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dtmuv非编码亚基因组RNA的鉴定及其影响病毒致病性的分子机制研究

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DTMUV非编码亚基因组RNA的鉴定及其影响病毒致病性的分子机制研究

作者：李旭冬山东农业大学

学位级别：硕士

鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,dtmuv）在感染鸭后可导致鸭生产性能下降,病程后期可引起典型的神经症状,严重情况下可导致发病动物死亡,这给我国养鸭业带来严重的危害,此外,国内外已多次报导坦布苏病毒感染人的事件,这同样给我国公... 详细信息

鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,dtmuv）在感染鸭后可导致鸭生产性能下降,病程后期可引起典型的神经症状,严重情况下可导致发病动物死亡,这给我国养鸭业带来严重的危害,此外,国内外已多次报导坦布苏病毒感染人的事件,这同样给我国公共卫生安全带来一定的挑战。坦布苏病毒粒子包含囊膜,其基因组长度大约为11 kb,只含有一个开放阅读框,该阅读框可编码3种结构蛋白和7种非结构蛋白;此外,在开放阅读框的5’和3’端各包含一个非编码区,其中5’端非编码区由94个核苷酸组成,而3’端非编码区由618个核苷酸组成,两个非编码区虽然不被编码成病毒蛋白,但却有着丰富的生物学功能,两者在病毒基因组的复制及翻译等过程中发挥调控作用。研究表明,某些黄病毒在复制过程中,随着病毒基因组的不断复制,基因组的3’非编码区会产生一些长度约为0.3-0.5 kb的亚基因组RNA（subgenomic RNA,sgRNA）,这类RNA具有丰富多样的生物学功能。sgRNA的积累是黄病毒属病毒特有的一个现象,该类产物的形成往往是由病毒基因组3’UTR（Untranslated region,UTR）自身保守的高级结构阻挡了宿主5’-3’核酸外切酶XRN1对基因组的降解而导致,其中,sgRNA 5’端结构在这一过程中发挥了不可替代的作用,这些高级结构的存在保护了下游序列不被降解,而下游序列形成的高级结构可与RNA或者蛋白相互作用来执行相关生物学功能。近年来对于黄病毒sgRNA的研究持续不断,而目前有关dtmuv sgRNA的鉴定和功能探索国内外均未见报道,所以本课题以此为契机开展了dtmuv sgRNA的相关研究,研究过程中采用高通量测序、分子杂交以及核糖核酸酶XRN1的处理技术对dtmuv的sgRNA进行了鉴定。首先通过对Northern blot结果进行分析,可直观上明确dtmuv sgRNA的产生,高通量测序结果则表明在dtmuv感染细胞后会有大约500nt的小片段RNA富集,该类小片段RNA来自于dtmuv基因组3’UTR,结合3’UTR二级结构预测结果,可确定dtmuv sgRNA序列全长大约为528 nt。接着将此序列与dtmuv全基因组序列进行比对,明确了sgRNA在病毒基因组中的准确定位;此外,通过对sgRNA进行二级结构预测,我们获得了完整的dtmuv sgRNA二级结构信息,并且经过分析后发现了位于3’UTR中可阻碍XRN1消化作用的结构,以此为基础进一步分析后,我们明确了该结构中易突变位点,通过对构建的dtmuv感染性克隆的sgRNA锚定区域进行突变,拯救出sgRNA产生能力下降或消失的dtmuv突变株;通过突变株体外实验可知sgRNA在dtmuv致细胞病变及病毒基因组复制过程中发挥重要作用;此外通过突变株雏鸭感染实验证明了sgRNA可影响dtmuv对雏鸭的致病能力。通过本研究,我们明确了dtmuv sgRNA的产生,也验证了dtmuv sgRNA的相关功能,同时也为研发dtmuv sgRNA缺失侯选疫苗株提供了理论依据。

关键词： dtmuv 致病机理反向操作遗传技术亚基因组RNA 感染性克隆

dtmuv感染DEF后外泌体miR-148a-5p对鸭TLR3通路调控的探究

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DTMUV感染DEF后外泌体miR-148a-5p对鸭TLR3通路调控的探究

