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MiR-671-3p靶向deptor而抑制乳腺癌细胞的增殖与侵袭

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南方医科大学学报 2020年第1期40卷 42-48页

作者：夏巍龚德贵秦晓平蔡茁南方医科大学细胞生物学教研室广东广州510515 中国人民解放军陆军第74集团军医院检验科广东广州510310 南部战区空军医院药剂科广东广州510602

目的研究miR-671-3p对乳腺癌细胞增殖、侵袭生物学功能的影响及其可能的作用机制。方法以实时荧光定量PCR方法检测正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)与乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR3)中miR-671-3p表达情况;检测miR-671-3p在MCF-7细胞... 详细信息

目的研究miR-671-3p对乳腺癌细胞增殖、侵袭生物学功能的影响及其可能的作用机制。方法以实时荧光定量PCR方法检测正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)与乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR3)中miR-671-3p表达情况;检测miR-671-3p在MCF-7细胞中的转染效率;通过CCK-8法检测miR-671-3p对MCF-7细胞增殖的影响;通过Transwell实验、划痕实验检测miR-671-3p对MCF-7细胞侵袭迁移能力的影响;Targetscan预测miR-671-3p的靶基因,并通过双荧光素酶法和Western blot法对靶基因deptor进行验证,并检测deptor的表达。结果 miR-671-3p在乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR3的表达量低于乳腺正常上皮细胞MCF-10A的表达。通过mimics、inhibitor分别促进、抑制miR-671-3p在MCF-7细胞中的表达后,结果显示miR-671-3p对乳腺癌细胞的增殖有抑制作用(Pdeptor蛋白为miR-671-3p的直接作用靶点,过表达miR-671-3p可直接抑制deptor蛋白的表达。结论 miR-671-3p直接靶向作用于deptor蛋白从而抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭。

关键词：乳腺癌 miR-671-3p deptor 细胞增殖肿瘤浸润

体外RNA干扰下调deptor表达对人多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡能力的影响

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中国生物工程杂志 2013年第5期33卷 13-21页

作者：张浩然曾志勇陈君敏福建医科大学附属第一医院福州350005

目的:研究探讨应用RNA干扰技术构建人deptor基因的shRNA慢病毒载体,鉴定在多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞上的沉默效果,并评价deptor对人多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡能力的影响。方法:设计4个deptor siRNA序列,化学合成后退火形成双链,克隆... 详细信息

目的:研究探讨应用RNA干扰技术构建人deptor基因的shRNA慢病毒载体,鉴定在多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞上的沉默效果,并评价deptor对人多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡能力的影响。方法:设计4个deptor siRNA序列,化学合成后退火形成双链,克隆到酶切的hU6-MCS-CMV-EGFP(GV115)-shRNA慢病毒载体。重组质粒经PCR测序鉴定后,脂质体介导下转染293T细胞,Western blot检测deptor的表达,筛选出干扰效果最佳的GV115-shRNA。将筛选的GV115-shRNA与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生成病毒,收集病毒上清并浓缩,测定浓度。将病毒颗粒感染多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞,应用Real-time PCR方法从mRNA水平及Western blot方法从蛋白水平检测deptor的沉默效果。运用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测骨髓瘤细胞增殖能力的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡;用Western blot分析cleaved caspase-3和cleaved PARP的变化。结果:构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,成功筛选出最有效抑制deptor表达的shRNA2序列,包装病毒后滴度达到1×109TU/ml。慢病毒感染RPMI-8226细胞后可表达EGFP,Real-time PCR和Western blot检测deptor的表达明显下降。下调deptor基因可显著减慢骨髓瘤细胞的生长速度(Pdeptor shRNA上调cleaved caspase-3、cleaved PARP和Bax表达,下调Bcl-2及PI3K/Akt信号通路的表达(Pdeptor shRNA重组慢病毒载体,其转染多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞后显著抑制了deptor的表达。deptor shRNA可以有效地诱导骨髓瘤细胞的凋亡,并抑制肿瘤细胞的增殖。PI3K/Akt信号通路可能参与了其凋亡过程。

