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Protein & Cell 2019年第5期10卷 327-346页

作者： Xi Chen Lin Wang Rujin Huang Hui Qiu Peizhe Wang Daren Wu Yonglin Zhu Jia Ming Yangming Wang Jianbin Wang Jie Na Center for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine School of MedicineTsinghua UniversityBeijing 100084China Beijing Key Laboratory of Cardiometabolic Molecular Medicine Institute of Molecular MedicinePeking UniversityBeijing 100871China School of Life Sciences Tsinghua UniversityBeijing 100084China

Primitive mammalian heart transforms from a single tube to a four-chambered muscular organ during a short developmental *** found that knocking out global microRNA by deleting dgcr8 microprocessor in Mespl cardiovascular progenitor cells lead to the formation of extremely dilated and enlarged heart due to defective cardiomyocyte(CM)*** analysis revealed unusual upregulation of vascular gene expression in dgcr8 cKO *** cell RNA sequencing study further confirmed the increase of angiogenesis genes in single dgcr8 cKO *** also performed global microRNA profiling of E9.5 heart for the first time,and identified that miR-541 was transiently highly expressed in E9.5 ***,introducing miR-541 back into microRNA-free CMs partially rescued their defects,downregulated angiogenesis genes and significantly upregulated cardiac ***,miR-541 can target Ctgf and inhibit endothelial *** results suggest that micro-RNAs are required to suppress abnormal angiogenesis gene program to maintain CM differentiation.

关键词： microRNA dgcr8 Cardiovascular progenitor cells miRNA-541 Single cell RNA sequencing

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dgcr8在结直肠癌中的表达及临床意义

华中科技大学学报（医学版） 2016年第2期45卷 198-201页

作者：陈勇王向阳蔡威王辉广州军区武汉总医院急诊科武汉430070 武汉市中心医院胃肠外科武汉430014

目的探讨dgcr8基因在结直肠癌中的表达及临床意义。方法应用免疫组织化学的方法对126例结直肠癌组织、正常结直肠黏膜以及淋巴结病理切片中的dgcr8蛋白进行检测。结果 dgcr8的表达在结直肠癌组织和转移淋巴结组织中明显高于正常黏膜,其... 详细信息

目的探讨dgcr8基因在结直肠癌中的表达及临床意义。方法应用免疫组织化学的方法对126例结直肠癌组织、正常结直肠黏膜以及淋巴结病理切片中的dgcr8蛋白进行检测。结果 dgcr8的表达在结直肠癌组织和转移淋巴结组织中明显高于正常黏膜,其表达水平与淋巴结转移、远处转移、临床Dukes分期、CEA以及生存时间等密切相关(均Pdgcr8表达上调可能促进结直肠癌的发生、发展、转移并且影响预后。

关键词： dgcr8 结直肠癌预后

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dgcr8对卵巢癌发生发展的体内外实验研究

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DGCR8对卵巢癌发生发展的体内外实验研究

作者：田捧郑州大学

学位级别：硕士

近年来由于多种因素的作用,卵巢癌的发病率在逐年上升,且卵巢的解剖学位置较深,其发病早期不易被发现,在治疗过程中极易对化疗药物产生耐药性,手术治疗后极易复发,综合这些特点使卵巢癌成为妇科恶性肿瘤中致死率最高的恶性肿瘤,晚期卵巢... 详细信息