作者：郭鸿燕四川农业大学

学位级别：硕士

microRNA（miRNA）是只含有12～23个核苷酸的小RNA,通过外泌体（Exosome）运输参与转录后基因的表达调控和多种生物进程。鸭坦布苏病（Duck Tembusu disease）是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,dtmuv）引起的以鸭产蛋量下降为主的... 详细信息

microRNA（miRNA）是只含有12～23个核苷酸的小RNA,通过外泌体（Exosome）运输参与转录后基因的表达调控和多种生物进程。鸭坦布苏病（Duck Tembusu disease）是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,dtmuv）引起的以鸭产蛋量下降为主的禽类疾病,但目前未有dtmuv引起的免疫应答及调控的研究。因此,本研究首先筛选了dtmuv触发的免疫通路并对该宿主免疫通路在dtmuv感染过程中的功能进行了研究。然后我们探究了DEF-Exo miR-148a-5p对免疫通路的调控作用。***感染DEF后免疫通路的筛选及免疫通路作用的探究培养DEF细胞,收集感染dtmuv后12h、24h、36h、48h、60h细胞,用qRT-PCR检测IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、TLR2、TLR3、TLR4转录水平。结果显示dtmuv感染DEF后可引起DEF中IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、TLR2、TLR3、TLR4的转录水平升高（P＜0.05）。将人工合成的TLR3 shRNA和构建的pc DNA3.1（+）-TLR3重组质粒分别转染DEF 24h后再感染dtmuv,通过qRT-PCR检测TLR3下游免疫因子及dtmuv E基因转录水平。结果显示,TLR3下游免疫因子转录水平随TLR3的过表达而升高,随TLR3的沉默表达而降低（P＜0.05）,此外TLR3能下调dtmuv E基因的转录水平（P＜0.05）。dtmuv感染DEF 36h后,分别加入50 IU/mL、100 IU/mL、250 IU/mL、500 IU/mL禽IFN-β。同时将500 IU/mL禽IFN-β加入接毒后的DEF共培养0h,6h,12h,24h。提取细胞全RNA用qRT-PCR对dtmuv E基因的转录水平进行检测。结果显示,IFN-β在一定范围内和处理时间内可下调dtmuv E基因转录水平。表明dtmuv感染能触发TLR3免疫通路,TLR3免疫通路通过分泌IFN-β下调dtmuv E基因转录水平,影响病毒复制。2 DEF-Exo miR-148a-5p对TLR3调控的探究用外泌体分离试剂分离DEF细胞上清中的外泌体。用电镜和western blot对分离物质进行鉴定。电镜结果显示分离到的物质呈现周边凸起、中心凹陷的杯状结构,囊泡小体直径约80 nm,且western blot检测到外泌体表面标志物TSG101和CD9,表明成功分离到DEF-Exo。将接毒的DEF-Exo和未接毒的DEF-Exo分别与PBMC细胞共培养36h后,用qRT-PCR对TLR3和IFN-β转录水平进行检测,用ELISA对TLR3蛋白表达进行检测。结果显示未接毒的DEF-Exo能下调TLR3和IFN-β转录水平,并抑制TLR3的蛋白表达。生物学软件预测发现miR-148a-5p可靶向TLR3,通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-148a-5p与TLR3的靶向关系。结果显示模拟剂（mimic）和pmir GLO-TLR3-Wt共转染的细胞中,荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）,在mimic和pmir GLO-TLR3-Mut及control和pmir GLO-TLR3-Wt共转染的细胞中,荧光素酶活性没有明显变化（P＞0.05）,表明miR-148a-5p可以与TLR3特异性结合。将miR-148a-5p mimic和control分别转染DEF后感染dtmuv,用qRT-PCR对TLR3和IFN-β转录水平进行检测,用ELISA对TLR3蛋白表达检测。结果显示miR-148a-5p能下调TLR3和IFN-β转录水平,并抑制TLR3的蛋白表达。结果表明:DEF-Exo中miR-148a-5p能靶向TLR3并抑制其表达,影响TLR3通路分泌IFN-β而促进dtmuv复制。

关键词： dtmuv TLR3 外泌体 miR-148a-5p

dtmuv感染引发鸭脾脏淋巴细胞归巢变化的细胞机制初探

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DTMUV感染引发鸭脾脏淋巴细胞归巢变化的细胞机制初探

作者：李文倩南京农业大学

学位级别：硕士

2010年在我国浙江、上海等地暴发一种以产蛋鸭卵泡出血破裂为特征的疾病,并迅速蔓延到我国山东、福建等多个地区,对我国养鸭业造成了严重的经济损失。该疾病最初被命名为“鸭出血性卵巢炎”。后来的研究表明,该疾病由一种RNA病毒引起,... 详细信息

