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Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode,Bursaphelenchus xylophilus

Journal of Forestry Research 2022年第2期33卷 689-698页

作者： Jinghan Wang Huan Hong Rong Xie Jingjing Ji Kai Guo Liqun Bai Jia Tang Hongshi Yu Jianren Ye Jiafu Hu Nanjing Forestry University Nanjing 210037China Zhejiang Agricultural and Forestry University Hangzhou 311300China Yuhuan Natural Resources and Planning Bureau Taizhou 317600China School of BioSciences The University of MelbourneParkvilleVIC 3010Australia

Bursaphelenchus xylophilus,causal agent of pine wilt disease,causes extensive damage ***-gies are needed to inhibit population growth or block the spread of the invasive nematode to control pine wilt *** gene daf-8 plays crucial roles in larval develop-ment and dauer formation in Caenorhabditis elegans,but little is known about its orthologue in *** the present molecular characterization and functional analysis of daf-8 in ***(Bx-daf-8),RT-qPCR showed that the expression of Bx-daf-8 gradually increased during the embryonic stage,peaked in the second-stage juvenile(J2),then dramatically dropped in the J3,and remained at that low level for the rest of its ***-daf-8-transgenic *** was employed to mimic the spatiotemporal expression of Bx-daf-8,which was expressed close to the pharynx during early embryogenesis and weakly throughout the whole body during late *** was observed in head neurons and tail ganglions throughout all postembryonic *** embryos were severely abnormal,and hatching rate decreased sharply after Bx-daf-8 ***-16-1 and da-f16-2,downstream genes in the IIS pathway,also dropped sharply after Bx-daf-8 *** propose that TGFβmay crosstalk with the IIS pathway upstream of Bx-daf-16 and that daf-8 may act as a master regulator of daf-16 in ***,knockdown of Bx-daf-8 did not lead to constitutive developmental arrest at the dauer larval stage,indicating that dauer entry in *** might be controlled by several genes and is more complicated than in ***-daf-8 alone did not control the dauer entry in ***,but it was indispensable for embryogen-esis,providing a potential target for suppressing population growth of ***.

关键词： daf-8 Expression pattern RNAi Embryogenesis Bursaphelenchus xylophilus

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松材线虫dauer形成相关基因akt-1和daf/-8表达调控研究

松材线虫dauer形成相关基因akt-1和daf/-8表达调控研究

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作者：季晶晶浙江农林大学

学位级别：硕士

松材线虫在环境不利条件下形成dauer型幼虫,这种dauer型幼虫能够感受传媒昆虫——松墨天牛蛹的存在,向其蛹室聚集并附着在天牛体内,当松墨天牛蛹羽化为成虫之后,松材线虫便借助天牛的飞行移动实现寄主转移,从而引起病害的传播和流行。目... 详细信息

松材线虫在环境不利条件下形成dauer型幼虫,这种dauer型幼虫能够感受传媒昆虫——松墨天牛蛹的存在,向其蛹室聚集并附着在天牛体内,当松墨天牛蛹羽化为成虫之后,松材线虫便借助天牛的飞行移动实现寄主转移,从而引起病害的传播和流行。目前,科学界对松材线虫dauer型幼虫的形成机制尚不清楚,这也为阻止松材线虫dauer型幼虫形成和切断病害流行等特异性的防控技术设置了障碍。因此,本文选择了两个与松材线虫dauer型幼虫形成相关的基因akt-1和daf-8,采用实时定量PCR(q PCR)、原位杂交(in situ hybridization)和显微注射(microinjection)等现代分子技术,系统研究其时空表达特性,并采用RNA干扰(RNAi)技术研究这两个基因在松材线虫dauer型幼虫形成过程中的调控功能,以期为揭示松材线虫Dauer型幼虫的形成机理提供基础。具体研究结果如下:1.q PCR分析结果显示,akt-1和daf-8基因的表达变化具有高度的一致性,即从胚胎到L2表达量显著增加,L2时的表达量最高,随后逐步下降。这表明akt-1和daf-8基因可能在松材线虫dauer形成之前的L2期启动了insulin/IGF-1信号路径和TGF-β信号路径,在一定程度上抑制dauer型幼虫的形成。另外,成虫期akt-1和daf-8基因在不同性别虫体内的表达量差异显著,雄虫明显高于雌虫,表明akt-1和daf-8基因的表达存在性别差异性。2.根据q PCR定量分析结果,结合dauer型幼虫的关键发育时间节点,我们选择L2幼虫开展m RNA整体原位杂交实验。研究结果表明,akt-1基因在松材线虫L2幼虫身体中部的消化系统稳定表达,daf-8基因在中食道球及其后部稳定表达。根据该原位杂交的特异性表达部位,结合松材线虫dauer型幼虫的口针和食道严重退化的形态特征,进一步证实akt-1和daf-8基因可能是调控松材线虫dauer型幼虫形成的关键基因。3.采用In-fusion Cloning技术,将松材线虫akt-1和daf-8基因的启动子克隆到线虫特异表达载体p CFJ90的报告基因m Cherry上游,构建松材线虫akt-1和daf-8启动子表达载体,将这两个启动子表达载体显微注射到秀丽隐杆线虫的性腺中,观察其时空表达。结果表明,在胚胎期,akt-1基因在虫体中后部集中表达,而daf-8基因则集中在中食道球附近的神经环(neuronal ring)表达,这与原位杂交的结果高度一致;在幼虫和成虫期,akt-1和daf-8基因在头部和尾部的神经节集中稳定表达。4.采用RNAi技术干扰不同发育阶段的胚胎(卵6 h和卵18 h),结果发现akt-1和daf-8基因干扰后松材线虫卵的孵化率显著降低,并且表现出明显的畸形性状,表明akt-1和daf-8基因对松材线虫的胚胎发育也具有重要的调控功能。有趣的是,对dauer型幼虫形成的关键L2幼虫干扰之后,均未见明显的表型变化,这可能是因为松材线虫从正常幼虫向dauer型幼虫转化的过程中,主要是生理代谢水平上的变化,在外部形态上没有明显畸形的表型特征。5.对L2幼虫干扰之后,进一步采用q PCR技术分析akt-1和daf-8基因下游与dauer型幼虫形成相关的其它基因,初步发现daf-12、daf-14、daf-16和exp-2基因的表达量出现了明显的变化,这表明akt-1和daf-8基因可能是通过与这些基因的协同作用,共同调节松材线虫dauer型幼虫的形成。

关键词：松材线虫 dauer型幼虫 akt-1 daf-8 基因表达调控

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