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渐进性慢性缺氧诱导黏膜损伤与血管重建的内痔出血机制研究

渐进性慢性缺氧诱导黏膜损伤与血管重建的内痔出血机制研究

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作者：经芳艳南方医科大学

学位级别：硕士

痔是世界范围内成年男女性的常见病和多发病,国人痔的发病率占46.3%[1]。痔的脱出和便血是主要症状,严重者可发生贫血、嵌顿坏死,影响患者的生活质量和身心健康。人类对痔的认识最早可以追溯到公元前476年,在《山海经》[2]里就已经有痔... 详细信息

痔是世界范围内成年男女性的常见病和多发病,国人痔的发病率占46.3%[1]。痔的脱出和便血是主要症状,严重者可发生贫血、嵌顿坏死,影响患者的生活质量和身心健康。人类对痔的认识最早可以追溯到公元前476年,在《山海经》[2]里就已经有痔的记载,但对痔的形成机理在近百年才有初步认识,发病机制研究衍生出“静脉曲张学说”、“血管增生学说”和“肛垫下移学说”三个主要学说,实质由血管病变是痔形成的重要因素,但其病理机制尚未明确,尚不能解释内痔出血及术后较高的复发率[3-4]。内痔发生的诱因较多,久坐、熬夜、便秘、妊娠、食用辛辣刺激食物等均与内痔有关[5-6],且随年龄的增长,诱发因素与慢性损伤的累积,内痔发病率明显增高,严重程度逐渐增强。由于发病机制不清,内痔脱出、出血进行性加重,目前尚无根治的治疗手段,不管是药物保守治疗还是手术治疗,均不能根除内痔,复发率高。因此,明确内痔的发病机制,能够有效提高内痔的治愈率,减少内痔并发的贫血,提高患者的工作与生活质量。研究发现,熬夜、久坐等随年龄增长累积的慢性损伤因素导致肛管微循环障碍,组织缺血缺氧,缺氧诱导因子（HIF-1α）通过与缺氧反应元件结合介导血管内皮生长因子（VEGF）的转录激活,产生多种活性物质如基质金属酶（MMPs）、转化生长因子-β（TGF-β）等,刺激血管内皮细胞增殖和管壁平滑肌增生并管壁纤维化,黏膜层新生血管增多、血管壁局灶性增厚,导致内痔黏膜层损伤和毛细血管重建,引起内痔的发生发展和反复出血。因此,这一新的发病机制的发现,有助于阐明渐进行性慢性缺氧诱导内痔黏膜损伤和毛细血管重建导致内痔的进展。我们研究发现,痔粘膜慢性渐进性缺氧可产生多种活性物质（HIF、VEGF、 MMPS、TGF-β等）的表达,新生血管生成增加,血管壁平滑肌增生和血管肌层纤维化,痔粘膜层内血管迂曲扩张,出现dieulafoy样畸形血管,内痔脱出、出血进行性加重。HIF-1α在缺氧环境中通过与下游多种缺氧靶基因结合并调节其转录在内痔的发生发展中发挥重要作用。本研究进一步应用组织病理定性与定量观察,结合免疫组化、电镜观察粘膜损伤与血管异常的超微结构改变,明确内痔动态演变过程中新生血管的重建及其出血机制。本课题将从新的视角阐明内痔出血的发病机制,为痔的防治提供新的理论依据。方法1.收集分析临床分期不同的内痔标本：详细询问并记录患者病史（年龄、性别、病史、出血史、血红蛋白等）,排除肿瘤、克罗恩病等疾病,根据内痔分期共分为正常组和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期内痔组共4组（无痔病史的肛瘘术中取正常肛垫组织;肛裂伴裂痔、外痔术中取I期内痔）。2.制作内痔分期不同的标本：①.病理标本制作：术后立即将标本修剪为1×1×0.2cm大小组织块,固定于10%的甲醛溶液中,乙醇梯度脱水,浸蜡包埋,切片,贴片和烘片（切片时采用连续切片和全切片的方式）。（1）.HE染色：脱蜡→水化→苏木精液染色→盐酸乙醇酸化→返蓝→伊红液染色→乙醇梯度脱水→二甲苯透明→封片。（2）.Masson染色：脱蜡→水化→Weiger氏铁苏木素染色→盐酸酒精分化→丽春红酸性品红液染色→磷钼酸酸化→苯胺蓝液复染→冰醋酸→梯度乙醇脱水→二甲苯透明→封片。（3）.免疫组织化学染色：脱蜡→水化→柠檬酸盐修复→H2O2氧化→→抗室温孵育→二抗室温孵育→DAB显色→苏木精染色→盐酸乙醇酸化→流水返蓝→梯度脱水→二甲苯透明→封片。②.电镜标本制作：术后立即将标本用眼科剪修成0.5～1mm3小块,编号后将标本用2.5%戊二醛固定2h,0.1mol/L磷酸盐缓冲液20min×3次;锇酸1.5h固定,蒸馏水洗5min×3次。梯度脱水,浸透包埋,聚合,超薄切片,染色。3.观察与分析内痔黏膜损伤与血管重构的形成：①光镜下观察：（1）.观察不同分组标本的黏膜被覆上皮破坏,糜烂和溃疡,腺体数目、形态、排列,炎性细胞的群聚的程度。（2）.观察不同分组标本的黏膜层血管,管腔扩张,厚壁血管及dieulafoy样血管的数目。（3）.观察不同分组标本的厚壁血管及dieulafoy样血管管壁的纤维化程度。②电镜下观察：（1）.观察不同分组标本的黏膜层被覆上皮破坏、毛细血管内皮细胞的排列、核和染色质的形状。（2）.观察不同分组标本的黏膜层血管内皮表面微绒毛,吞饮小泡,基底膜是否完整,细胞核的变化,内皮细胞间隙,线粒体的空泡化或固缩,细胞质内的棒状小体、圆形颗粒密度。4.整合损伤与血管重构形成的信号表达因子：光镜下观察不同分组标本的黏膜层HIF-1α、VEGF、CD34、CD105、MMP-9、TGF-β、Actin的表达程度（所有切片染色后均经二位医师双盲法阅片,每例均随机观察5个20倍视野）。① HIF-1α、MMP-9判断标准：计算阳性细胞所占的百分比。根据纪小龙等提供的免疫组化阳性判断标准：免疫组化产物阳性呈

关键词：内痔免疫组化病理缺氧血管重建内痔出血 dieulafoy样畸形血管

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