2010年在我国浙江、上海等地暴发一种以产蛋鸭卵泡出血破裂为特征的疾病,并迅速蔓延到我国山东、福建等多个地区,对我国养鸭业造成了严重的经济损失。该疾病最初被命名为“鸭出血性卵巢炎”。后来的研究表明,该疾病由一种RNA病毒引起,与黄病毒属的恩塔亚病毒具有较高同源性,并将该病毒正式命名为鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,dtmuv)。目前对dtmuv的研究主要集中在基因结构、蛋白组成、检测方法以及预防治疗等方面。全身免疫应答的整合和控制依赖于淋巴细胞的调节运输。在淋巴细胞再循环过程中,有一种存在于各种淋巴组织和器官的独特的高内皮微静脉(high endothelial venules,HEV),是淋巴细胞重新分布的重要结构。淋巴细胞通过高内皮微静脉分布到淋巴组织和器官的过程,称为淋巴细胞归巢。淋巴细胞归巢能够引导淋巴细胞亚群进入控制其分化和调节其生存的特殊微环境,并将免疫效应细胞定位于抗原或微生物入侵的位点。淋巴细胞归巢是一个多步骤过程,需要高内皮微静脉内皮细胞表面的血管地址素和淋巴细胞表面的归巢因子相互作用,促进淋巴细胞对血管内皮细胞的粘附和迁移。高内皮微静脉在人类除脾脏以外的各个淋巴结和相关淋巴组织均有发现,后来的研究在鸡和鳖的脾脏中发现高内皮微静脉的结构,且与淋巴细胞的归巢运动密切相关。目前对淋巴细胞归巢的研究主要集中在其结构基础、归巢相关受体以及迁移方式等方面,对鸭脾脏内淋巴细胞归巢以及蛋白多糖与淋巴归巢关系的研究甚少。本文主要采用形态学和细胞学的研究方法,探究了 dtmuv感染后鸭脾脏内淋巴细胞归巢的变化。试验I鸭脾脏淋巴细胞归巢的结构基础及蛋白多糖的分布本试验首先通过HE染色和透射电镜法观察发现位于鸭脾脏白髓的椭球中心的鞘毛细血管为HEV,其内皮细胞具有典型的立体状,含有发达的高尔基体;且鞘毛细血管周围被大量的淋巴细胞围绕,形成椭球周围淋巴鞘(Periellipsoidal Lymphatic Sheaths,PELS)。其次,本试验将羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)标记的淋巴细胞通过颈静脉注入鸭,结果显示标记的淋巴细胞能够通过鞘毛细血管进入鸭脾脏组织,并集中分布在PELS,表明鞘毛细血管是淋巴细胞从血液进入鸭脾脏组织的重要通道。此外,本试验首次通过阳性胶体铁染色鉴定了蛋白多糖在鸭脾脏内的分布,结果表明蛋白多糖在鞘毛细血管和PELS部位表达,可能与淋巴细胞归巢运动相关。试验Ⅱ dtmuv感染引发鸭脾脏淋巴细胞归巢的细胞学变化本研究选用dtmuv XZ-2012毒株,对6月龄阴性麻鸭腿部肌肉注射0.2ml dtmuv(5×105 TCID50/mL),选择三个不同的感染时间(3d、5d、7 d),通过HE染色、透射电镜以及阳性胶体铁染色观察鸭脾脏淋巴细胞归巢的细胞学变化。结果显示,病毒感染3 d时,脾脏组织PELS部位受病毒破坏,呈空泡化,但淋巴细胞与高内皮细胞运动活跃,鞘毛细血管周围淋巴细胞数量增多,蛋白多糖在鞘毛细血管部位分布较对照组增多。病毒感染5 d时,脾脏组织内淋巴细胞大量增多,可观察到变形的淋巴细胞,脾脏PELS处的空泡减轻,蛋白多糖在椭球部位表达量增加。病毒感染7d时,脾脏组织逐渐恢复正常,PELS部位空泡化基本消失,大量淋巴细胞围绕鞘毛细血管,蛋白多糖在鞘毛细血管的表达量较感染前期增加,PELS处蛋白多糖重新表达。综上所述,dtmuv感染成年鸭后刺激淋巴细胞不断地从鞘毛细血管进入脾脏组织,高内皮细胞和淋巴细胞运动活跃,蛋白多糖在病毒感染后表达量均比正常组高,表明蛋白多糖与淋巴细胞归巢运动密切相关。

