraet Migo)作为名贵石斛属药用植物,其主要的药用成分为多糖和生物碱,具有生津益胃、滋阴清热等功效。目前研究发现铁皮石斛中生成的生物碱可能来源于萜类代谢途径(MVA和MEP途径),而法尼基焦磷酸合... 详细信息

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimuraet Migo)作为名贵石斛属药用植物,其主要的药用成分为多糖和生物碱,具有生津益胃、滋阴清热等功效。目前研究发现铁皮石斛中生成的生物碱可能来源于萜类代谢途径(MVA和MEP途径),而法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)均是萜类合成途径中关键的异戊烯基焦磷酸合酶。本文通过同源克隆得到Do FPPS和Do GGPPS全长的c DNA序列并进行相关的表达分析,旨在研究铁皮石斛Do FPPS和Do GGPPS在萜类合成途径中所起到的作用,为进一步明确铁皮石斛萜类合成途径奠定基础。主要结果如下:1.通过同源克隆的方法从铁皮石斛中克隆得到Do FPPS和Do GGPPS,Gen Bank登录号为Do FPPS(JX679465)和Do GGPPS(KY012247)。组织特异性分析表明,Do FPPS和Do GGPPS在铁皮石斛各个组织部位中均有表达。2.不同激素和诱导子处理铁皮石斛原球茎,通过q RT-PCR检测处理前后原球茎中Do FPPS、Do GGPPS表达量的变化。结果显示,茉莉酸甲酯对铁皮石斛Do FPPS、Do GGPPS均有诱导作用,诱导表达趋势均呈现先上升后下降的趋势;SA仅对Do GGPPS有着诱导作用,诱导表达趋势呈现先上升后下降的趋势;ABA对铁皮石斛Do FPPS、Do GGPPS均有着诱导作用,诱导趋势均呈现为先上升后下降的趋势;非生物诱导子Ag对铁皮石斛Do FPPS、Do GGPPS均有着诱导作用,诱导趋势都呈现出先上升后下降的趋势。3.成功构建了真核表达载体p CAMBIA1304-Do FPPS和p CAMBIA1304-Do GGPPS。通过烟草中的瞬时表达以及拟南芥中的稳定过表达分析,亚细胞定位结果显示Do FPPS、Do GGPPS均定位于叶绿体上,通过农杆菌介导将Do FPPS、Do GGPPS转化野生型拟南芥,筛选获得稳定的转基因拟南芥植株。q RT-PCR分析表明,在过表达转基因株系中,Do FPPS和Do GGPPS能够影响下游萜类合成酶基因的表达。4.成功构建了干涉表达载体p CAMBIA1301a-Do FPPS和p CAMBIA1301a-Do GGPPS。通过瞬时表达分析检测转化烟草中Do FPPS和Do GGPPS的表达量变化。结果表明分别转入Do FPPS和Do GGPPS RNAi片段能够降低处理组中烟草叶片中Do FPPS和Do GGPPS的表达量

关键词：铁皮石斛 DoFPPS DoGGPPS 基因克隆表达分析遗传转化

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