近年来由于多种因素的作用,卵巢癌的发病率在逐年上升,且卵巢的解剖学位置较深,其发病早期不易被发现,在治疗过程中极易对化疗药物产生耐药性,手术治疗后极易复发,综合这些特点使卵巢癌成为妇科恶性肿瘤中致死率最高的恶性肿瘤,晚期卵巢癌5年生存率仅20%-30%,严重影响着女性病人的生存质量及寿命。因此研究卵巢癌的发病机制、寻找新的有效治疗卵巢癌的靶点,对卵巢癌诊断、治疗和预防手术后复发有着非常重要的意义。miRNA是长度22nt左右的非编码小RNA,通过与多种靶基因nRNA的3’UTR不完全互补结合,降解靶基因,达到对这些基因负向调控的目的,从而调节机体相应的生理功能,如细胞分化、增殖等,且其可以在肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因的作用,调控人类肿瘤的发生发展。 dgcr8是位于人类22号染色体q11.2区域的一个等位基因,因其与迪乔治综合症(Digeorge Syndrome, DGCS)相关,故命名为dgcr8。 dgcr8包括两个RNA结合区,在miRNA的合成过程中,它不仅可以结合pri-miRNA,还可以通过与Drosha相互作用和稳定微处理器复合物来促进Drosha的切割作用,调控miRNA的生成,影响miRNA对基因的调控作用。由此可见dgcr8是参与miRNA合成与成熟的重要蛋白。目前研究发现dgcr8参与人类多种疾病的发生,干预dgcr8的表达可以作为疾病研究的模型。众多的研究报道显示dgcr8的异常可以引起miRNA的表达发生改变,从而参与肿瘤的发生发展,影响肿瘤的预后。因此我们设想沉默卵巢癌细胞系中dgcr8的表达,分析研究其对卵巢癌的影响,以期为卵巢癌的诊断和治疗提供新的发病机制和靶点。目的 1体外实验研究dgcr8对卵巢癌细胞系SKOV3的影响(抑癌基因或者癌基因),同时筛选沉默dgcr8表达改变引起的SKOV3细胞系中miRNA表达谱的变化,分析dgcr8在卵巢癌中发挥作用的分子生物学机制,为卵巢癌的诊断和治疗奠定基础。 2动物实验,进一步为dgcr8作为卵巢癌诊断指标的可行性奠定分子生物学基础。 3分析研究dgcr8在卵巢癌组织中的表达,评估dgcr8作为卵巢癌诊疗标记物的可行性。方法 1细胞培养本课题研究中使用的人卵巢癌细胞株SKOV3购自美国菌种保藏中心,培养液为含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM培养基,置于37℃、5%C02的恒温培养箱中培养,每2-3天传代一次。 2免疫荧光染色检测dgcr8在SKOV3细胞中的表达情况将SKOV3细胞和沉默dgcr8表达的SKOV3细胞在24孔板培养后,苯甲醛固定细胞,加入dgcr8一抗过夜,第二天PBST洗涤3遍,加入兔荧光二抗1小时,PBST洗涤3遍,同时在24孔板滴加DAPI染色液进行核染色,荧光显微镜下观察两组荧光强弱并拍照。 3蛋白印迹法检测dgcr8和细胞生长增殖相关信号通路p-AKT、p-ERK的表达情况将SKOV3细胞和沉默dgcr8表达的SKOV3细胞培养,收获细胞,洗涤,在l×蛋白裂解液(RIPA)中裂解;采用蛋白印迹法检测细胞dgcr8、p-AKT和p-ERK蛋白的表达强度,以GAPDH为内对照。 4MTT、细胞计数和细胞集落形成实验研究细胞生长增殖速度 MTT：用含10%胎牛血清的DMEM完全培养液将SKOV3(对照组)和沉默dgcr8(实验组)表达的SKOV3细胞,配成细胞悬液,吹打均匀,按每孔8000个细胞接种在96孔板,培养96h后,每孔加入10μ1的四甲基偶氮唑蓝(MTT,5mg/m1)溶液,继续培养4h后,加入100u1的去垢剂。置于多功能酶标仪中,于570nn波长处测定其吸光度(A)值。细胞计数：实验组和对照组细胞,以每孔5x104个细胞接种在6孔板,于24、48、72、96小时各计数一次,比较实验组和对照组细胞的生长速度。细胞集落实验：实验组和对照组细胞按每孔200个细胞接种于6孔板,每2-3天换液一次,2周后固定结晶紫染色,分析比较两组细胞集落大小及数目。 5细胞迁移划线,transwell侵蚀小室和软琼脂集落形成实验(soft agar)分析研究细胞的迁移和侵袭能力细胞迁移划线：实验组和对照组各5x105个细胞一式三份平铺在六孔板上过夜,第二天用20u1的枪头划线,PBS洗3遍,记为0小时,光学显微镜下照相,继续培养24小时后PBS洗三遍,显微镜下照相,比较0小时和24小时细胞迁移的面积,分析两组细胞的迁移速率。细胞侵袭Transwell侵蚀小室：1x105个细胞用含1%胎牛血清的DMEM培养液培养,种在上小室的基底膜基质上,下室加入含10%胎牛血清的DMEM,培养24小时。荧光显微镜下照相,比较两组细胞的侵袭能力。软琼脂集落形成实验：1.2%的琼脂和2xDMEM混合加入

