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基于miR30的靶向dcr_3慢病毒干扰载体的构建及鉴定

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重庆医学 2009年第12期38卷 1477-1479,I0002页

作者：熊刚许雪青陈雪丹郭洪李娟王凯蒋耀光第三军医大学西南医院胸心外科重庆400038 第三军医大学基础医学部医学遗传教研室重庆400038 大坪医院野战外科研究所全军胸外科中心重庆400042

目的构建基于miR30的靶向dcr3慢病毒干扰载体。方法人工设计针对dcr3编码区的干扰序列,使其转录后RNA结构类似于miR30结构,茎杆序列替换成dcr3序列,送上海生物工程技术服务有限公司合成。以该序列为模板,分别利用携带EcoRⅠ和XhoⅠ酶切... 详细信息

目的构建基于miR30的靶向dcr3慢病毒干扰载体。方法人工设计针对dcr3编码区的干扰序列,使其转录后RNA结构类似于miR30结构,茎杆序列替换成dcr3序列,送上海生物工程技术服务有限公司合成。以该序列为模板,分别利用携带EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物行PCR扩增,通过酶切连接的方式将插入片段连入p201慢病毒载体骨架中。经酶切和测序鉴定后,用包装质粒pMD2G及包膜质粒psAX2共同转染293FT细胞进行病毒包装。病毒包装上清液加入培养的人食管鳞癌细胞系KYSE150细胞中,用FACS分选后进行RT-PCR和Western blot检测dcr3表达情况。结果构建了针对dcr3的3条慢病毒干扰载体,成功包装出病毒,并不同程度地抑制了dcr3蛋白的表达。结论基于miR-30的dcr3能有效抑制dcr3表达,为进一步研究dcr3功能打下了基础。

关键词： dcr3 RNA干扰慢病毒

特发性肺间质纤维化病人外周血单核细胞中dcr_3基因表达的意义

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中国老年学杂志 2004年第12期24卷 1129-1131页

作者：王秀丽尹金植黄志卫马忠森吉林大学第二临床学院血液科吉林长春130041 吉林大学第二临床学院呼吸科吉林长春130041 北海市结核病防治院

目的　探讨外周血单核细胞 (PBMC)中dcr3基因表达水平与特发性肺间质纤维化 (IPF)的关系。方法　 1 4名IPF病人和 1 0名健康对照各取 5ml静脉血 ,肝素抗凝 ,密度梯度离心法分离PBMC ,异硫氰酸胍酚 /氯仿法提取PBMC总RNA ,用半定量RT PC... 详细信息

目的　探讨外周血单核细胞 (PBMC)中dcr3基因表达水平与特发性肺间质纤维化 (IPF)的关系。方法　 1 4名IPF病人和 1 0名健康对照各取 5ml静脉血 ,肝素抗凝 ,密度梯度离心法分离PBMC ,异硫氰酸胍酚 /氯仿法提取PBMC总RNA ,用半定量RT PCR法检测PBMC中dcr3基因的相对表达水平 ,并用t检验进行比较。结果　IPF病人组PBMC中dcr3基因的相对表达水平为 0 375± 0 0 88,与正常对照组 (0 2 59±0 0 84)相比有明显差异 (P dcr3基因的表达水平增高。

关键词： dcr3 基因表达特发性肺间质纤维化外周血单核细胞

Survivin和dcr3在胃癌组织中的表达及意义

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广东医学 2010年第9期31卷 1157-1158页

作者：章克毅吴智勇张仕义沈金辉广东省汕头市中心医院肿瘤外科 515031 广东省汕头市中心医院病理科 515031

目的探讨Survivin、dcr3在胃癌中的表达及临床意义,以及两者表达的关系。方法采用免疫组织化学法检测60例胃癌和30例胃炎组织Survivin和dcr3的表达。结果 Survivin在60例胃癌和30例胃炎的阳性表达率分别为61.7%和6.6%,胃癌中Survivin的... 详细信息