关键词： deptor 多发性骨髓瘤RNA干扰增殖凋亡

deptor调节食管鳞状细胞癌化疗敏感性的不同功能的研究

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DEPTOR调节食管鳞状细胞癌化疗敏感性的不同功能的研究

作者：董晓颖南方医科大学

学位级别：硕士

一、研究背景与目的deptor作为mTORCl及mTORC2内源性抑制因子,在调控mTOR信号通路活性起重要作用。研究发现在多种肿瘤中deptor的表达被下调,如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、慢性髓系白血病,这使得mTOR信号通路处于过度激活状态而促进肿瘤... 详细信息

一、研究背景与目的deptor作为mTORCl及mTORC2内源性抑制因子,在调控mTOR信号通路活性起重要作用。研究发现在多种肿瘤中deptor的表达被下调,如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、慢性髓系白血病,这使得mTOR信号通路处于过度激活状态而促进肿瘤生长。然而在部分多发性骨髓瘤中deptor却意外的处于过表达状态,deptor的高表达可抑制mTOR通路的活性,通过负反馈机制最终导致Akt的活化,促进多发性骨髓瘤细胞的存活。目前,已有两篇文章报道了deptor与食管癌预后的关系。其中一研究结果显示:deptor在食管鳞癌患者中的表达上调,并提示患者较短的生存期。然而,另一研究结果表明:deptor的表达在食管鳞癌中下调,并提示较差的预后。根据这两组研究的结论提示我们,deptor在食管癌中的表达量及其在预测食管鳞状细胞癌(ESCC)预后中的作用,仍未定论,存在一定的争议。我们本次实验的目的在于:1、确定deptor在食管癌中的表达情况,及其对食管鳞状细胞癌预后的影响。2、deptor对食管鳞状细胞癌化疗反应的影响。二、研究方法1、在南方医院胸外科收集23例食管癌标本,将标本分为两部分,一部分进行组织固定,包埋、切片及免疫组化染色,观察deptor蛋白在组织中的表达部位以及表达水平;另一部分组织标本研磨并提取蛋白,采用免疫印迹的方法检测方法检测deptor蛋白在组织中的表达水平。2、于上海芯超公司购买组织芯片2套,共含180例食管癌标本。进行免疫组化染色,对deptor的染色结果进行评分,并做生存期分析。3、选取4种食管癌细胞系,1种永生化正常食管上皮细胞系,采用免疫印迹的方式,检测该5种细胞中deptor的表达水平,并根据deptor的表达水平,以永生化正常食管上皮为参考,进行分类。4、对4种食管癌细胞,培养过程中加入化疗药物,采用CCK-8的检测方式,观察4种食管癌细胞的存活情况。对4种食管癌细胞进行干扰和过表达,降低和升高deptor在细胞中的表达水平,并加入化疗药物,探究deptor表达水平的变化,对细胞化疗敏感性的影响。5、利用免疫印迹方式,探究deptor影响食管癌细胞化疗敏感性的具体分子机制。三、研究结果我们的研究结果显示deptor在肿瘤组织中的表达显著增加,并且在早期ESCC患者中提示较高的生存率。体外研究显示,可根据正常食管鳞状上皮细胞系HET-1A中的deptor表达量,将ESCC细胞系分为相对高和低deptor表达的亚群。在我们的研究中,不同水平的deptor表达影响着食管癌细胞系对化疗药物的反应。在相对低表达的细胞系中,deptor通过降低Akt活性增加化疗敏感性。在相对高表达的细胞系中,deptor通过在下调核糖体蛋白S6激酶(S6K)后负反馈激活IRS1-P13K-Akt-Survivin通路,从而增加细胞的化疗耐药。