关键词： dgcr8 卵巢癌调控机制

circ_0090315诱导dgcr8的去乙酰化促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

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中国药理学通报 2023年第4期39卷 799-800页

作者：李千千郭平王斌刘朝旭王家颖张家港市第二人民医院骨科江苏张家港215600 华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科湖北武汉430030 张家港市港城康复医院神经康复科江苏张家港215618

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种中老年人常见的代谢性骨病,破骨细胞与成骨细胞的平衡被打破是导致OP发生的重要原因[1]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是多能基质细胞,可分化为成骨细胞、软骨细胞和... 详细信息

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种中老年人常见的代谢性骨病,破骨细胞与成骨细胞的平衡被打破是导致OP发生的重要原因[1]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是多能基质细胞,可分化为成骨细胞、软骨细胞和许多其他细胞类型[2]。本研究借助生物信息学分析发现,circ_0090315在BMSCs向成骨细胞分化的过程中表达增强,并将进一步对其潜在的作用机制展开探讨。1材料与方法1.1仪器与试剂人骨髓源性间充质干细胞(上海泽叶生物科技有限公司);实验所用质粒或载体均由汉恒生物科技(上海)有限公司设计并合成;Lipofectamine 3000转染试剂(Invitrogen);成骨分化培养基(妙顺上海生物科技有限公司);碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)光学显微镜(济南欧莱博科学仪器有限公司);茜素红染色(alizarin red staining,ARS)试剂(上海麦克林生化科技有限公司);逆转录试剂盒(上海凌仪生物科技有限公司);PCR试剂盒(上海北诺生物科技有限公司);Western blot中所有抗体均购自Abcam;Ch IP检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);双荧光素酶报告试剂盒(Thermo Fisher)。

关键词： circ_0090315 dgcr8 骨髓间充质干细胞成骨细胞乙酰化成骨分化

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dgcr8/ZFAT-AS1通过PRC2促进CDX2转录调控胶质瘤细胞生物学行为的机制研究

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DGCR8/ZFAT-AS1通过PRC2促进CDX2转录调控胶质瘤细胞生物学行为的...

作者：张芳芳中国医科大学

学位级别：硕士

目的:脑胶质瘤是人中枢神经系统中最常见的原发性颅内恶性肿瘤。尽管近年来手术切除、化疗和放疗在胶质瘤治疗方面取得了显著进展,但胶质瘤患者的预后仍然很差,在所有癌症中,5年生存率最低,病理级别高的胶质瘤患者中位生存期大约为15个... 详细信息

