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中医六经辨证经典方改善小鼠dss结肠炎和肠微生态的作用研究

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中医六经辨证经典方改善小鼠DSS结肠炎和肠微生态的作用研究

作者：普正佳重庆医科大学

学位级别：硕士

目的溃疡性结肠炎(UC)是一种以粘膜上皮细胞损伤和肠道稳态失衡为特征的慢性复发性肠道炎症性疾病。研究表明,肠微生态的失衡与UC的发生和发展密切相关。因此,针对肠微生态的调节措施可能是对抗UC的有效方法。传统中药因其温和、高效等... 详细信息

目的溃疡性结肠炎(UC)是一种以粘膜上皮细胞损伤和肠道稳态失衡为特征的慢性复发性肠道炎症性疾病。研究表明,肠微生态的失衡与UC的发生和发展密切相关。因此,针对肠微生态的调节措施可能是对抗UC的有效方法。传统中药因其温和、高效等优点受到越来越多的关注。其对肠微生态的调节被认为是发挥治疗作用的重要机制。中医治疗是以中医理论为指导的辩证论治。近年中医药治疗UC的研究热度高涨,然而难以见到与中医理论结合的现代科学研究。因此在揭示中医药对UC的治疗作用以及对肠微生态的调节作用存在一定的局限性。六经辨证通过对外感疾病在发生发展的演变过程中各种证候群进行综合分析,将疾病分为太阳、阳明、少阳、太阴、少阴和厥阴六经证,并提出对应的治法和方剂,使其对疾病的防治具有良好的精准性。《伤寒论》中用于太阳证的葛根芩连汤(GQD),用于阳明少阳证的大柴胡汤(DCD)和用于厥阴证的乌梅丸(WP),以及《温病条辩》中用于厥阴证的连梅汤(LD)对UC均具有治疗作用。基于此,本研究假设以上针对不同证型的中药复方对UC小鼠肠道炎症和肠微生态具有不同的防治效果,涉及不同的靶点和通路。方法以7周龄雄性小鼠为受试对象,GQD、DCD、WP和LD灌胃2周,在灌胃的第二周开始时,同时给予dss组、GQD组、DCD组、WP组和LD组小鼠含2%葡聚糖硫酸钠(dss)的饮水7天建立溃疡性结肠炎小鼠模型。用体重变化、结肠长度和脾脏指数、MDA含量和SOD活性、H&E和AB-PAS染色、RT-qPCR评估四种方剂对溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用。16S r RNA测序和非靶向代谢组学测定粪便样本以评估四种方剂对溃疡性结肠炎小鼠肠微生态的调节能力。结果GQD、DCD、WP和LD可减缓dss引起的小鼠体重降低,DCD和LD逆转结肠缩短,WP和LD减轻脾脏指数的升高;WP具有显著的抗氧化应激作用,GQD和DCD显著降低MDA含量;GQD、DCD、WP和LD改善dss诱导的结肠炎小鼠肠道组织病理状况,以及杯状细胞数量的减少;GQD、WP和LD减缓occludin表达水平的降低;GQD、DCD、WP和LD均能显着抑制dss诱导的结肠炎症,DCD的降炎效果最显著;GQD、DCD、WP和LD通过增加有益菌属丰度,降低条件致病菌丰度部分恢复dss诱导的肠道菌群组成改变,WP和LD逆转属水平Alpha多样性的降低;GQD、DCD、WP和LD治疗显著改变结肠炎小鼠粪便代谢谱,DCD组代谢物组成与CON组最接近。四种方剂治疗作用可能与对嘌呤代谢、色氨酸代谢和维生素B6代谢相关产物的差异调节有关。结论本研究比较了中医六经辨证经典方剂GQD、DCD、WP和LD对结肠炎小鼠的治疗和对其肠微生态的调节作用,发现四种方剂均有治疗和调节作用,但存在差异。总体而言,DCD在抗炎和对宿主代谢的调节方面具有优势,WP在抑制氧化损伤和对肠道菌群的调节方面具有优势。DCD和WP可能是对抗UC更好的的治疗策略。

关键词： dss诱导的结肠炎肠微生态葛根芩连汤大柴胡汤乌梅丸连梅汤

木犀草素对葡聚硫酸钠诱导的小鼠实验性结肠炎的防治作用

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木犀草素对葡聚硫酸钠诱导的小鼠实验性结肠炎的防治作用

作者：李越武汉大学

学位级别：硕士

目的木犀草素是天然的抗氧化剂,存在于络石藤、野菊花、金银花、透骨草、白毛夏枯草等多种植物中,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和细胞保护等多种作用。近年来,氧化应激在溃疡性结肠炎（UC）发生与发展中的作用逐渐受到重视,调控氧... 详细信息