关键词：化疗抵抗 deptor deptor表达亚组食管鳞状细胞癌 IRS1-PI3K-Akt-survivin通路

deptor在食管癌中的不同作用及其调节机制

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DEPTOR在食管癌中的不同作用及其调节机制

作者：王琳琳南方医科大学

学位级别：硕士

一、研究背景当今世界,在因癌症而死亡的癌种排序中食管癌处于第六位,并且在恶性肿瘤发病率的排序中位于第8名,因此,有关食管癌的各种研究极为重要。deptor起到负性调节mTOC1和mTOC2途径的作用,在正常组织中deptor抑制mTOR信号途径,而... 详细信息

一、研究背景当今世界,在因癌症而死亡的癌种排序中食管癌处于第六位,并且在恶性肿瘤发病率的排序中位于第8名,因此,有关食管癌的各种研究极为重要。deptor起到负性调节mTOC1和mTOC2途径的作用,在正常组织中deptor抑制mTOR信号途径,而在很多肿瘤中deptor表达水平下降,从而导致mTOR被激活,肿瘤得以发生发展。因此,deptor多数被认为是一种抑癌因子,阻碍肿瘤进程。然而我们在有关deptor与食管鳞癌的文献中发现,deptor的表达量并不都是降低的,并且对于患者的预后也有两个完全相反的结果。因此,我们大胆推测,deptor在食管癌中的表达水平,以及其在肿瘤进展过程中的作用,可能有着不一样的结果,并以此为基础进行本次实验探究。二、研究方法1、通过收集新鲜的临床组织样本以及购买组织芯片的方法,确认deptor在正常组织以及癌组织中的表达量,进行食管癌患者的生存期分析。2、采用人正常永生化食管上皮细胞系（HET-1A）以及四种人食管鳞癌细胞系（KYSE-510,EC-109,TE-1,TE-13）进行细胞实验,将deptor在这5种细胞系中的表达量进行比较并以此分类。3、在四种癌细胞中进行干扰或者过表达deptor,测量细胞增殖情况;对四种癌细胞进行不同种类不同浓度的药物处理,观察细胞存活数量;将四种癌细胞进行干扰或者过表达后,再加入药物处理,研究deptor表达量的多少对于细胞的化疗敏感能产生何种影响。4、通过Western Blot,探究deptor影响食管癌细胞系的潜在作用机制。三、研究结论1、deptor在食管鳞癌组织中的表达量高于正常组织,其存在有利于早期患者的生存。2、4种ESCC细胞系的deptor表达量均高于HET-1A细胞系,并且表达量各有不同,因此,将这四种ESCC细胞系分为deptor相对低表达组和deptor相对高表达组。3、在deptor相对低表达组中,deptor起促进细胞凋亡的作用,增加细胞对于化疗药物的敏感性;而在deptor相对高表达组中,其作用为抑制细胞凋亡,降低细胞的化疗敏感性。4、在deptor相对低表达组中,deptor抑制mTOR-AKT途径;在deptor相对高表达组中,deptor抑制mTOR-S6K1途径,使得IRS-1表达量增加,负反馈激活PI3K-AKT途径。

关键词： deptor PI3K AKT mTOR 食管鳞癌

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deptor基因敲除小鼠模型构建及分析

DEPTOR基因敲除小鼠模型构建及分析

作者：赖舒畅南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景糖尿病是由遗传因素和多种环境因素相互作用而引起的以血糖紊乱为主要特征的临床综合征。哺乳动物雷帕霉素靴蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）被发现是一种在进化上十分保守的一种丝/苏氨酸蛋白激酶。研究显示mTOR... 详细信息