目的:脑胶质瘤是人中枢神经系统中最常见的原发性颅内恶性肿瘤。尽管近年来手术切除、化疗和放疗在胶质瘤治疗方面取得了显著进展,但胶质瘤患者的预后仍然很差,在所有癌症中,5年生存率最低,病理级别高的胶质瘤患者中位生存期大约为15个月。因此探索新的有效的分子靶向治疗标志具有重要意义。本研究旨在为揭示RNA结合蛋白dgcr8和长链非编码RNA ZFAT-AS1是否在调控胶质瘤细胞生物学行为中发挥重要作用,并深入研究可能的分子调控机制,即dgcr8促进ZFAT-AS1降解以减弱其以PRC2依赖的方式对CDX2的转录抑制,上调CDX2的表达,促进胶质瘤细胞的生物学行为。研究方法:首先培养人胶质瘤细胞U87、U251和人星型胶质细胞HA。通过quantitative Real-time PCR方法和Western blot方法检测在瘤周脑实质、胶质瘤组织、人星型胶质细胞、胶质瘤细胞中,dgcr8、ZFAT-AS1、CDX2和RRM2B的表达水平。为进一步检测其对胶质瘤细胞生物学行为的作用,通过细胞稳定转染方法分别构建dgcr8沉默的细胞系,以及ZFAT-AS1、CDX2和RRM2B过表达和表达沉默的细胞系,并且应用细胞活性CCK-8法、流式细胞仪、迁移侵袭Transwell法分别检测细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的变化。分别应用quantitative Real-time PCR和Western Blot方法检测dgcr8、ZFAT-AS1、CDX2和RRM2B的表达水平变化。RIP实验验证dgcr8和ZFAT-AS1的结合作用。RIP实验和RNA pull-down实验验证ZFAT-AS1与亚基EZH2的结合,ChIRP实验验证ZFAT-AS1存在于CDX2启动子区,ChIP实验检测CDX2启动子区发生H3K27me3修饰。ChIP实验和荧光素酶基因报告系统分析CDX2分别与RRM2B、dgcr8启动子区的直接结合作用。裸鼠皮下移植瘤实验和裸鼠脑原位瘤实验分别检测dgcr8和ZFAT-AS1对裸鼠移植瘤的抑瘤效应和对裸鼠的生存时间的影响。结果:本研究发现dgcr8、CDX2和RRM2B在胶质瘤组织和细胞中高表达,ZFAT-AS1低表达。沉默dgcr8、CDX2和RRM2B的表达以及过表达ZFAT-AS1抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进胶质瘤细胞凋亡。dgcr8通过降低ZFAT-AS1的稳定性下调其表达,进而促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抑制胶质瘤细胞的凋亡。ZFAT-AS1与PRC2的催化亚基EZH2结合,并共同存在于CDX2的启动子区。ZFAT-AS1通过招募并结合PRC2在CDX2启动子区诱导的H3K27me3修饰作用,进而抑制CDX2的转录和表达,抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进胶质瘤细胞凋亡。CDX2与RRM2B的启动子区结合,促进其转录和表达,进而促进胶质瘤细胞恶性生物学行为。CDX2与dgcr8启动子区结合,促进其转录和表达,形成正反馈环路共同调控胶质瘤细胞生物学行为。联合应用dgcr8沉默和ZFAT-AS1过表达对裸鼠移植瘤的抑瘤效应最佳,并对原位瘤裸鼠的生存期延长效应最显著。结论:***8、CDX2和RRM2B在胶质瘤组织和细胞中高表达,ZFAT-AS1低表达。沉默dgcr8、CDX2、RRM2B的表达以及过表达ZFAT-AS1能够抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力,促进细胞凋亡。***8能够降低ZFAT-AS1的稳定性。沉默dgcr8的表达,通过增强ZFAT-AS1的稳定性,抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。***-AS1与PRC2的催化亚基EZH2结合,增强PRC2在CDX2启动子区诱导的H3K27me3修饰作用,增强对CDX2的转录抑制作用,降低CDX2的表达,进而抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并促进细胞凋亡。***2通过与靶基因RRM2B的启动子区结合,促进其转录,进而促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并抑制细胞凋亡。CDX2通过与dgcr8的启动子区结合,促进其转录,进而形成正反馈环路,共同调控胶质瘤细胞生物学行为。

关键词： RNA结合蛋白 dgcr8 长链非编码RNA ZFAT-AS1 PRC2 H3K27me3 胶质瘤

dgcr8在先天性心脏病中的表达及临床意义

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DGCR8在先天性心脏病中的表达及临床意义

作者：李保平郑州大学

学位级别：硕士

先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)是指出生时就具有的心血管结构或功能的异常,是导致新生儿、婴儿期致残、致死的重要原因。先天性心脏病简称先心病,全球先心病的发病率呈现上升趋势,目前先心病居我国出生缺陷首位,已成为影... 详细信息