目的探讨Survivin、dcr3在胃癌中的表达及临床意义,以及两者表达的关系。方法采用免疫组织化学法检测60例胃癌和30例胃炎组织Survivin和dcr3的表达。结果 Survivin在60例胃癌和30例胃炎的阳性表达率分别为61.7%和6.6%,胃癌中Survivin的阳性表达率明显高于胃炎组织(Pdcr3在60例胃癌和30例胃炎的阳性表达率分别为53.3%和3.3%,胃癌中dcr3的阳性表达率明显高于胃炎组织(Pdcr3在T3、T4及有淋巴结转移的胃癌中的阳性表达率显著高于T1、T2及无淋巴结转移的胃癌(Pdcr3在胃癌中的表达呈正相关(2=4.389,Pdcr3两者与胃癌的病理分期密切相关,术前联合检测胃癌患者Survivin及dcr3的表达对其分期诊断有一定价值。

关键词： Survivin dcr3 胃癌免疫组织化学法

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血清dcr3水平与胃癌的关系

中国老年学杂志 2011年第24期31卷 4949-4950页

作者：林尤恩刘祖宏陈尤佳郑赵利揭阳市人民医院化疗介入科广东揭阳522000 揭阳市人民医院病理科揭阳市人民医院检验科

诱捕受体3（decoyreceptor3,dcr3）是最近研究发现的一类肿瘤坏死因子受体（TNFR）,某些蛋白配体与dcr3特异性结合后,导致配体不能够与死亡受体结合,促使肿瘤细胞不能诱导凋亡〔1〕。研究发现,人类多种恶性肿瘤与dcr3蛋白的表达有关。关... 详细信息

诱捕受体3（decoyreceptor3,dcr3）是最近研究发现的一类肿瘤坏死因子受体（TNFR）,某些蛋白配体与dcr3特异性结合后,导致配体不能够与死亡受体结合,促使肿瘤细胞不能诱导凋亡〔1〕。研究发现,人类多种恶性肿瘤与dcr3蛋白的表达有关。关于dcr3在胃癌的表达,

关键词：胃癌 dcr3 临床意义

Survivin、dcr3在胃癌中的表达及其临床意义

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Survivin、DcR3在胃癌中的表达及其临床意义

作者：苗兰英辽宁医学院

学位级别：硕士

目的检测人体胃癌组织中Survivin、dcr3分别在蛋白和基因水平的表达情况，从而探讨二者在胃癌发生、发展过程中的作用。方法选择50例胃癌组织和相应的50例癌旁正常组织，采用免疫组织化学法及RT-PCR法检测组织中Survivin、dcr3分别... 详细信息

目的检测人体胃癌组织中Survivin、dcr3分别在蛋白和基因水平的表达情况，从而探讨二者在胃癌发生、发展过程中的作用。方法选择50例胃癌组织和相应的50例癌旁正常组织，采用免疫组织化学法及RT-PCR法检测组织中Survivin、dcr3分别在蛋白和基因水平的表达情况，并进行相关的研究。结果（1）Survivin蛋白的阳性表达主要定位于胞浆和胞核，胃癌中阳性表达率为68.0%，正常组织的阳性表达率为2.0%，两组间差异有显著统计学意义(Pdcr3蛋白的阳性主要表达于胞浆和胞膜，胃癌中阳性表达率为72.0%，正常组织的阳性表达率为6.0%，两组间差异具有显著统计学意义（Pdcr3mRNA在胃癌组的表达水平（0.658±0.072）显著高于正常胃粘膜组（0.153±0.069），差异具有统计学意义（P3）在蛋白和mRNA两个水平上，Survivin、dcr3的表达量均与胃癌的浸润深度、组织分化、淋巴结转移、TNM分期有关（P0.05）。采用Spearman相关检验分析显示，两因子的表达量呈正相关关系（Pdcr3因子的高表达状态呈正相关关系，并与胃癌的组织分化、淋巴转移、TNM分期密切相关，提示二者在胃癌的发生、发展和侵润转移过程中可能存在一定的协调促进作用;（2）Survivin和dcr3各自都可作为胃癌的生物学行为和临床预后的判断指标，二者联合检测精准度更高。