目的木犀草素是天然的抗氧化剂,存在于络石藤、野菊花、金银花、透骨草、白毛夏枯草等多种植物中,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和细胞保护等多种作用。近年来,氧化应激在溃疡性结肠炎（UC）发生与发展中的作用逐渐受到重视,调控氧化/抗氧化平衡有望成为有效治疗UC的靶点之一。本文通过探讨木犀草素对葡聚糖硫酸钠（dss）诱导的小鼠实验性结肠炎的干预作用,旨在为临床上UC的防治提供新的思路。方法3%dss连续饮用7天构建实验性小鼠UC模型,C57BL/6小鼠随机均分为5组:正常健康对照组、dss模型组、木犀草素低剂量组（5 mg/kg）、中剂量组（20mg/kg）、高剂量组（50mg/kg）。检测各组小鼠的疾病活动度（DAI）;比较结肠长度;HE染色观察小鼠结肠组织病理损伤变化;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、结肠核因子相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶1（HO-1）、苯醌氧化还原酶1（NQO1）的mRNA表达水平;Western blot检测核内Nrf2蛋白表达情况。结果木犀草素各剂量组DAI评分明显低于dss模型组（3.17±0.65、2.03±0.40、1.27±0.25 VS 3.90±0.36,P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01）;木犀草素各剂量组不同程度抑制了小鼠结肠的缩短（4.27±0.75、5.17±0.35、5.97±0.50 VS 3.67±0.65）,其中中、高剂量组与dss模型组相比差异显著（P＜0.01）;结肠组织病理显示,木犀草素各剂量组病变程度较dss模型组均减轻;RT-PCR显示,木犀草素各剂量组Nrf2、HO-1、NQO1含量较dss模型组（0.18±0.08、0.16±0.13、0.19士0.10）均升高,TNF-α、IL-6 水平较 dss 模型组（1.59±0.47、2.02±0.36）均下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。Western blot显示,与dss模型组相比,木犀草素各剂量组Nrf2核内蛋白含量明显增加,差异有统计学意义（0.13±0.62 VS0.28±0.50、0.37士0.80、0.51±0.92,P＜0.05）。结论木犀草素能缓解实验性小鼠结肠炎,减轻小鼠DAI评分,抑制小鼠结肠缩短,降低小鼠结肠组织病理评分。其作用机制可能为激活Nrf2信号通路,促进Nrf2入核,进而上调下游靶基因HO-1、NQO1mRNA水平,抑制促炎因子TNF-α、IL-6mRNA的表达,增强小鼠结肠抗氧化活性,调控氧化/抗氧化平衡。

关键词：木犀草素 dss诱导的结肠炎 Nrf2 HO-1

复方苦黄汤对实验性结肠炎小鼠结肠组织中Th17、Tregs分化相关转录因子表达的影响

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中华中医药学刊 2019年第4期37卷 807-809,1033-1034页

作者：张漫谭晨唐庆范恒刘星星王文竹华中科技大学同济医学院附属协和医院中医科湖北武汉430022

目的:研究复方苦黄汤对实验性结肠炎小鼠结肠组织中Th17、Tregs分化相关转录因子表达的影响,探讨其治疗结肠炎的疗效和机制。方法:将36只BALB/c小鼠随机分为4组:正常对照组、模型组、地塞米松组和复方苦黄汤组,每组9只。正常对照组未行... 详细信息

目的:研究复方苦黄汤对实验性结肠炎小鼠结肠组织中Th17、Tregs分化相关转录因子表达的影响,探讨其治疗结肠炎的疗效和机制。方法:将36只BALB/c小鼠随机分为4组:正常对照组、模型组、地塞米松组和复方苦黄汤组,每组9只。正常对照组未行造模,其余3组自由饮用4%dss水溶液共7 d建立实验性结肠炎模型。复方苦黄汤组小鼠给予复方苦黄汤灌胃,地塞米松组小鼠给予地塞米松腹腔注射,模型组和正常组小鼠均以蒸馏水灌胃,造模成功后第2天开始每日给药治疗共7 d,第8天禁食24 h后处死小鼠,观察实验小鼠结肠黏膜大体形态及肠道炎症评分,免疫组化法检测小鼠结肠Th17、Tregs分化相关转录因子RORΥt及Foxp3表达。结果:模型组较正常对照组小鼠结肠肠道大体形态和炎症评分显著升高(P结肠炎小鼠Th17/Treg平衡起到减轻结肠黏膜炎症,保护结肠黏膜的作用。

关键词： RORγt Foxp3 dss诱导的结肠炎复方苦黄汤

新型3-羟基雄甾烷-5,7-二烯-17-羧酸衍生物的合成及其在IBD中的应用

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新型3-羟基雄甾烷-5,7-二烯-17-羧酸衍生物的合成及其在IBD中的应...