先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)是指出生时就具有的心血管结构或功能的异常,是导致新生儿、婴儿期致残、致死的重要原因。先天性心脏病简称先心病,全球先心病的发病率呈现上升趋势,目前先心病居我国出生缺陷首位,已成为影响儿童身心健康及人口生存质量的重大公共卫生问题。因此提高先心病的产前筛查率,降低其的发病率,提高出生人口素质至关重要。先心病的病因多种多样,目前随着研究水平的提高,遗传因素越来越受到研究者的重视。dgcr8(Di George syndrome critical region8)是位于人类22号染色体长臂1区1带2亚带(22qll.2)区域的一个等位基因,与迪乔治综合症(Digeorge Syndrome,DGS)的发生密切相关。研究发现22qll区域相关基因的缺失会导致先天性心脏病、面部特征异常、胸腺发育不完全及一定程度上的精神疾病等。近年来的相关研究显示dgcr8可参与多种疾病的发生、发展,而目前对dgcr8与先心病发生之间的关系研究甚少。我们对dgcr8在先心病患儿中的表达进行了临床研究,本研究发现dgcr8在先心病患儿中低表达,其与先心病的发生密切相关,为dgcr8在先心病中的作用提供新的认识,为先心病胎儿产前诊断提供新的线索。并且研究表明dgcr8与心脏间隔缺损大小及肺动脉高压无明显相关性,对先心病的进一步发展及转归无影响,不能作为先心病临床转归的评估指标。目的1.通过对dgcr8在临床先心病患儿中分子水平及蛋白水平的表达进行研究,探索dgcr8与先心病发生的作用机理,以期为后期先心病的产前诊断的研究提供新的依据,为临床决策提供新的筛查指标。2.通过对dgcr8与临床先心病患儿的临床相关因素进行相关性分析,评估dgcr8作为先心病的病情进一步发展及转归指标的可行性。方法1.收集先天性心脏病患儿血液40例及健康儿童血液40例,采用q RT-PCR方法检测dgcr8的表达。2.收集室间隔缺损(ventricular septal defect,VSD)患儿心肌组织25例,法洛氏四联症(tetralogy of fallot,TOF)患儿心肌组织16例,采用q RT-PCR方法检测dgcr8 m RNA的表达,Western blot方法检测dgcr8蛋白的表达。3.统计分析dgcr8与心脏间隔缺损大小及肺动脉高压的相关性。4.统计学分析:采用SPSS 21.0软件进行数据处理,定量资料以中位数(四分位间距),即Md(P25,P75)表示,两组间比较采用两独立样本的Wilcoxon秩和检验,定性资料采用χ2检验。相关性分析采用Spearman秩相关分析方法。检验水准为α=0.05。结果1.一般资料比较:实验各组在年龄、性别构成上经统计学检验,两两之间无明显差异(Pdgcr8 m RNA在先心病患儿血液中低表达,差异具有统计学意义(Pdgcr8在分子水平及蛋白水平的表达均高于法洛四联症,差异均具有统计学意义(P8的缺失与先天性心脏病患儿的心脏间隔缺损大小无关(r=-0.022,P>0.05),与肺动脉高压的发生无明显相关性(P>0.05)。结论***8与先天性心脏病的发生密切相关,其表达的缺失可能阻碍了胚胎时期心脏的结构、血管的正常发育,且表达量越低导致的先心病越复杂,可能是导致先心病发生的重要因素。***8对先天性心脏病患儿间隔缺损大小及肺动脉高压的形成无直接作用,对先心病的病情进一步发展及转归无明显临床意义,不能作为评估指标。

关键词： dgcr8 先天性心脏病室间隔缺损法洛四联症间隔缺损肺动脉高压

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dgcr8在喉鳞癌中的表达和意义

DGCR8在喉鳞癌中的表达和意义

作者：李禹诺遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:本课题通过对dgcr8在喉鳞癌及癌旁组织中的表达进行研究,分析dgcr8基因的表达在癌组织及癌旁组织中是否有区别,以期为喉癌的诊断提供新的筛查指标,探讨dgcr8与喉鳞癌患者临床信息、病理特征以及生存预后的相关性,探究dgcr8与喉鳞... 详细信息