关键词：淋巴细胞归巢 dtmuv 蛋白多糖 HEV 椭球

多囊泡体及其外泌体在dtmuv感染鸭脾脏过程中的作用机制

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多囊泡体及其外泌体在DTMUV感染鸭脾脏过程中的作用机制

作者：刘恩雪南京农业大学

学位级别：硕士

鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,dtmuv）是黄病毒属的单链RNA病毒,该病毒传播快,感染率高,能够引起产蛋鸭卵巢出血为典型特点的疾病,是自2010年我国沿海发现的一种新型致病性黄病毒。dtmuv自我国东南部沿海暴发后,很快蔓延到中国大... 详细信息

鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,dtmuv）是黄病毒属的单链RNA病毒,该病毒传播快,感染率高,能够引起产蛋鸭卵巢出血为典型特点的疾病,是自2010年我国沿海发现的一种新型致病性黄病毒。dtmuv自我国东南部沿海暴发后,很快蔓延到中国大部分的鸭产区包括许多沿海省份和邻近地区。黄病毒属的许多病毒成员,如登革热病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒和齐卡病毒,都是引起人畜共患病的重要传播性病毒,每年可引起数百万次感染,从轻微的发热症状到致命的出血或神经疾病。由于dtmuv与致病性黄病毒具有高度同源性,因此dtmuv可能是一种不容忽视的潜在的人畜共患病毒,深入了解该病毒的致病机理,对于开发dtmuv疫苗和抗病毒药物具有重要意义。外泌体（Exosomes）是一种直径约为30-100nm的脂双层膜性囊泡,外泌体是由细胞内的多囊泡体（Multivesicular bodies,MVBs）以“逆出芽”的方式产生,随着MVBs内富集大量的腔内囊泡（Intraluminal Vesicles,ILVs）,最终MVBs以胞吐的方式将外泌体释放到细胞外中。外泌体存在于机体各种体液中,包括血浆、尿液、唾液、母乳、脑脊液等,并携带多种功能性蛋白（四种跨膜蛋白、MHC蛋白和细胞因子等）、脂质（胆固醇、鞘磷脂、鞘糖脂,磷脂酰胆碱和饱和脂肪酸等）和核酸（mRNA、miRNA、tRNAs和rRNAs等）。外泌体能够在细胞间传递多种信号分子,参与机体正常生理过程,如抗原递呈、组织修复,应激反应等以及肿瘤转移、病毒感染,免疫应答等病理过程。本研究利用形态学方法观察在dtmuv感染鸭脾脏过程中多囊泡体和外泌体的分泌和分布动态变化,同时结合形态学和分子学的研究方法探究多囊泡体和外泌体在dtmuv感染鸭脾脏过程中的介导机制。试验Ⅰ 多囊泡体及其外泌体在感染dtmuv的鸭脾脏中的动态分布外泌体是由多囊泡体（Multivesicular bodies,MVBs）分泌的一种能够参与多种生理和病理过程的囊泡。本研究采用免疫组化、免疫荧光和透射电镜等形态学方法,在亚细胞水平上对感染鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,dtmuv）的鸭脾脏进行研究,探究在不同的感染时间（lhpi、2hpi、12hpi、24hpi）下MVBs和外泌体的动态分布规律。结果显示当病毒刚入侵脾脏即在攻毒2h时,MVBs和外泌体的分泌量显着增加,且主要分布于鞘毛细血管内皮周围和椭球周围淋巴鞘（Periellipsoidal lymphatic sheaths,PELS）中,随着感染时间的延长,MVBs和外泌体的分泌逐渐减少。透射电镜的超微结构特征显示,在鞘毛细血管中的高内皮细胞和PELS中的淋巴细胞和椭球相关巨噬细胞中发现四种发育阶段的MVBs即内吞的泡状结构、前多囊泡体、低电子密度多囊泡体（Pale Multivesicular bodies,pM）和高电子密度多囊泡体（Dense Multivesicular bodies,dM）,且在细胞间隙和血管中观察到游离外泌体。试验Ⅱ 多囊泡体及其外泌体在dtmuv感染鸭脾脏细胞过程中的介导作用网格蛋白介导的内吞途径（Clathrin-mediated endocytosis,CME）是大分子物质和病原体进入宿主细胞的主要途径,黄病毒进入宿主细胞的主要方式是CME,CME涉及多种囊泡结构,包括网格蛋白膜包囊泡、早期内含体、晚期内含体、腔内囊泡、多囊泡体、外泌体等。其中多囊泡体和外泌体能转移细胞质中蛋白质、脂类和核酸,在病毒发病机制中起着重要作用。本研究利用蛋白印记技术（WB）和实时荧光定量技术（RT-qPCR）对dtmuv内吞通路的相关基因和蛋白进行验证,结果显示,在2hpi内吞通路相关的基因和蛋白表达都上调。同时利用免疫荧光双标法标记dtmuv-E蛋白和外泌体,发现在2hpi的脾脏鞘毛细血管周围存在病毒和外泌体的共定位,说明病毒进入细胞后,利用内吞途径中的多囊泡体和外泌体进行细胞之间的感染。进一步在电镜下观察到病毒包裹于多囊泡体中,与免疫荧光双标结果一致,说明多囊泡体和外泌体可能介导dtmuv在鸭脾脏细胞之间的感染。