作者：陈镜玄南方医科大学

学位级别：硕士

炎症性肠炎(Inflammatory bowel diseases,IBD)是一类高发于人类的自身免疫性疾病,根据病理表征和发病部位的不同分为溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩氏病(Crohn’sdisease,CD)。该类疾病以肠粘膜不受控制的炎症为主要特征... 详细信息

炎症性肠炎(Inflammatory bowel diseases,IBD)是一类高发于人类的自身免疫性疾病,根据病理表征和发病部位的不同分为溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩氏病(Crohn’sdisease,CD)。该类疾病以肠粘膜不受控制的炎症为主要特征,伴有腹痛,腹泻,粘液血便,肠梗阻和体重减轻等症状。随着全球的发病率逐年上升,炎症性肠炎已成为影响人类健康的全球化疾病。IBD目前的治疗仅限于控制症状,维持缓解和预防复发。当前临床上用于治疗IBD的药物主要包括氨基水杨酸酯制剂,糖皮质激素,免疫调节剂和生物制剂等。其中,糖皮质激素虽然全身性副作用大,但仍是炎症性肠疾病最有效的治疗方法之一,主要用于中度至重度解IBD患者的缓解治疗中。研发新型副作用小但疗效好的甾体类药物对于IBD的治疗具有重要意义。本论文基于3-羟基雄甾烷-5,7-二烯-17-羧酸(17-COOH-7DA)的结构,设计合成了一系列新的甾体类化合物。为评价这些化合物的抗炎活性,我们利用RAW264.7细胞和dss诱导的结肠炎小鼠模型从体内外不同层面进行研究并探索其可能发挥作用的机制,以期其用于IBD的治疗中。具体研究内容如下:(1)基于17-COOH-7DA引入不同长度的侧链,并在此基础上将母核改为孕烯醇酮,引入含不同杂原子的侧链以期改善化合物的抗炎活性。合成时以醋酸孕烯醇酮为原料,通过侧链乙酰基氧化为羧基得中间体3-羟基雄甾烷-5-烯-17-羧酸,中间体酯化后甾体母核7位脱氢得3-羟基雄甾烷-5,7-二烯-17-羧酸酯(5a-d)系列化合物;中间体侧链酰胺化得3-羟基雄甾烷-5-烯-17-碳酰胺系列化合物(6a-s);孕烯醇酮的甾体母核先脱氢为5,7-二烯后,再与格氏试剂反应得到不同侧链的3,20-二羟基雄甾烷-5,7-二烯(8a-c)系列化合物;(2)利用NO抑制试验评价所合成化合物的抗炎活性,实验结果表明在LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞中,9个化合物在20μM时的NO抑制率超过50%;qPCR,Western Blot和Elisa实验分别从转录和蛋白水平进一步验证了化合物6q对炎症因子的抑制作用,这种抗炎作用可能通过NF-κB信号转导途径得以实现;(3)通过给小鼠自由饮用dss水溶液诱发小鼠急性结肠炎,同时腹腔注射6q溶液一周后,取小鼠结肠进行组织学、免疫组化和蛋白含量分析,实验结果表明6q可通过阻断NF-κB信号通路,有效缓解dss诱发结肠变短、隐窝脓肿等炎症反应。但剂量过高时炎症反应并未有明显改善。综上所述,本文设计、合成了 26个17-COOH-7DA衍生物并对其进行生物活性测定,发现化合物6q在体外具有显著的抗炎作用。此外,在构建的dss结肠炎模型中,6q显著改善了小鼠体内的炎症反应,表明6q这种新颖的化合物有望用于IBD的治疗,值得进一步研究。

关键词：炎症性肠炎糖皮质激素 3-羟基雄甾烷-5,7-二烯-17-羧酸 dss诱导的结肠炎

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ES2A与溃疡性结肠炎相关的病理机制研究

ES2A与溃疡性结肠炎相关的病理机制研究

作者：许宽宏中国科学技术大学

学位级别：硕士

肠道是人体内最大的消化器官和免疫器官,因此肠道健康对人类正常生活有举足轻重的影响。炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是指一类发生于肠道的慢性炎症,包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s d... 详细信息