研究背景糖尿病是由遗传因素和多种环境因素相互作用而引起的以血糖紊乱为主要特征的临床综合征。哺乳动物雷帕霉素靴蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）被发现是一种在进化上十分保守的一种丝/苏氨酸蛋白激酶。研究显示mTOR可以通过影响胰岛素信号通路、胰岛β细胞发育等多种途径影响胰岛素抵抗的发生从而参与糖尿病的发病。deptor是一种内源性mTOR抑制剂。研究发现,deptor对细胞代谢同样有着重要的影响。目前国内外均缺乏关于deptor是否在糖尿病的发病机制中起作用的研究,尤其是胰岛β细胞的方面的研究。基因敲除技术主要用于研究目的基因功能,条件性基因敲除技术以Cre/Loxp系统应用最为广泛。本研究以deptor为目标基因,探索deptor在糖尿病的发病机制中起作用,尤其是胰岛β细胞的方面的研究,从而为糖尿病和β细胞衰竭的治疗干预提供重要信息。研究方法1.观察deptor在db/db糖尿病小鼠模型胰岛细胞表达情况。2.根据Cre-loxP系统原理,构建条件性全身敲除deptor基因小鼠模型。3.根据Cre-loxP系统原理,构建条件性胰岛β细胞特异性敲除deptor基因小鼠模型。4.验证条件性全身敲除deptor基因小鼠模型基因敲除效果。5.验证条件性胰岛β细胞特异性敲除deptor基因小鼠模型基因敲除效果。*** blot、免疫组织化学、免疫荧光等方法检测敲除小鼠表型变化。统计学分析本研究中,所有数据均获得重复3次或以上数据,结果用均数±标准误表示,t检验和两因素方差分析对数据进行分析。P＜0.05表示结果有统计学意义。研究结果1.在db/db糖尿病小鼠模型胰岛β细胞中,deptor基因表达显著提高。2.构建了条件性全身敲除deptor基因小鼠模型。与野生型（WT）小鼠相比,WB结果证实,基因敲除小鼠组织中的deptor表达显著下降。3.构建了条件性胰岛β细胞特异性敲除deptor基因小鼠模型。WB结果证实,敲除小鼠胰腺组织中的deptor表达显著下降。免疫荧光结果证明,与对照组相比,敲除小鼠胰岛β细胞中deptor表达显著下降。4.在本研究初步结果显示:条件性全身敲除deptor基因小鼠和条件性胰岛β细胞特异性敲除deptor基因小鼠与对照小鼠比较,胰岛β细胞数量,形态等指标并未出现明显差异。条件性胰岛β细胞特异性敲除deptor基因小鼠进行腹腔葡萄糖耐量实验表现出糖耐量受损。结论本研究成功构建了条件性deptor基因全身敲除小鼠模型和首次构建了条件性胰岛β细胞特异性deptor基因敲除小鼠模型。对部分表型进行了初步探索,也为今后进一步研究deptor基因在糖尿病的发病机制中提供了研究平台。

关键词： deptor 糖尿病 β细胞 Cre/loxp系统

deptor调控骨髓间充质干细胞分化促进骨质疏松进展的机制研究

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Deptor调控骨髓间充质干细胞分化促进骨质疏松进展的机制研究

作者：康大为南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景骨质疏松(osteoporosis)是绝经后妇女和老年人群最严重的骨骼疾病之一。在其发病过程中,骨形成与骨吸收平衡被打破,骨骼的密度降低,从而易发生骨质疏松。骨质疏松患者的骨组织常出现大量脂肪细胞蓄积。之前的研究发现deptor能... 详细信息