目的:本课题通过对dgcr8在喉鳞癌及癌旁组织中的表达进行研究,分析dgcr8基因的表达在癌组织及癌旁组织中是否有区别,以期为喉癌的诊断提供新的筛查指标,探讨dgcr8与喉鳞癌患者临床信息、病理特征以及生存预后的相关性,探究dgcr8与喉鳞癌的发生发展的关系,评估dgcr8作为喉鳞癌进一步发展及筛查指标的可行性。方法:(1)收集2019年12月至2020年12月就诊于我院的经临床及病理学诊断为喉鳞癌的手术患者共25例,记录患者的临床资料,采用q RT-PCR及免疫印迹(Western blot,WB)技术检测喉鳞癌及癌旁组织中dgcr8m RNA及其蛋白的表达,采用χ检验分析dgcr8m RNA与喉鳞癌患者性别、年龄、T分期,临床分期以及淋巴结转移的相关性。(2)利用生物信息学技术对TCGA数据库中的123例喉鳞癌的肿瘤样本及癌旁样本进行分析,利用limma R包及perl语言对数据进行处理分析,利用Wilcoxon秩和检验分析喉鳞癌样本及癌旁样本中dgcr8表达量的差异性,利用R软件Wilcoxon秩和检验及Kruskal-Wallis秩和检验对dgcr8在喉鳞癌中的表达量与年龄、性别、肿瘤分期、有无淋巴转移以及病理分级的关系进行分析。利用R软件包对Kaplan-Meier方法处理后合并生存信息的数据进行dgcr8与喉鳞癌生存预后关系分析。结果:(1)q RT-PCR实验结果显示(1)dgcr8m RNA在喉鳞癌组织中的表达显著高于癌旁组织(Pdgcr8m RNA表达在T分期中有差异(pdgcr8m RNA在不同性别、年龄、淋巴结转移、不同临床分期中表达无差异(p>0.05)(2)WB实验结果显示dgcr8蛋白在喉鳞癌中的表达显著高于癌旁组织(Pdgcr8在喉鳞癌样本中表达显著高于癌旁组织样本(Pdgcr8的表达在T1+T2期高于T3+T4期(pdgcr8在性别、年龄、淋巴结转移、临床分期、病理分级表达差异无统计学意义(P>0.05)(4)dgcr8与喉鳞癌生存预后无明显相关性(P>0.05)结论:1.喉鳞癌组织中dgcr8的表达与癌旁组织相比明显增高,并且dgcr8的表达与喉鳞癌的T分期有相关性,提示dgcr8与喉鳞癌的发生发展有关。2.生物信息学分析结果与实验结果相似,喉鳞癌中dgcr8的表达在T1+T2期中高于T3+T4期,提示其可能有望成为喉鳞癌早期筛查指标。其线型图趋势提示dgcr8高表达喉鳞癌患者5年存活率更高,但差异无统计学意义,提示dgcr8的表达与喉鳞癌的预后无明显相关性。

关键词： dgcr8 喉鳞癌生物信息学分析

HBV蛋白通过转录因子YY1调节miRNAs形成相关因子dgcr8的表达

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HBV蛋白通过转录因子YY1调节miRNAs形成相关因子DGCR8的表达

作者：任敏重庆医科大学

学位级别：硕士

目的研究HBV蛋白对miRNAs形成相关因子dgcr8表达的调控作用，并对其作用机制进行初步探讨，为研究HBV引起的miRNAs异常表达机制提供一种新的思路。方法1.用RT-PCR和Real-Time PCR的方法检测dgcr8在HepG2细胞及HepG2.2.15细胞中的差异表... 详细信息