关键词： Survivin dcr3 胃癌免疫组化 RT-PCR

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肝细胞癌患者血清dcr3水平与临床意义

肝细胞癌患者血清DcR3水平与临床意义

作者：杨梅松竹广西医科大学

学位级别：硕士

研究背景诱捕受体3(decoy receptor 3, dcr3)是肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)超家族的新成员,可以和某些蛋白配体特异性结合,竞争性抑制配体与死亡受体的结合,阻断Fas,LTβR,DR3等TNFR家族成员诱导产生的细... 详细信息

研究背景诱捕受体3(decoy receptor 3, dcr3)是肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)超家族的新成员,可以和某些蛋白配体特异性结合,竞争性抑制配体与死亡受体的结合,阻断Fas,LTβR,DR3等TNFR家族成员诱导产生的细胞凋亡,在多种恶性肿瘤中呈高表达[1-11]。由于缺乏明显的跨膜序列,dcr3是一种分泌性蛋白,一些恶性肿瘤患者血清dcr3升高[2]。本课题组以前研究结果显示[12-17],肝细胞癌(hapatocellular carcinoma, HCC)组织及HCC细胞系存在dcr3 mRNA和蛋白的过表达,并且可影响肿瘤细胞凋亡。为了进一步探讨dcr3的临床血清检测应用价值,本课题拟通过检测HCC、其他疾病以及正常人血清dcr3水平,分析血清dcr3水平与HCC患者临床病理参数的关系,探讨dcr3与甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)联合检测对HCC的诊断效率。材料与方法1.收集患者术前血清标本共165例,其中HCC 67例,胃癌34例、乳腺癌39例、肝硬化8例、胆囊炎17例。另收集28例正常人血清作为对照组。2.采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA)检测血清dcr3水平,分析血清水平与HCC临床病理参数的关系。3.采用化学发光法检测HCC、非癌肝脏疾病(包括肝硬化和胆囊炎)患者、正常人血清AFP水平,分析联合检测AFP与dcr3对HCC的诊断价值。4.收集与血清标本对应的HCC患者术后切除组织蜡块共64例,采用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)检测HCC组织中dcr3蛋白的表达,分析dcr3血清水平与组织表达相关性,比较检测率。结果1.各组血清dcr3水平分别为:HCC 197.07±90.34pg/ml,阳性率76.12%(51/67);胃癌194.87±98.38pg/ml,阳性率73.53%(25/34);乳腺癌130.64±51.76pg/ml,阳性率41.03%(16/39);肝硬化179.81±102.74pg/ml,阳性率62.50%(5/8);胆囊炎101.59±24.51pg/ml,阳性率17.65%(3/17);正常人96.69±16.05pg/ml,阳性率3.57%(1/28)。HCC、胃癌、乳腺癌患者血清dcr3水平均明显高于正常人(P0.05),但HCC和胃癌均明显高于乳腺癌患者(Pdcr3水平均明显高于正常人、胆囊炎患者(P0.05)。2. HCC血清dcr3水平与性别(P0.05)。3. AFP和dcr3联合检测的灵敏性可由单项检测的82.09%和76.12%提高到92.54%,特异度和阳性预测值有所下降,但阴性预测值、Youden指数、粗符合率均有所上升。4. HCC患者dcr3血清水平与组织蛋白表达呈正相关(rs=0.472, Pdcr3血清阳性率为76.56%(49/64),组织表达阳性率为62.50%(40/64),血清ELISA检测阳性率明显高于组织IHC检测(Pdcr3水平较正常明显升高,并与肿瘤的发生发展、浸润转移有关,血清dcr3水平高者易出现浸润转移,预后差。联合检测AFP和dcr3能有效提高对HCC的诊断效率。通过监测高危人群以及HCC患者血清dcr3水平,可能对HCC的筛查、诊断和判断预后有重要意义。