肠道是人体内最大的消化器官和免疫器官,因此肠道健康对人类正常生活有举足轻重的影响。炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是指一类发生于肠道的慢性炎症,包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）两种主要类型。UC发病的具体机制目前尚不清楚,目前普遍认为这是一个多因素相互作用而导致的疾病,主要包括微生物、环境、遗传、免疫等因素。本论文主要利用小鼠结肠炎模型,探究ES2A在溃疡性结肠炎中的作用机制。我们从医院收集了 UC患者和正常人各20例的血浆和肠粘膜组织,分别用ELISA和western blot的方法检测ES2A的表达,结果发现UC患者的ES2A的表达水平分别下调了 26.5%和55.3%,提示ES2A可能在溃疡性结肠炎发病中起作用。我们利用葡聚糖硫酸钠（Dextran sulphate sodium,dss）诱导的小鼠结肠炎模型,探究ES2A在UC中的发病机制。我们测定了过表达ES2A组、敲降ES2A组和对照组体重变化、疾病活动指数和结肠缩短程度等症状指标。结果显示,在造模第10天,与dss对照组相比,ES2A过表达组体重下降明显较少（8.5±3.4%vs 13.4±2.8%）,疾病活动指数上升明显较少（5.8± 1.7 vs 7.3±1.8）,结肠缩短程度较低（结肠长度:7.1±0.4 vs 6.3±0.5 cm）,敲降ES2A组体重下降明显较多（21.8±4.1%vs 13.4±2.8%）,疾病活动指数上升明显较多（10.1±1.5 vs 7.3±1.8）,结肠缩短更明显（结肠长度:5.8±0.3 vs 6.3±0.5 cm）,说明ES2A减轻造模小鼠的症状。各组小鼠结肠组织石蜡切片和HE染色结果显示,与dss对照组相比,过表达ES2A造模小鼠组织病理学评显著降低（3.2±0.7 vs 5.2±1.7）,而敲降ES2A造模小鼠组织病理学评显著升高（7.0± 1.0 vs 5.2±1.7）。我们分别用ELISA和qPCR等方法检测各组血清和结肠组织炎症因子的表达和转录水平。结果发现,与dss对照组相比,过表达ES2A组小鼠炎症因子水平明显降低,而敲降ES2A组小鼠的炎症因子水平显著。我们分离了各组小鼠的肠系膜淋巴结和结肠组织,并将其消化为单个细胞,通过流式细胞术检测肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph nodes,MLN）和肠道固有层淋巴细胞（Lamina propria lymphocytes,LPL）中Treg细胞和Th17细胞的比例。结果发现与dss诱导组相比,过表达ES2A增加炎症部位Treg细胞的比例（LPL:3.0±0.3%vs 2.5±0.3%,MLN:22.8±4.7%vs 16.7±2.3%）,而敲降 ES2A 会减少 Treg 细胞的比例（LPL:2.1±0.4 vs 2.5±0.3%,MLN:13.14±2.7 vs 16.7±2.3%）。同时,过表达ES2A减少炎症部位Th17细胞的比例（LPL:11.1±2.8 vs 17.9±3.1%,MLN:6.3±1.6 vs 9.5±0.3%）,而敲降 ES2A 增加 Th17 细胞的比例（LPL:23.9±2.8 vs 17.9 ± 3.1%,MLN:13.3 ±1.6 vs 9.5±0.3%）。以上结果说明 ES2A 在炎症过程中通过调节Treg细胞和Th17细胞的比例进而抑制炎症。我们还探究ES2A在TCR α-/-小鼠模型中的作用。TCR α-/-小鼠可在第20周时自发形成性结肠炎模型。第20周时我们取出正常小鼠TCR α-/-小鼠组、过表达ES2ATCR α-/-小鼠组和敲降ES2A TCR α-/-小鼠组的结肠组织,制作石蜡切片并进行HE染色。结果发现过表达ES2A的TCR α-/-小鼠与正常TCR α-/-小鼠相比组织病理学评分明显较低（3.5±0.4 vs 4.2±0.3）,而ES2A敲降的TCR α-/-小鼠与正常TCR α-/-小鼠相比病理学评分明显较高（5.7±0.6 vs 4.2±0.3）。由此可见,过表达ES2A抑制TCR α-/-小鼠自发性溃疡性结肠炎的病理学损伤。我们使用IL-6分别刺激小鼠胚胎肝细胞（BNLCL.2）和人肝癌细胞（Hep G2）,ELISA检测细胞上清中ES2A的表达,结果分别平均下降了 13.5%和28.4%,IL-6刺激小鼠时,血清和肝脏组织mRNA中ES2A的水平分别平均下降了 22.3%和 52.3%。上述结果表明,ES2A通过增加炎症部位Treg细胞和减少Th17细胞的比例抑制炎症,而炎症因子IL-6在炎症状态下调ES2A的表达而促进炎症发展,最终发展为溃疡性结肠炎。在另一项研究中,我

关键词：炎症性肠病溃疡性结肠炎 dss诱导的结肠炎 Treg细胞白细胞介素-6