目的研究HBV蛋白对miRNAs形成相关因子dgcr8表达的调控作用，并对其作用机制进行初步探讨，为研究HBV引起的miRNAs异常表达机制提供一种新的思路。方法1.用RT-PCR和Real-Time PCR的方法检测dgcr8在HepG2细胞及HepG2.2.15细胞中的差异表达，并将HBV表达质粒(pCH9/3091)瞬时转染HepG2细胞，进一步确证HBV对dgcr8表达的影响，最后用Western blot验证上述结果。2.双荧光素酶报告系统分析HBV是否对dgcr8启动子有调节作用。首先构建dgcr8启动子质粒（pGL3-dgcr8-P），将其与pCH9/3091共转染HepG2细胞，以此检测HBV对dgcr8启动子活性的影响。3.构建HBV的四种蛋白的表达质粒HBc、HBp、HBs及HBx，分别与pGL3-dgcr8-P共转染HepG2细胞，分析HBV蛋白对dgcr8启动子活性的影响情况。在HepG2.2.15细胞中干扰掉相应蛋白，用双荧光素酶报告系统及Western blot验证上述蛋白对dgcr8表达的影响。4.寻找dgcr8启动子上可能结合的转录因子，通过RT-PCR及Western blot的方法检测HBV对相关转录因子的mRNA和蛋白表达的影响。通过双荧光素酶报告系统检测相关转录因子对dgcr8启动子活性的影响，Western blot检测转录因子对dgcr8蛋白表达的影响，并用shRNA在HepG2.2.15细胞中干扰相应转录因子的表达，通过双荧光素酶报告系统和Western blot验证上述结果。结果1. RT-PCR和Real-Time PCR结果显示， dgcr8mRNA在HepG2.2.15细胞中的表达较HepG2细胞降低，将HBV表达质粒以一定的浓度梯度转染入HepG2细胞后可见dgcr8的表达随HBV转染量的增高而降低，Western blot结果证实HBV可以下调dgcr8蛋白表达水平。2.构建了dgcr8启动子表达质粒，并证明了其活性。将dgcr8启动子质粒与pCH9/3091共转HepG2细胞，发现HBV能降低dgcr8启动子的活性，并且HBV对启动子的抑制作用呈剂量依赖性，最后我们通过双荧光素酶报告系统进一步在稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞中验证了HBV对dgcr8启动子活性的抑制作用。3.将HBV四种蛋白的表达质粒与dgcr8启动子质粒共染转HepG2细胞，发现HBs和HBx对dgcr8启动子活性影响最为明显。在HepG2.2.15细胞中分别抑制HBs和HBx的表达后，双荧光素酶报告系统检测显示dgcr8启动子活性有所恢复，Western blot检测显示dgcr8蛋白表达水平有所升高。4.通过生物信息学的方法搜寻到dgcr8启动子区域有转录因子YY1的结合位点。首先我们通过RT-PCR和Western blot的方法证实了HBV可以促进YY1的表达。然后将YY1的表达质粒与dgcr8启动子共转染HepG2细胞后发现YY1能下调dgcr8启动子活性，Western blot实验也验证了这一结果。随后在HepG2.2.15细胞中抑制YY1的表达，dgcr8启动子活性有所升高，dgcr8蛋白表达水平也升高。结论HBV能通过减弱dgcr8启动子活性降低其转录水平和蛋白水平的表达，其中HBs和HBx蛋白起主要作用，这一过程可能是通过转录因子YY1介导的。本研究探讨了HBV对dgcr8表达的调节机制，为研究HBV导致的miRNA的异常表达提供了新的思路，进一步阐明了HBV的生物学作用。

关键词： HBV dgcr8 启动子基因表达与调节

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dgcr8基因对小鼠生长受限的影响

河南医学研究 2021年第29期30卷 5377-5380页

作者：田捧郭玉琪郭智宽郑州大学第三附属医院超声科河南郑州450052 郑州大学第三附属医院中医科河南郑州450052 河南省人民医院妇产科河南郑州450003

目的构建dgcr8基因敲除小鼠以及小鼠胚胎成纤维细胞(Mef)模型,探讨dgcr8对小鼠生长发育的影响,以期为胎儿生长受限(FGR)寻找新的靶点。方法通过基因型为dgcr8^(loxp/loxp)和含有β-actin-Cre-ER^(T2)的小鼠模型进行繁殖,获得基因型为DGC... 详细信息