研究背景骨质疏松(osteoporosis)是绝经后妇女和老年人群最严重的骨骼疾病之一。在其发病过程中,骨形成与骨吸收平衡被打破,骨骼的密度降低,从而易发生骨质疏松。骨质疏松患者的骨组织常出现大量脂肪细胞蓄积。之前的研究发现deptor能促进骨髓间充质干细胞成脂分化,抑制成骨分化,但是deptor如何调控体内间充质干细胞成骨成脂分化平衡的作用尚不清楚。目的探究deptor对间充质干细胞成骨分化及成脂分化的作用及其具体机制,旨在阐明BMSCs成骨分化及成脂分化之间平衡的作用机制,为骨质疏松的药物开发和治疗提供新的潜在理论基础。方法利用C57BL/6小鼠构建去卵巢(ovariectomized,OVX)骨质疏松模型,Micro-CT、H&E染色观察假手术组(Sham组)和OVX组骨髓腔骨质与脂肪形成情况。利用Osterix(OSX)特异性敲除deptor的转基因小鼠,构建去卵巢(ovariectomized,OVX)骨质疏松模型,应用Micro-CT、H&E染色、免疫组化、钙黄绿素荧光双标等试验,探究deptor敲除对绝经后骨质疏松骨髓腔骨组织和脂肪组织的影响。体外实验,利用大鼠骨髓间充质干细胞,成骨成脂诱导,qPCR、Western blot检测deptor变化情况。提取C57BL/6 OVX与Sham小鼠BMSCs,成骨成脂诱导,探究骨质疏松时BMSCs成骨成脂分化能力变化。BMSCs转染DEOTOR干扰质粒、deptor过表达质粒,成骨成脂诱导,qPCR、Western blot、荧光素报告酶检测deptor对成骨成脂能力的影响。使用蛋白质组学筛查deptor相互作用蛋白TAZ,免疫共沉淀(CO-IP)进行验证。PDZ质粒、DEP质粒、全长deptor质粒分别与全长TAZ质粒和缺乏PDZ结合模体TAZ质粒共转染HEK293T细胞,CO-IP验证deptor与TAZ的结合位点。分别转染与deptor质粒、TAZ-GST+deptor过表达质粒,成骨、成脂诱导3天,qPCR、Western blot、ALP染色、油红O染色检测TZA增加是否逆转deptor抑制BMSCs成骨分化,促进成脂分化的作用。结果:C57BL/6小鼠OVX小鼠骨量减少,骨髓脂肪细胞增加。deptor成骨细胞特异性敲除去卵巢造模后,骨量明显增加,骨髓腔脂肪细胞形成减少。BMSCs成骨诱导deptor表达降低,成脂诱导deptor表达升高;OVX小鼠BMSCs成骨分化能力下降,成脂分化能力增加;deptor过表达抑制BMSCs成骨分化能力,促进向成脂方向分化;deptor不能直接结合Runx2、PPARγ调节BMSCs分化。TAZ通过其自身PDZ结合模体(PDZ binding motif)直接与deptor PDZ结构域(PDZ domain)结合;deptor通过抑制TAZ的转录活性,促进PPARγ转录活性,抑制Runx2转录活性。结论:***在BMSCs成骨分化过程中下调,成脂分化过程中上调。***小鼠BMSCs deptor表达增多。***成骨细胞特异性敲除能明显改善绝经后骨质疏松骨量丢失和脂肪细胞堆积。***抑制BMSCs成骨分化能力,成脂分化能力增加。***抑制Runx2转录活性,增加PPARy转录活性。*** PDZ domain直接结合TAZ。***通过抑制TAZ转录活性,发挥调控BMSCs成骨成脂分化的作用。

关键词：骨质疏松 deptor TAZ 骨髓间充质干细胞分化

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deptor在乳腺癌中的表达及其临床意义

DEPTOR在乳腺癌中的表达及其临床意义

作者：黄丽娓中南大学

学位级别：硕士

研究目的本实验主要研究deptor在乳腺癌组织中的表达,以及deptor的表达水平与乳腺癌的临床病理特征及生物学检测指标的关系,旨在为乳腺癌临床治疗提供新思路。研究方法选择中南大学湘雅二医院乳甲外科2010年乳腺癌患者80例,乳腺组织增... 详细信息