关键词： dcr3 肝细胞癌 ELISA 诊断血清

SNP rs2257440影响食管癌细胞dcr3基因表达的机制研究

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SNP rs2257440影响食管癌细胞DcR3基因表达的机制研究

作者：傅莉媛第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景：食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是一种恶性消化道肿瘤，尤其在我国十分常见，其发病率及死亡率都呈逐年升高的趋势。其预后差，5年生存率仅有20%左右，为高致死性疾病。因此研究其发病机制，... 详细信息

研究背景：食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是一种恶性消化道肿瘤，尤其在我国十分常见，其发病率及死亡率都呈逐年升高的趋势。其预后差，5年生存率仅有20%左右，为高致死性疾病。因此研究其发病机制，寻找新的早期诊断及治疗的靶点具有十分重要的意义。 dcr3（Decoy receptor3，诱骗受体3）又称为TNFRSF6B（Tumour necrosis factorreceptor super family member6B，肿瘤坏死因子受体超家族成员6B）。该超家族成员通常能促进机体杀伤并清除肿瘤细胞，例如Fas与其配体FasL（TNFSF6）相互作用介导凋亡为体内最常见的凋亡介导模式之一，在机体的免疫监视及肿瘤自身的清除中起着重要作用。与家族里其他分子不同，dcr3并不促进肿瘤的清除，反而拮抗其他分子诱导的细胞凋亡。其原因是dcr3缺乏跨膜区和膜内信号功能区，属分泌蛋白，可以竞争性结合肿瘤坏死因子，但不能向瘤细胞内部传递凋亡诱导信号[1]。这种现象被认为是肿瘤诱骗（decoy）免疫杀伤细胞而逃脱机体免疫监视的重要机制。迄今，至少已发现有3种与肿瘤凋亡相关的重要配体分子FasL，LIGHT和TL1A介导的细胞死亡受到dcr3的拮抗。抑制dcr3的表达可明显促进上述分子对肿瘤细胞的凋亡效应，而诱导dcr3的表达则可以抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤的存活[2][3][4]。多个临床研究发现，正常组织不表达或低表达dcr3，而肿瘤组织高表达dcr3，其高表达程度与肿瘤的发生发展密切相关[5][6][7]。在前期实验中我们检测分析了dcr3表达水平与ESCC发病率的相关性。结果发现，ESCC患者肿瘤组织dcr3表达丰度显著高于正常对照组织，并且dcr3的高表达与ESCC的侵袭和转移相关，提示dcr3的表达增高可能是ESCC发生发展的重要原因之一[8]。进一步，我们进行了dcr3调控区域内SNP多态性与ESCC发病率的关联研究，结果显示，位于dcr3第一外显子区域的SNP rs2257440与ESCC患病率显著相关，提示rs2257440多态性可能通过调控dcr3表达进而影响ESCC患病风险[9]。综合上述关联性研究结果，我们推测：SNP rs2257440为功能性SNP，即rs2257440不同等位基因可能通过影响dcr3基因的表达，最终参与了ESCC的发生发展。为深入阐明SNP rs2257440多态性影响dcr3基因表达的分子机制，我们对SNPrs2257440位点所在区域进行了生物信息学分析。rs2257440位于dcr3第一外显子区域，而基因的调控元件并不仅仅局限于启动子区，在内含子、第一外显子、3’UTR等区域都可能存在影响基因表达的调控元件。已有文献报道，这些区域内的SNP位点可通过与转录因子的结合参与基因的转录调控[10][11][12]。因此，我们利用TESS（Transcription Element Search System）对rs2257440所在DNA序列进行转录因子结合位点的预测，发现其处在金属反应转录因子1（Metal-responsive transcription factor-1，MTF-1）的结合位点上。因此我们推测转录因子MTF-1可能与rs2257440所在DNA序列相互作用而影响dcr3的表达，进而影响ESCC对抗机体的凋亡诱导而逃避免疫杀伤的能力。研究目的：因此，本课题的研究目的旨在探讨rs2257440位点对dcr3基因表达的等位特异性顺式调控作用及其机制。为此，本课题首先构建了含有rs2257440不同等位基因（C/T）的报告基因质粒以及转录因子MTF-1真核表达载体，通过荧光素酶报告基因试验，以明确rs2257440是否为功能性SNP，MTF-1是否与rs2257440位点不同等位基因相互作用而影响基因的表达。进一步转染MTF-1真核表达载体到rs2257440等位基因型不同的食管癌细胞中，检测细胞中dcr3分子的mRNA和蛋白质表达量，以明确MTF-1是否能在细胞水平促进dcr3的表达，且具有等位基因特异性。最后转染MTF-1真核表达载体到rs2257440不同等位基因型食管癌细胞中，以明确过表达MTF-1是否会对rs2257440不同等位基因型食管癌细胞的生物学行为产生差异性影响。方法：第一部分：MTF-1与SNPrs2257440不同等位基因相互作用影响dcr3基因的表达 1.构建报告基因质粒：测定教研室现有的食管癌细胞株中rs2257440位点的等位基因型，以该位点为杂合子的细胞株基因组DNA为模板，通过PCR扩增出含有rs2257440不同等位基因（C/T）的DNA片段并构建到质粒PGL3-Basic上，分别命名为PGL3-440BC和PGL3-440BT。 2.构建MTF-1真核表达载体：以