目的构建dgcr8基因敲除小鼠以及小鼠胚胎成纤维细胞(Mef)模型,探讨dgcr8对小鼠生长发育的影响,以期为胎儿生长受限(FGR)寻找新的靶点。方法通过基因型为dgcr8^(loxp/loxp)和含有β-actin-Cre-ER^(T2)的小鼠模型进行繁殖,获得基因型为dgcr8^(loxp/loxp)(对照组)和dgcr8^(loxp/loxp/actin-cre)(实验组)可诱导型基因敲除小鼠。在小鼠出生后第14天注射4 mg他莫昔芬,首次测量14日龄的小鼠体质量,以后每3 d测量一次体质量,比较对照组和实验组小鼠的体质量。采用同样的方法构建胚胎期基因型为dgcr8^(loxp/loxp)和dgcr8^(loxp/loxp/actin-cre)小鼠模型,提取胚胎期Mef,检测Mef细胞中信号蛋白磷酸化的细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)、增殖细胞核抗原(PCNA)的水平。结果dgcr8基因敲除小鼠的生长速度低于正常小鼠,dgcr8敲除Mef细胞中p-ERK1/2、PCNA的表达量低于正常Mef细胞(Pdgcr8基因敲除小鼠及Mef细胞生长发育受限,dgcr8基因与小鼠生长发育受限密切相关,dgcr8有望成为FGR的基因靶点。

关键词： dgcr8 Mef细胞生长发育

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YB1 regulates miR-205/200b-ZEB1 axis by inhibiting microRNA maturation in hepatocellular carcinoma

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Cancer Communications 2021年第7期41卷 576-595页

作者： Xiumei Liu Di Chen Huan Chen Wen Wang Yu Liu Yawei Wang Chao Duan Zhen Ning Xin Guo Wuxiyar Otkur Jing Liu Huan Qi Xiaolong Liu Aifu Lin Tian Xia Hong-xu Liu Hai-long Piao CAS Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry Dalian Institute of Chemical PhysicsChinese Academy of SciencesDalianLiaoning 116023P.R.China Department of Thoracic Surgery Liaoning Cancer Hospital&InstituteCancer Hospital of China Medical UniversityShenyangLiaoning 110042P.R.China Department of Hepatobiliary Surgery The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University Dalian Medical UniversityDalianLiaoning 116000P.R.China MOE Laboratory of Biosystem Homeostasis and Protection College of Life SciencesZhejiang UniversityHangzhouZhejiang 310058P.R.China Department of Biochemistry&Molecular Biology School of Life SciencesChina Medical UniversityShenyangLiaoning 110122P.R.China

Background:Y-box binding protein 1(YB1 or YBX1)plays a critical role in tumorigenesis and cancer ***,whether YB1 affects malignant transformation by modulating non-codingRNAs remains largely *** study aimed to investigate the relationship between YB1 and microRNAs and reveal the underlying mechanism by which YB1 impacts on tumor malignancy via miRNAs-mediated regulatory ***:The biological functions of YB1 in hepatocellular carcinoma(HCC)cells were investigated by cell proliferation,wound healing,and transwell invasion *** miRNAs dysregulated by YB1 were screened by microarray analysis in HCC cell *** regulation of YB1 on miR-205 and miR-200b was determined by quantitative real-time PCR,dual-luciferase reporter assay,RNA immunoprecipitation,and pull-down *** relationships of YB1,dgcr8,Dicer,TUT4,and TUT1 were identified by pull-down and coimmunoprecipitation *** cellular co-localization of YB1,dgcr8,and Dicer were detected by immunofluorescent *** in vivo effect of YB1 on tumor metastasis was determined by injecting MHCC97H cells transduced with YB1 shRNA or shControl via the tail vein in nude BALB/c *** expression levels of epithelial tomesenchymal transition markerswere detected by immunoblotting and immunohistochemistry ***:YB1 promoted HCC cell migration and tumor metastasis by regulating miR-205/200b‒ZEB1 axis partially in a Snail-independent ***1 suppressedmiR-205 and miR-200b maturation by interacting with the microprocessors dgcr8 and Dicer as well as TUT4 and TUT1 via the conserved cold shock ***,the downregulation of miR-205 and miR-200b enhanced ZEB1 expression,thus leading to increased cell migration and ***,statistical analyses on gene expression data from HCC and normal liver tissues showed that YB1 expression was positively associated with ZEB1 expression and remarkably correlated with clinical ***:This st

关键词： dgcr8 Dicer hepatocellular carcinoma microRNA maturation YB1 ZEB1