研究目的本实验主要研究deptor在乳腺癌组织中的表达,以及deptor的表达水平与乳腺癌的临床病理特征及生物学检测指标的关系,旨在为乳腺癌临床治疗提供新思路。研究方法选择中南大学湘雅二医院乳甲外科2010年乳腺癌患者80例,乳腺组织增生症患者40例,均为女性。将乳腺癌组织80例作为实验组;乳腺组织增生症组织40例作为对照组。通过免疫组织化学法,检测乳腺癌组织及乳腺组织增生症组织中deptor蛋白的表达情况以及乳腺癌组织中ER、PR表达情况,采用免疫组织化学法和荧光原位杂交法(FISH)检测乳腺癌组织中HER-2的表达情况,并分析deptor的表达水平与乳腺癌的临床病理特征及生物学检测指标的相关性。研究结果在乳腺癌组织中,deptor蛋白阳性表达率为87.5%(70/80);在乳腺组织增生症组织中的阳性率为15.0%(6/40)。乳腺癌组织的deptor蛋白阳性表达率明显高于乳腺组织增生症组织(Pdeptor的H-score(39.25),乳腺癌组织deptor的H-score(224.60)显著升高(Pdeptor蛋白的表达情况与乳腺癌的临床病理特征的相关性分析,我们发现deptor蛋白的表达情况与淋巴结转移水平显著相关(P0.05)。通过进一步研究发现deptor蛋白的表达与乳腺癌生物学检测指标ER、PR、HER-2的表达水平无明显相关性(P>0.05)。研究结论1、deptor蛋白在乳腺癌中过表达。2、乳腺癌中deptor蛋白表达水平与淋巴结转移情况相关。3、乳腺癌中deptor蛋白表达水平与患者年龄、肿瘤大小、乳腺癌病理类型、以及ER、PR、HER-2的表达情况无关。

关键词：乳腺癌 deptor 免疫组化

条件性胰岛β细胞deptor基因敲除小鼠构建及鉴定

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实用医学杂志 2018年第4期34卷 552-555页

作者：赖舒畅邱鸿王肖潘道延王桢钰李凯白晓春沈洁南方医科大学第三附属医院内分泌科广州510515 广州中医药大学经济与管理学院广州510515 南方医科大学第三附属医院医学实验研究中心广州510515

目的构建并鉴定条件性胰岛β细胞deptor基因敲除小鼠,为研究deptor基因在糖尿病发生机制的研究提供动物模型。方法将引进的条件性胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶小鼠与deptor^(loxp/loxp)小鼠进行杂交繁殖,并对子代进行基因型鉴定,获得... 详细信息

目的构建并鉴定条件性胰岛β细胞deptor基因敲除小鼠,为研究deptor基因在糖尿病发生机制的研究提供动物模型。方法将引进的条件性胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶小鼠与deptor^(loxp/loxp)小鼠进行杂交繁殖,并对子代进行基因型鉴定,获得基因型为deptor^(loxp/-)Cre^(+/-)的小鼠;再让deptor^(loxp/-)Cre^(+/-)的小鼠与deptor^(loxp/loxp)小鼠杂交获得deptor^(loxp/loxp)Cre^(+/-)小鼠;基因型为deptor^(loxp/loxp)Cre^(+/-)的小鼠即为本实验所需要构建模型小鼠。3周龄时通过PCR法鉴定小鼠的基因型;8周龄时腹腔注射他莫昔芬诱导Cre重组酶表达后,免疫荧光验证deptor基因敲除效果。结果从引进这两种小鼠开始繁殖10个月,共获得基因型为deptor^(loxp/loxp)Cre^(+/-)的小鼠10只,PCR结果证实小鼠的基因型符合deptor^(loxp/loxp)Cre^(+/-)。免疫荧光结果提示敲除效果明显。结论利用Cre/loxp系统,本研究成功构建并鉴定了条件性胰岛β细胞deptor基因敲除小鼠,为在动物水平研究deptor基因在糖尿病发病机制中的作用提供研究平台。

关键词： deptor Cre/loxp系统胰岛β细胞

沉默deptor基因对胰岛β细胞功能影响以及调控机制的研究

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沉默DEPTOR基因对胰岛β细胞功能影响以及调控机制的研究

作者：邱鸿南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景糖尿病是由于胰岛素分泌缺乏和(或)胰岛素作用障碍而引起慢性血葡萄糖水平升高为特征的代谢性疾病,目前由于缺乏针对病因的治疗,其治疗效果存在一定局限。因此进一步明确胰岛素分泌的机制与寻求更好的糖尿病治疗方法一直是医学... 详细信息