关键词：外泌体多囊泡体 dtmuv 内吞途径

鹅、鸭Viperin序列及其免疫学特性鉴定与鸭Viperin抗dtmuv功能研究

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鹅、鸭Viperin序列及其免疫学特性鉴定与鸭Viperin抗DTMUV功能研究

作者：孙立霈四川农业大学

学位级别：硕士

Viperin（virus inhibitory protein,endoplasmic reticulum associated,interferon-inducible,Viperin）属于干扰素刺激基因（Interferon stimulated genes,ISGs）家族,是一种在免疫反应中直接发挥作用的效应分子。其蛋白结构主要可分为N端、SAM域中间端及C端,除N端在物种间差异性较大外,其余两部分序列高度保守。目前已知Viperin可通过直接与病毒蛋白相互作用或阻断病毒出芽途径等方式发挥抗病毒功能。本研究以鸭、鹅血基因组为模板分别扩增鸭、鹅Viperin全长序列,得到鸭Viperin编码区（Coding sequences,CDS）序列长1092核苷酸（Nucleotides,nt）,编码363氨基酸（Amino acid,aa）;鹅Viperin部分CDS序列长879 nt,编码292 aa。通过对鸭、鹅Viperinaa序列比对,发现除鹅Viperin缺失的N端外,两序列SAM域中间端及C端序列相似度极高。系统进化树分析发现哺乳类、爬行类、两栖类、禽类、鱼类的Viperin分别聚为一簇,且在禽类上鸭、鹅Viperin亲缘性最近。基于已获得的序列,运用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-Timequantitative Polymerase Chain Reaction RT-q PCR）法探究鸭、鹅Viperinm RNA在不同刺激剂刺激下的表达变化情况。分别检测鸭肝炎病毒（Duck Hepatitis A virus,DHAV）、鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）及鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,dtmuv）刺激鸭胚成纤维细胞（Duck embryo fibroblast,DEF）12 h后的细胞中鸭Viperinm RNA转录水平的变化情况。经鉴定,4种病毒均能使Viperinm RNA表达量显著上调。同时,分别检测dtmuv、小鹅瘟（Goose parvovirus virus,GPV）、H9N2（Avian influenza virus H9N2,H9N2）及Toll-样受体（Toll-like receptor,TLR）激动剂ODN2006（Oligodeoxynucleotides）、LPS（Lipopolysaccharide）、R848（Resiquimod）及Poly I:C（Polyinosinic Acid-Polycytidylic Acid）刺激鹅外周血单核细胞（PBMC）6 h后的细胞中鹅Viperinm RNA转录水平的变化情况。结果显示,3种病毒及4种激动剂均能使Viperinm RNA表达量显著上调。构建pc DNA3.1（+）-鸭Viperin及p EGFP-C2-鸭Viperin真核表达质粒以研究鸭Viperin的蛋白大小及在细胞内定位情况,并在DEF上探究鸭Viperin蛋白与dtmuv间关系。经鉴定,鸭Viperin蛋白为42 k Da,且在DEF及BHK21细胞中均仅存在于胞质。将鸭Viperin重组质粒转入DEF 12 h后,接种dtmuv,并对细胞中dtmuv基因组拷贝数、病毒TCID50及病毒荧光进行检测。结果显示:在dtmuv病毒感染DEF12、24及36 h,鸭Viperin蛋白均能显著抑制dtmuv增殖;除病毒基因组拷贝数外,在病毒感染DEF36 h后,还分别检测了病毒TCID50及病毒荧光量,结果也一致。因此,初步鉴定出鸭Viperin确实具有抗dtmuv活性。综上,本课题克隆了鸭、鹅Viperin序列,通过序列比较及进化树构建,鉴定出两序列具有很近的亲缘性;通过免疫刺激剂刺激,鉴定了鸭、鹅Viperin的免疫学特性;并初步验证出鸭Viperin蛋白具有抗dtmuv活性。