关键词：食管癌 dcr3 SNP MTF-1

苦参碱对肝癌细胞NF-κB、p53、dcr3 mRNA表达的影响

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苦参碱对肝癌细胞NF-κB、p53、DcR3 mRNA表达的影响

作者：李权林川北医学院

学位级别：硕士

目的:检测苦参碱作用下,肝癌细胞HepG2中NF-κB(p65/RelA)、p53、诱骗受体3(decoy receptor3, dcr3/TR6)mRNA的表达水平,探讨苦参碱对肝癌细胞HepG2可能的作用机制,以及上述细胞因子间的相互影响。方法:培养肝癌细胞株HepG2。根据刺激... 详细信息

目的:检测苦参碱作用下,肝癌细胞HepG2中NF-κB(p65/RelA)、p53、诱骗受体3(decoy receptor3, dcr3/TR6)mRNA的表达水平,探讨苦参碱对肝癌细胞HepG2可能的作用机制,以及上述细胞因子间的相互影响。方法:培养肝癌细胞株HepG2。根据刺激肝癌细胞的苦参碱浓度梯度(0g/L, 0.25g/L, 0.5g/L, 1.0g/L, 1.5g/L)将培养的肝癌细胞株分为5个组,以LY294002(PI3K/Akt信号通路广谱抑制剂)刺激的肝癌细胞作为阳性对照组,另设一个阴性对照组。MTT法分别检测上述6个组细胞培养12、24、36、48小时的抑制率。用Hoechst染色观察培养12小时后各组细胞凋亡形态学改变。实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测各组细胞NF-κB、p53、dcr3 mRNA的表达水平。结果:苦参碱诱导肝癌细胞凋亡呈时间和剂量依赖性。苦参碱终浓度1.5g/L的培养液培养12小时即可引起肝癌细胞明显凋亡。NF-κB mRNA的表达随苦参碱浓度的增加而增加(P=0.017),p53 mRNA的表达随苦参碱浓度的增加而降低(P=0.007), NF-κB和p53 mRNA的表达呈负相关,而dcr3 mRNA的表达不受苦参碱浓度的影响。LY294002处理后的肝癌细胞,NF-κB、p53、dcr3 mRNA的表达均较对照组明显增高(P<0.001)。结论:苦参碱诱导肝癌细胞凋亡的过程中活化了NF-κB,这可能是肝癌细胞对苦参碱早期耐药的机制之一。苦参碱对NF-κB的作用可能受细胞类型的影响。