研究背景糖尿病是由于胰岛素分泌缺乏和(或)胰岛素作用障碍而引起慢性血葡萄糖水平升高为特征的代谢性疾病,目前由于缺乏针对病因的治疗,其治疗效果存在一定局限。因此进一步明确胰岛素分泌的机制与寻求更好的糖尿病治疗方法一直是医学研究热点。deptor即包含DEP域的与哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)相互作用的蛋白,在不同的细胞中功能有所不同。在骨骼肌细胞中通过deptor激活非胰岛素依赖性AKT通道,维持餐后血糖的稳态;在脑组织中,deptor蛋白过表达可以激活Akt/PKB信号通路从而阻断高脂饮食诱导的小鼠肥胖症。另一方面,已有研究证实mTOR复合物是调控胰岛β细胞质量与功能的关键蛋白,deptor是复合物中的共有组分,deptor的丢失是否会影响胰岛β细胞的增殖及胰岛素分泌功能,目前国内外尚缺乏相关研究。研究目的利用糖尿病小鼠模型明确deptor在胰岛内的表达情况,并观察是否与糖尿病存在相关性;利用RNA干扰技术(RNAi),研究体外合成的sideptor分子对胰岛β细胞株NIT-1细胞deptor基因沉默作用,并观察沉默deptor基因对NIT-1细胞胰岛素分泌的影响及细胞增殖活力改变。研究方法引入糖尿病db/db小鼠模型,免疫组化及免疫荧光双标法明确deptor蛋白在胰岛细胞内的表达情况,并比较糖尿病小鼠与正常小鼠deptor蛋白的差异表达;公司设计合成一对阴性siRNA对照、一对阴性带绿色荧光膜结合蛋白(FAM)荧光对照、一对阳性对照siRNA序列及3对(sideptor 385组及sideptor 766 组、sideptor 1275 组)针对 deptor 基因的 siRNA 序列,利用脂质体法将siRNA转染至NIT-1细胞,6h后荧光显微镜下观察各组转染效率;qPCR检测转染48h后deptor mRNA相对表达量;ELISA胰岛素试剂盒检测转染后48h细胞上清液胰岛素释放量;CCK8法检测转染48h后细胞增殖活力改变;Western blot检测转染48h后deptor及下游相关蛋白S6、4EBP-1、AKT及其活性形式p-S6、p-4EBP-1、p-AKT的表达情况。研究结果***基因与糖尿病存在相关性:免疫组化显示正常小鼠胰岛中胰岛存在deptor蛋白的表达,并且糖尿病小鼠胰岛内deptor蛋白表达较正常小鼠明显增多;deptor/INSULIN免疫荧光双标染色进一步证实糖尿病小鼠胰岛β细胞内deptor蛋白较正常小鼠明显增多;2.在荧光显微镜下观察,siRNA能有效转入到NIT-1细胞内,呈绿色点状荧光;***检测干扰后deptor mRNA的相对表达量,发现设计合成3对siRNA序列中有两对siRNA序列(sideptor 385组及sideptor 766组)对deptor基因有干扰效果,转染后能显著抑制靶基因deptor mRNA的表达,干扰效果与阴性对照差异有统计学意义;***检测细胞胰岛素释放量,有效转染sideptor 766组的胰岛素分泌量显著高于阴性对照转染组及空白转染组;***8法检测细胞增殖活力,在前60min,有效转染sideptor 766组的细胞生长趋势与阴性对照组相似(有效转染组稍低于阴性对照组,无统计学意义),随着时间延迟(90min-120min),有效转染sideptor766组细胞的增殖活力显著高于阴性对照组及空白转染组;***-blot检测结果,有效RNA干扰组p-S6及p-4EBP-1蛋白的表达量较阴性对照转染组均显著增多,p-AKT蛋白的表达量较阴性对照转染组稍有下降。研究结论本实验发现糖尿病小鼠胰岛β细胞内deptor蛋白较正常小鼠明显增多,证明了 deptor基因与糖尿病存在相关性;并利用RNAi技术在NIT-1细胞上有效地沉默deptor基因的表达,促进了细胞增殖和胰岛素的分泌,并验证该现象与mTORCl信号通路的激活有关。

关键词： RNA干扰 siRNA deptor 胰岛β细胞胰岛素糖尿病