关键词：鸭Viperin 鹅Viperin 免疫学特性抗病毒功能 dtmuv

杆状病毒表面展示鸭坦布苏病毒E蛋白的免疫原性及保护效果的研究

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中国预防兽医学报 2014年第12期36卷 961-965页

作者：王善辉李云龙强成魁成子强江苏省徐州生物工程职业技术学院动物工程系江苏徐州221006 山东农业大学动物科技学院山东泰安271018

鸭坦布苏病毒(dtmuv)为新出现的病毒,主要引起鸭的产蛋量急剧下降。为评价真核表达dtmuv的E蛋白的免疫原性,本研究利用杆状病毒表面展示技术,构建表面展示dtmuv JSXZ株E蛋白的重组杆状病毒(r BV-dtmuv-E),将其感染昆虫细胞,从而将E蛋白... 详细信息

鸭坦布苏病毒(dtmuv)为新出现的病毒,主要引起鸭的产蛋量急剧下降。为评价真核表达dtmuv的E蛋白的免疫原性,本研究利用杆状病毒表面展示技术,构建表面展示dtmuv JSXZ株E蛋白的重组杆状病毒(r BV-dtmuv-E),将其感染昆虫细胞,从而将E蛋白展示在杆状病毒的表面,并对表达的重组E蛋白(r E)的免疫原性和保护效果进行研究。经western blot和间接免疫荧光试验证明r E能够在Sf9细胞中有效表达;并且呈可溶性表达。重组蛋白经镍柱纯化,并采用氢氧化铝乳化(0.1μg/m L),分别以0.2 m L、0.4 m L和0.6 m L的剂量免疫雏鸭,通过ELISA抗体检测结果证明,r E可以诱导产生高水平的Ig G血清抗体;MTT试验结果表明,r E能够刺激T淋巴细胞增殖;攻毒保护试验结果显示,其0.2 m L组免疫保护率为80%,0.4 m L和0.6 m L组保护率均为100%,而对照组雏鸭均表现为典型的dtmuv感染症状,其中4只死亡。以上研究结果为dtmuv亚单位疫苗的研究奠定了基础。

关键词： dtmuv E蛋白杆状病毒表面展示技术免疫原性保护效果

Multiplex PCR Assay Establishment for Detection of H5,H9 Subtypes Avian Influenza Virus and Duck Tembusu Virus

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Animal Husbandry and Feed Science 2016年第1期8卷 31-33页

作者： Tang Weiguo Li Haiqin Fu Guanghua Huang Yu Wei Qipeng Institute of Animal Husbandry and Veterinary Jiangxi Academy of Agricultural Sciences Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine Fujian Academy of Agricultural Science

The paper aimed to establish a rapid multiplex PCR assay for detection of 1-15, H9 subtype avian influenza virus （VIA） and duck Tembusu virus （DT- MUV）. According to the HA gene sequences of I-L5 and H9 AIV and NS5 gene of dtmuv in C, enBank, three sets of primer specific to these three kinds of viruses were designed, respectively. The multiplex PCR for simultaneous detection of AIV （ HS, H9 ） and dtmuv was established, and was applied in clinical. The speci- ficity and sensitivity of the multiplex PCR were tested. The results showed that the assay could specifically amplify the gene fragments of I-IS AIV （380 bp）, H9 AIV （ 732 bp）, and dtmuv （250 bp ）, and were all negative for other duck viruses. This method showed the sensitivity of 533 pg/μL for H5 MV, 56 pg/μL for I-I9, and 6.6 ng/μL for dtmuv. Additionally, the detection results of 200 clinical samples indicated that this multiplex PCR method was a rapid, sensitive and svecific tool for clinical sample detection.