关键词：苦参碱肝癌细胞 NF-κB p53 dcr3

应用组织芯片技术研究胰腺癌中dcr3蛋白的表达及其临床意义

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应用组织芯片技术研究胰腺癌中DcR3蛋白的表达及其临床意义

作者：赵新吉林大学

学位级别：硕士

诱捕受体(decoy receptor3, dcr3)是20世纪末发现的一种新的肿瘤坏死因子受体。dcr3在肺癌、胃肠道恶性肿瘤、脑恶性胶质瘤、乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中表达水平较高,其基因的扩增与过度表达，与肿瘤的发生、发展与免疫逃逸机制密切... 详细信息

诱捕受体(decoy receptor3, dcr3)是20世纪末发现的一种新的肿瘤坏死因子受体。dcr3在肺癌、胃肠道恶性肿瘤、脑恶性胶质瘤、乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中表达水平较高,其基因的扩增与过度表达，与肿瘤的发生、发展与免疫逃逸机制密切相关。目前对胰腺癌的研究多集中在死亡受体DR4、DR5和诱骗受体dcr1、dcr2，但是dcr3方面的研究较少。随着siRNA（small interfering RNA）干扰技术、反义RNA技术及dcr3单克隆抗体技术及肿瘤疫苗技术的应用，dcr3为在肿瘤发生、基因诊断、靶向治疗提供了一种新的思路。目的：本实验利用组织芯片技术，选取与恶性肿瘤发生、发展、转移关系密切的诱骗受体dcr3蛋白为研究对象，通过组织芯片及免疫组化方法，检测dcr3在胰腺癌组织中的表达水平，统计分析dcr3在胰腺癌中表达的意义，为胰腺癌的治疗、预后判断提供新的线索及思路。方法： 1.收集2009年1月至2012年12月间我院收治的40例胰腺癌组织，及癌旁组织15例，正常组织15例，及北医三院、西安交大附属医院胰腺癌病例各35例、25例，构建胰腺癌组织微阵列，共计130例组织。应用免疫组织化学方法(Envision法)检测dcr3蛋白的表达水平。 2.统计分析dcr3蛋白表达水平在胰腺癌患者年龄、性别、组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移分组中的差异。结果：胰腺癌组织中的dcr3蛋白的阳性率86.00%(86/100)明显高于癌旁46.6%(7/15，p=0.00)及正常组织13.3%(2/15，p=0.00);临床TNM分期中，Ⅲ期dcr3阳性率100%(35/35)明显高于Ⅱ期阳性率87%（36/41，p=0.033）及Ⅰ期阳性率62.5%（15/24，p=0.00）;有淋巴结转移者dcr3阳性率93.4%(43/46)明显高于无淋巴结转移组79.6%(43/54, p=0.047)。在低分化胰腺癌组织中，dcr3蛋白的阳性率为100%（31/31）要高于高分化组64%（16/25，p=0.00）与中分化组88.6%（39/44，p=0.052），分化组间存在差异，p=0.00;肿瘤直径大于4cm者（阳性率83.1%）与小于4cm者无明显差别（78.6%，P=1）;dcr3表达与年龄、性别无关。结论： 1．胰腺癌组织中存在dcr3基因的高表达，且明显高于癌旁及正常组织。癌旁组织中dcr3蛋白阳性率明显高于正常组织。从正常组织、癌旁组织到胰腺癌组织，dcr3蛋白的表达水平是逐步升高。 2．dcr3蛋白表达水平与肿瘤的临床分期、组织分化程度及淋巴结转移情况密切相关，与肿瘤直径大小、年龄、性别无关。 3．组织芯片技术可高通量、高效检测临床组织样本，具有快速、经济、省时、省力的特点。

关键词： dcr3 胰腺癌组织芯片免疫组化