关键词： H5 AIV H9 AIV dtmuv Multiplex PCR

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超薄切片技术的优化及其在兽医研究中的应用

中国动物传染病学报 2022年

作者：史永红陈秋生南京农业大学动物医学院中国农业科学院上海兽医研究所

超薄切片技术作为兽医领域研究的重要手段得到了广泛的应用，然而超薄切片技术的通用制备程序对不同样品的并非都能获得较高质量的结果。本研究基于传统的电镜技术，首先通过对羊皮肤超薄切片技术的优化，然后用优化的方法在dtmuv感染... 详细信息

超薄切片技术作为兽医领域研究的重要手段得到了广泛的应用，然而超薄切片技术的通用制备程序对不同样品的并非都能获得较高质量的结果。本研究基于传统的电镜技术，首先通过对羊皮肤超薄切片技术的优化，然后用优化的方法在dtmuv感染鸭脑组织及BHK-21细胞、微孢子虫感染的三疣梭子蟹肌肉组织以及PRV感染的vero细胞3种样品中进行应用验证。优化主要通过在常规固定液中加入4%的多聚甲醛改良固定液、全程使用丙酮为脱水剂、增加30%脱水步骤、100%脱水采取时间梯度（10、15、20、30 min）脱水、延长浸透为常规双倍并且增加一部纯包埋剂等方法的优化，证实优化后的步骤能够稳定获得平整厚度均一的切片；使用20%乙醇配置的醋酸双氧铀溶液及延长染色时间至20 min，证实能够使得切片干净平整无污染且染色反差好；使用75目的大孔径载网捞片，结果大大增加了切片的可观察区域。通过这些优化可以获得大视野的高质量的超薄切片，并且在dtmuv感染鸭脑组织及BHK-21细胞、微孢子虫感染的三疣梭子蟹肌肉组织以及PRV感染的vero细胞中得到了验证，表明优化的超薄切片技术能够满足兽医超微形态学研究的应用。

关键词：超薄切片透射电镜皮肤 dtmuv 微孢子虫 PRV

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鸭坦布苏病毒E蛋白中和性单克隆杭体的制备

中国家禽 2012年第4期34卷 25-28,32页

作者：姬希文李雪松李国新肖亚莉颜丕熙徐大伟范钊张七斤李泽君内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 中国农业科学院上海兽医研究所农业部寄生虫重点开放实验室上海200241 国家家禽工程技术研究中心上海200241

本试验利用纯化的鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus , dtmuv)奉贤株(FX2010)免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,筛选获得3株能够稳定分泌杭dtmuv的杂交瘤细胞,分别命名为:J1-E5-E4, 7B5和1E5-B6,3株杂交瘤细胞诱导同品系刁、鼠的... 详细信息

本试验利用纯化的鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus , dtmuv)奉贤株(FX2010)免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,筛选获得3株能够稳定分泌杭dtmuv的杂交瘤细胞,分别命名为:J1-E5-E4, 7B5和1E5-B6,3株杂交瘤细胞诱导同品系刁、鼠的杭体效价为1:12 800,1:6 400和1:25 600。间接ELISA和IFA结果显示,3株单杭均可以与dtmuv发生特异性反应。进一步研究发现,J1-E5-E4可以与dtmuv-E蛋白结合,使得表达E蛋白的293T细胞显现出特异性的绿色荧光;在病毒中和试验中,J1-E5-E4可以中和dtmuv,使其失去致死鸡胚的能力。这些结果表明,J1-E5-E4是一株针对dtmuv-E蛋白中和表位的单杭,该单杭将在dtmuv诊断和杭原分析中发挥重要作用。

关键词： dtmuv E蛋白中和单克隆抗体